南美白对虾病原性豚鼠气单胞菌的分离与药敏特性
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研究与综述
doi:10.3969/j.issn.1004-2091.2020.01.006
《水产养殖》2020 年第 1 期
南美白对虾病原性豚鼠气单胞菌的分离与药敏特性
曾宪凯 1，曹海鹏 2，穆春华 2
（1.上海市青浦区练塘镇农业综合服务中心，上海鹏豪水产专业合作社，上海 201715； 2.上海海洋大学农业部淡水水产种质资源重点实验室，上海市水产养殖工程技术研究中心，上海高校知识服务平台上海海洋大
学水产动物遗传育种中心（ZF1206），上海 201306）
摘要：为查明引起上海青浦地区养殖南美白对虾黄腿病的病原菌，提供养殖户防控该病的有效药物，采用传统方法从患黄 腿病的南美白对虾肝胰腺组织中进行了病原菌的分离，通过人工回归感染试验确定了病原菌株，采用 API ID32GN 生理生化鉴 定和 16S rRNA 序列分析对病原菌株进行鉴定，通过纸片扩散法分析病原菌株的药敏特性。结果表明，从病虾的肝胰腺中分离 到一株病原菌（QPX1），经生理生化特性与 16S rRNA 序列分析确定其为豚鼠气单胞菌（A eromonas caviae）。此外，菌株 QPX1 对 阿莫西林、多粘菌素 B、磺胺异噁唑、复方新诺明、卡那霉素、吡哌酸、新霉素、庆大霉素、氟苯尼考、链霉素、恩诺沙星、诺氟沙星、 奈替米星等抗生素高度敏感。本研究证实豚鼠气单胞菌是南美白对虾黄腿病的病原菌，生产上可选用新霉素、氟苯尼考、恩诺 沙星等常规水产用抗生素作为该病的防控用药。
表 1 分离菌株对南美白对虾人工回归感染试验结果
株进行 PCR 扩增与测序后，采用邻接法构建系统发 育树，通过 16S rRNA 序列分析对病原菌株进行分 子鉴定。 1.2.4 病原菌药敏特性的测定 参照纸片扩散法[7]测 定病原菌株的药敏特性，并根据杭州滨河微生物试 剂有限公司的《纸片法药敏试验抑菌圈直径判断标 准》，判定病原菌株对抗生素的敏感性。
关键词：豚鼠气单胞菌；黄腿病；南美白对虾；药敏特性 中图分类号：S945 文献标志码：A 文章编号：1004-2091(2020)01-0028-06
南美白对虾（Penaeus vannamei）是我国重要特 种水产养殖品种，在浙江、广西、海南、福建、山东、 珠三角、长三角、京津唐等地区大面积养殖[1]，是我 国养殖产量最高的对虾养殖品种。2017 年，我国南 美白对虾养殖产量高达 160 多万吨[2]。然而，细菌性 病害对南美白对虾养殖产生了严重危害，其病原菌 种类广、繁殖速度快、致病力强、发病率高，通常引 起南美白对虾内脏组织出现不同程度损伤而使其 大规模死亡。其中，以“附肢或游泳足变黄”为典型 病症的黄腿病是南美白对虾养殖过程中的常见病 之一[3-4]，但从现有文献资料来看，南美白对虾黄腿 病的研究基础薄弱，鲜见南美白对虾黄腿病病原菌 豚鼠气单胞菌及其防控药物等方面的详细研究报 道，这在一定程度上影响了我国对南美白对虾黄腿 病的有效防控。因此，加强黄腿病研究对促进南美 白对虾养殖业健康发展具有重要意义。2018 年 7 月，上海市青浦区一养殖场的南美白对虾出现了黄
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《水产养殖》2020 年第 1 期
研பைடு நூலகம்与综述
普通营养琼脂平板进行病原菌的分离，30 益恒温培 养 24~32 h 后纯化分离菌株，并转接至普通营养琼 脂斜面培养基上于 30 益恒温培养 32 h，4 益冰箱保 存备用。 1.2.2 分离菌株的人工回归感染试验 试验包括3 个试验组和 1 个对照组，每组各 15 尾健康南美白对 虾。试验前用无菌生理盐水分别洗下普通营养琼脂 斜面培养基上各分离菌株的菌苔制成菌浓度为 1.0伊106 CFU/mL 的菌悬液。试验组南美白对虾分别在 靠近尾扇第 3 腹节处[5]注射浓度为 1.0伊106 CFU/mL 的分离菌株菌悬液，每尾注射 0.1 mL；对照组注射 相同剂量的无菌生理盐水。试验周期为 6 d，试验期 间水温控制在 28 益，每天记录试验南美白对虾的 死亡数量，观察其病症，并将死虾及时捞出进行病 原菌的再分离，确定其与原病原菌株的一致性。 1.2.3 病原菌的鉴定 参照曹海鹏等[6]的方法，用 API ID32GN 细菌鉴定系统对病原菌株进行生理生 化鉴定，并委托上海某生物科技有限公司对病原菌
