2021-Promega萤光素酶技术讲座-萤光素酶报告基因检测实验操作篇

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Promega萤光素酶30周年庆技术讲座季萤光素酶报告基因技术使用操作详解篇
目录
1.萤光素酶的由来及作用机制解读
2.萤光素酶报告基因能用于哪些研究4.实验数据如何处理
3. 如何选择合适的检测方案
•选择报告基因类型
•
选择单报告基因或双报告基因
•选择载体类型•
选择内参
•选择转染方式•
选择检测试剂
•选择检测板•
选择检测仪
萤光素酶的由来
Luciferin 萤光素
•通常来说，能够加速自然发生的化学反应的生物分子被称作“酶”，科学家使用后缀“-ase ”作为此类蛋白质的通用命名法。

•
针对luciferase 这个分子来说，“lucere ”这个名字的拉丁词根意思为“发光”。

报告基因：基因表达变化或者与基因表达变化相关的细胞事件的一个指示剂。

通常是一种编码易被检测的蛋白质或酶的基因，其表达产物非常容易被鉴定。

萤光素酶：一类能够产生生物发光信号的酶的统称。

萤光素酶可以催化自身底物氧化，反应中一部分能量以光子形式被释放，即生物发光信号。

萤火虫
海肾
深海细脚刺虾
萤光素酶促进生物发光的机制
萤火虫萤光素酶促进生物发光产生的反应示意图
萤光素酶是一种作为化学反应催化剂的蛋白质，能在萤光素、ATP 和其它细胞离子存在的条件下促进光的产生。

化学反应本身包括两个步骤：
1.在萤光素酶存在的条件下，萤光素+ATP 生成萤光素化腺苷酸+ADP 。

2.将萤光素化腺苷酸+氧气转化为氧化萤光素+AMP 以及光。

以萤火虫萤光素酶的生物发光反应为例：
萤火虫
海肾
深海细脚刺虾
报告基因：基因表达变化或者与基因表达变化相关的细胞事件的一个指示剂。

通常是一种编码易被检测的蛋白质或酶的
基因，其表达产物非常容易被鉴定。

萤光素酶报告基因技术
通常检测基因表达是通过RT-qPCR （mRNA 水平）或Western Blot （蛋白水平）
引入报告基因，通过很容易被检测的报告基因的表达来判断启动子区域功能
萤光素酶作为报告基因的优点：✓没有内源性表达✓易于定量
✓高灵敏度、线性范围宽✓反应迅速
✓可实现双萤光素酶报告基因检测
Promoter Exon 123
45
Enhancer
Transcription start site (转录起始位点)
Enhancer Reporter Gene
Promoter
基因编码区
启动子区域
外显子
Transcription start site (转录起始位点)
报告基因编码区
萤光素酶报告基因的应用
•免疫学检测
•细胞信号通路分析•转录因子分析•蛋白-蛋白相互作用•
转录后修饰
•调控元件功能研究（启动子，增强子等）•病毒研究•细胞代谢研究•干细胞分化•小动物活体成像•siRNA/miRNA 研究•配基-受体相互作用•细胞健康研究•
激酶研究
•膜受体和细胞内受体激活/结合研究
查看更多应用请访问：https://wechat.promeg /luc30years/
NanoLuc ®萤光素酶技术，应用更广泛！
调控元件研究
Luciferase Promoter 转录调控-如：检测启动子活性
Promoter
转录后调控-如：剪接（Splicing ）Luciferase
Promoter Luciferase Promoter
Luciferase Test Sequence
转录后调控-如：检测蛋白稳定性
转录后/翻译调控-如：检测RNA 干扰(RNAi)
Translational fusion
Intron
Target Sequence
Protein of Interest
细胞学事件研究
◼膜受体和细胞内受体激活/信号传导
◼细胞信号通路分析
•GPCR 配基，激活剂，拮抗剂•
核受体研究
◼免疫应答
•定义信号通路•
蛋白：蛋白相互作用
Activator/Pathway
信号通路
Transcription Factor
转录因子
Binding Site 转录因子结合位点
INF-αSTAT1:STAT2Interferon Stimulated Response Element
(ISRE)
TGF-βSMAD3:SMAD4SMAD Binding Element (SBE)IL6STAT3:STAT3sis-Inducible Element (SIE)IL3
STAT5:STAT5
STAT5 Response Element
•TCR PD-1/PD-L1•
抗体药物等
细胞或动物成像
表达蛋白激酶C (PKC)-NanoLuc ®萤光素酶融合蛋白的HEK293 细胞在PMA 处理后，使用furmazine 底物20 分钟后进行检测。