腿病，病死率达到了 60%以上，在上海南美白对虾 养殖区发生实为罕见。鉴此，该试验通过对南美白 对虾黄腿病病原菌的分离鉴定与药敏特性研究，以 期为确定南美白对虾黄腿病的病因与药物防控提 供理论资料。
1 材料与方法
1.1 材料 自然发病南美白对虾，16 尾，平均体质量5.12 g，
取自上海市青浦区自然发病养殖池；健康南美白对 虾，60 尾，大小均匀，体质健壮，平均体质量 8.72 g， 由浙江萧山某养殖场提供；API ID32GN 细菌生化 鉴定试剂条，由法国某公司生产；药敏纸片，由杭州 某微生物试剂有限公司生产。 1.2 方法 1.2.1 病原菌的分离 采用 75%酒精对具有典型 发病症状的濒死南美白对虾进行表面消毒后，参照 Cao 等[4]的方法常规无菌操作取其肝胰腺组织，划线
资助项目：上海市青浦区科技发展基金项目（青科发 2018-11）；江苏省海洋与渔业科技创新与推广项目（Y2017-6） 作者简介：曾宪凯（1977—），男，学士，水产养殖工程师，主要从事水产生态养殖技术试验、研究与推广工作 通信作者：曹海鹏（1981—），男，博士，副教授；主要从事水产动物病害防治研究. E-mail：hpcao@
2 结果
2.1 病原菌的分离 从自然发病的南美白对虾的肝胰腺组织中分
离到 3 株疑似病原菌株，暂命名为 QPX1、QPX2、 QPX3。人工回归感染试验结果（表 1）表明，仅菌株 QPX1 感染南美白对虾后南美白对虾出现了死亡， 试验南美白对虾的病死率达到了 100%，而且试验 南美白对虾的病症与自然病症基本相同，并从人工 感染的病虾肝胰腺中又可再次分离到与原菌株生 理生化特性一致的菌株，由此判定菌株 QPX1 是引 起该病的病原菌。
doi:10.3969/j.issn.1004-2091.2020.01.006
《水产养殖》2020 年第 1 期
南美白对虾病原性豚鼠气单胞菌的分离与药敏特性
曾宪凯 1，曹海鹏 2，穆春华 2
（1.上海市青浦区练塘镇农业综合服务中心，上海鹏豪水产专业合作社，上海 201715； 2.上海海洋大学农业部淡水水产种质资源重点实验室，上海市水产养殖工程技术研究中心，上海高校知识服务平台上海海洋大
学水产动物遗传育种中心（ZF1206），上海 201306）
摘要：为查明引起上海青浦地区养殖南美白对虾黄腿病的病原菌，提供养殖户防控该病的有效药物，采用传统方法从患黄 腿病的南美白对虾肝胰腺组织中进行了病原菌的分离，通过人工回归感染试验确定了病原菌株，采用 API ID32GN 生理生化鉴 定和 16S rRNA 序列分析对病原菌株进行鉴定，通过纸片扩散法分析病原菌株的药敏特性。结果表明，从病虾的肝胰腺中分离 到一株病原菌（QPX1），经生理生化特性与 16S rRNA 序列分析确定其为豚鼠气单胞菌（A eromonas caviae）。此外，菌株 QPX1 对 阿莫西林、多粘菌素 B、磺胺异噁唑、复方新诺明、卡那霉素、吡哌酸、新霉素、庆大霉素、氟苯尼考、链霉素、恩诺沙星、诺氟沙星、 奈替米星等抗生素高度敏感。本研究证实豚鼠气单胞菌是南美白对虾黄腿病的病原菌，生产上可选用新霉素、氟苯尼考、恩诺 沙星等常规水产用抗生素作为该病的防控用药。
表 1 分离菌株对南美白对虾人工回归感染试验结果
株进行 PCR 扩增与测序后，采用邻接法构建系统发 育树，通过 16S rRNA 序列分析对病原菌株进行分 子鉴定。 1.2.4 病原菌药敏特性的测定 参照纸片扩散法[7]测 定病原菌株的药敏特性，并根据杭州滨河微生物试 剂有限公司的《纸片法药敏试验抑菌圈直径判断标 准》，判定病原菌株对抗生素的敏感性。