Nano-Glo ®In Vivo Substrate, fluorofurimazine (FFz)专为在体内检测NanoLuc ®萤光素酶、NanoLuc ® 融合蛋白或重组NanoBiT ®萤光素酶而
设计。

更多信息可访问：https:///resources/technologies/nanoluc-luciferase-enzyme/bioluminescence-imaging/
实验设计
1.报告基因载体克隆
2.细胞转染&细胞培养
3. 检测发光信号
转染细胞
合适的细胞模型合适的转染方法
报告基因质粒克隆
选择合适的骨架载体克隆目的片段
设计实验方案
单报告基因或双报告基因稳定转染或瞬时转染
检测
检测板处理数据
细胞培养和处理
细胞活力细胞汇合度
对照组的设置
萤光素酶及其他报告基因实验本身性质决定其作为相对变化值，需要不同的实验组及对照组，通过组间的对比说明作用功能：
其他需要考虑的因素-双萤光素酶报告基因检测为例
几种报告基因的搭配选择:主报告基因/内参报告基因1.NanoLuc ®/Firefly
2.Firefly/NanoLuc ®
3.Firefly/Renilla
Promega 报告基因载体工具:
1.骨架载体：不带有任何应答元件，有
细胞内表达和分泌型表达可以选。

2.内参载体：带有组成型启动子3.预构建载体：已预构建所需调控元件
的载体
1
2报告基因载体克隆构建
质粒提取，细胞转染，孵育
检测信号
根据实验目的选择转染方法和转染试剂1.转染方法：瞬时转染或稳定转染2.转染试剂：转染效率高，毒性低3.稳转细胞：已稳定转染所需目的基因
或报告基因的细胞系
根据选择的报告基因选择检测试剂
1.Firefly 与NanoLuc ® 组合：•
NanoDLR TM （Cat.# N1610系列）
2.Firefly 与Renilla 组合：•非均质法：DLR TM （Cat.# E1910系列）•
均质法：Dual-Glo ®（Cat.# E2920系列）
选择发光检测仪器
•如选择非均质法检测试剂(DLR TM ) 就必须选择带有自动进样器的仪器。

•选择高灵敏度检测仪。

选择去除内毒素的质粒提取试剂盒1.内毒素会影响细胞转染效果
3
关键因素
报告基因载体
转染试剂
检测试剂
发光检测仪
主要特点
•载体骨架更加优化
•表达水平更高，背景更低
•精确快速的报告基因应答反应•多种载体可供选择
•低细胞毒性
•高效转染•操作简单
•信号稳定性
•信号灵敏度•信号半衰期•操作简单
•灵敏度高
•线性范围宽
相关产品
•pGL4（推荐）•
pNL 系列
•ViaFect TM •
FuGENE ®
单报告基因
双报告基因
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GloMax ®Detection System
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Nano-Glo ® Luciferase Assay System •Luciferase Assay System •
Bright Glo TM Luciferase Assay System •
ONE-Glo TM Luciferase Assay System •
Steady-Glo ® Luciferase Assay System
•
Dual-Luciferase ® Reporter (DLR TM ) Assay System •
Dual-Glo ®
Luciferase Assay System
•Nano-Glo ®Dual Luciferase ®Repor ter (NanoDLR TM ) Assay System
实验关键要素
1.载体构建
2.细胞转染
3.检测试剂
4.发光检测仪
如何选择合适的检测方案
0103
050607
选择报告基因种类
选择载体类型
选择单报告基因或双报告基因
08
0402•NanoLuc ®Luciferase •Firefly Luciferase •
Renilla Luciferase
•单报告基因•
双报告基因
•骨架载体•应答元件•融合载体•
内参载体
选择内参
•Renilla Luciferase •Firefly Luciferase •
NanoLuc ®Luciferase
选择转染方式
•稳定转染•
瞬时转染
选择检测试剂
选择检测板
选择检测仪
•全白色不透光•
白色侧壁透明底
•灵敏度•半衰期
•
终点法或活细胞实时检测
•单管发光检测仪•96孔板发光检测仪•
多功能微孔板检测仪
选择报告基因种类
报告基因NanoLuc ®Firefly Renilla 来源细角刺虾萤光素酶突变体
鞘翅目萤火虫
腔肠动物海肾
分子量19kD 61kD 36kD 蛋白表达细胞内或分泌型
细胞内细胞内颜色蓝色黄绿色蓝色底物Furimazine Luciferin coelenterazine
灵敏度+++++++++++++线性范围
1010
108
108
主要应用
萤光素酶应用，融合蛋白表达，BRET ，细胞信号通路分析经典萤光素酶应用，
细胞信号通路分析，调控元件功能型研究等
与Firefly 共同使用做为
内参报告基因01.
选择单报告基因或双报告基因
☐满足以下任意条件将需要进行双报告基因转染及检测，若均为否定答案则只需单报告基因转染及检测即可✓需进行瞬时转染
✓需使报告基因信号减弱，比如研究负调控对刺激产生的细胞反应。

✓需要共报告基因（co-reporter）以建立内对照或实现多重信号
✓实现最高的检测精度（板内或板间误差更小）
组合主报告基因(含推荐载体举例)内参报告基因(含推荐载体举例)检测试剂
Firefly/Renilla Firefly
pGL4.10[luc2] Vector Renilla
pGL4.74[hRluc/TK] Vector
pGL4.73[hRluc/SV40] Vector
pGL4.75[hRluc/CMV] Vector
DLR TM (Cat.# E1910系列)
Dual-Glo® (Cat.# E2920系列)
NanoLuc®/Firefly NanoLuc®
pNL1.1[Nluc] Vector Firefly
pGL4.53[luc2/PGK] Vector
pGL4.54[luc2/TK] Vector
pGL4.13[luc2/SV40] Vector
NanoDLR TM (Cat.# N1610系列)
Firefly/NanoLuc®Firefly
pGL4.10[luc2] Vector NanoLuc®
pNL1.1.PGK[Nluc/PGK] Vector
[Nluc/TK] Vector
NanoDLR TM (Cat.# N1610系列)
☐如需进行双报告基因转染及检测，可选择的载体组合如下所示：02.
选择报告基因载体类型
无启动子的报告基因载体报告基因融合载体对照内参载体
选择带有组成型表达启动
子的萤光素酶载体来作为
内参。

应答元件预构建载体
近百种预构建好各种信号通路
启动元件的即用型载体。

可直
接选购，无需自行构建。

用于产生转录融合以研究转
录/翻译后调控。

用于感兴趣的蛋白和报告基
因之间进行融合表达。

用于转录水平的分析(例如. 启动
子，启动子片段，信号转导研
究)，NanoLuc® 系列有细胞内表
达和分泌型两种可选。

1234
03.
选择内参
04.
1.同一代的不同内参载体之间，最主要的区别是携带的启动子
2.如果使用同一代载体产品，两者的表达效率相近，更容易调
整两种载体的共转染比例；
3.通常内参基因表达的活性应当显著的高于背景组，同时，尽
量小，确保不干扰主报告基因的表达。

启动子强弱对比图
方法灵活度稳定时间报告基因数量
底物试剂
瞬时转染高< 4days 2Dual Luciferase Reporter Assay 稳定转染
低
~ 50代
2or 1
Single Luciferase Reporter Assay
稳定转染（StableTransfection ）与单萤光素酶报告基因检测
选择转染方式
瞬时转染（Transient Transfection ）与双萤光素酶报告基因检测05.
选择检测试剂
单报告基因检测系统
双报告基因检测系统
Nano-Glo ®Dual-Luciferase ®Reporter Assay System （NanoDLR ）Dual-Luciferase ®Reporter Assay System （DLR ）Dual-Glo ®Luciferase Assay System
NanoLuc ®&Firefly ，均质型检测，信号半衰期长
Firefly &Renilla ，非均质型检测，灵敏度高Firefly&Renilla ，均质型检测，信号半衰期长终点法检测：Nano-Glo ®Luciferase Assay System NanoLuc ®萤光素酶：均质型检测，信号
活细胞检测：Nano-Glo ®Live Cell Assay System 胶内检测：Nano-Glo ®In-Gel Detection System Firefly 萤光素酶：Luciferase Assay System
Bright-Glo ®Luciferase Assay System ONE-Glo TM Luciferase Assay System Renilla 萤光素酶：
Renilla Luciferase Assay System
归一化实验结果，实现最高的检测精度！
更多信息请访问：https:///luc30years/index.html
06.
选择检测板
•全透明板（Clear plates ）——X
•全白色不透光平板（White Plates, Solid Bottom ）•白色侧壁透明底的平板（White Plates, Clear Bottom ）•全黑色不透光平板（Black Plates, Solid Bottom ）——不推荐•
黑色侧壁透明底的平板（Black Plates, Clear Bottom ）——
不推荐
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07.
选择检测仪
基于萤光素酶反应原理的检测系统，需要使用发光检测仪（Luminometer ），或者带有发光检测模块的
多功能微孔板检测仪。

不同的仪器灵敏度和信号相互干扰程度，差异较大。

08.
✓大多数真核生物不发光，来自样品自身的背景光非常低。

不需要滤除来自样品的任何光。

✓萤光素酶反应的发光光谱通常都相当宽，在许多波长下都有发光。

✓只选择在最大波长处检测发光，过滤掉其他发光信号，意味着检测会丢掉很多信号，丢失灵敏度。

✓大多数发光检测仪器会在检测发光反应时收集整个可见光谱（大约为380–780 nm ）中的所有光。

这可以确保在检测背景值低的同时有非常好的灵敏度。

☐在进行萤光素酶报告基因检测时，无需设置波长
：
选择检测仪--仪器设置
08.
✓初始细胞数（移液不准；忘记混匀；培养板问题造成的贴壁不均匀等）✓转染效率（操作问题；细胞密度不均等）
✓最终检测的细胞数
（细胞毒性处理因素造成整体活力改变；操作导致细胞丢失；裂解不充分等）
✓检测方法（检测温度、时间等）
影响结果的因素
基于细胞的报告基因实验中可能影响结果的非实验因素有：
数据处理方法
➢相对光强度
RLU = relative light units ➢背景值的扣除
Background Subtraction ➢归一化处理：
Normalization Methods
➢主报告基因与内参基因的相对活性比值
Ratio of Experimental/Control Reporter Activity
基本概念：
归一化方法
1020304050607080Construct A
Construct B construct C
Normalized Fold change
Normalized Fold change
常用的归一化方法：
➢细胞总蛋白
➢细胞活力➢细胞数➢内参报告基因
稳定转染的单报告基因细胞系
瞬时转染实验
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Promega公司介绍
•1978创建
•全球16家分公司，近1,700名雇员•ISO 13485 认证
•拥有640项专利
•在美国，韩国和中国有生产基地•为生命科学和应用科学研究提供超过4,000种产品
Promega 在中国
Promega BioSystems Seoul, Korea
普洛麦格(北京)生物技术有限公司Shanghai Promega China
Promega BioSystems Sunnyvale
，California
Promega BioSciences San Luis Obispo, California
1978
1985
1988
2005
Promega 进入中国第一个合资企业（华美）
Promega 成立
Promega 中国代表处成立
Promega 中国分公司成立
2018
2021
Promega 成立
40周年
Promega 萤光素酶技术诞生30周年庆
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Proprietary Information. Not for further distribution.。