关键词：豚鼠气单胞菌；黄腿病；南美白对虾；药敏特性 中图分类号：S945 文献标志码：A 文章编号：1004-2091(2020)01-0028-06
南美白对虾（Penaeus vannamei）是我国重要特 种水产养殖品种，在浙江、广西、海南、福建、山东、 珠三角、长三角、京津唐等地区大面积养殖[1]，是我 国养殖产量最高的对虾养殖品种。2017 年，我国南 美白对虾养殖产量高达 160 多万吨[2]。然而，细菌性 病害对南美白对虾养殖产生了严重危害，其病原菌 种类广、繁殖速度快、致病力强、发病率高，通常引 起南美白对虾内脏组织出现不同程度损伤而使其 大规模死亡。其中，以“附肢或游泳足变黄”为典型 病症的黄腿病是南美白对虾养殖过程中的常见病 之一[3-4]，但从现有文献资料来看，南美白对虾黄腿 病的研究基础薄弱，鲜见南美白对虾黄腿病病原菌 豚鼠气单胞菌及其防控药物等方面的详细研究报 道，这在一定程度上影响了我国对南美白对虾黄腿 病的有效防控。因此，加强黄腿病研究对促进南美 白对虾养殖业健康发展具有重要意义。2018 年 7 月，上海市青浦区一养殖场的南美白对虾出现了黄
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《水产养殖》2020 年第 1 期
研பைடு நூலகம்与综述
普通营养琼脂平板进行病原菌的分离，30 益恒温培 养 24~32 h 后纯化分离菌株，并转接至普通营养琼 脂斜面培养基上于 30 益恒温培养 32 h，4 益冰箱保 存备用。 1.2.2 分离菌株的人工回归感染试验 试验包括3 个试验组和 1 个对照组，每组各 15 尾健康南美白对 虾。试验前用无菌生理盐水分别洗下普通营养琼脂 斜面培养基上各分离菌株的菌苔制成菌浓度为 1.0伊106 CFU/mL 的菌悬液。试验组南美白对虾分别在 靠近尾扇第 3 腹节处[5]注射浓度为 1.0伊106 CFU/mL 的分离菌株菌悬液，每尾注射 0.1 mL；对照组注射 相同剂量的无菌生理盐水。试验周期为 6 d，试验期 间水温控制在 28 益，每天记录试验南美白对虾的 死亡数量，观察其病症，并将死虾及时捞出进行病 原菌的再分离，确定其与原病原菌株的一致性。 1.2.3 病原菌的鉴定 参照曹海鹏等[6]的方法，用 API ID32GN 细菌鉴定系统对病原菌株进行生理生 化鉴定，并委托上海某生物科技有限公司对病原菌
腿病，病死率达到了 60%以上，在上海南美白对虾 养殖区发生实为罕见。鉴此，该试验通过对南美白 对虾黄腿病病原菌的分离鉴定与药敏特性研究，以 期为确定南美白对虾黄腿病的病因与药物防控提 供理论资料。
1 材料与方法
1.1 材料 自然发病南美白对虾，16 尾，平均体质量5.12 g，
取自上海市青浦区自然发病养殖池；健康南美白对 虾，60 尾，大小均匀，体质健壮，平均体质量 8.72 g， 由浙江萧山某养殖场提供；API ID32GN 细菌生化 鉴定试剂条，由法国某公司生产；药敏纸片，由杭州 某微生物试剂有限公司生产。 1.2 方法 1.2.1 病原菌的分离 采用 75%酒精对具有典型 发病症状的濒死南美白对虾进行表面消毒后，参照 Cao 等[4]的方法常规无菌操作取其肝胰腺组织，划线
资助项目：上海市青浦区科技发展基金项目（青科发 2018-11）；江苏省海洋与渔业科技创新与推广项目（Y2017-6） 作者简介：曾宪凯（1977—），男，学士，水产养殖工程师，主要从事水产生态养殖技术试验、研究与推广工作 通信作者：曹海鹏（1981—），男，博士，副教授；主要从事水产动物病害防治研究. E-mail：hpcao@
2 结果
2.1 病原菌的分离 从自然发病的南美白对虾的肝胰腺组织中分
离到 3 株疑似病原菌株，暂命名为 QPX1、QPX2、 QPX3。人工回归感染试验结果（表 1）表明，仅菌株 QPX1 感染南美白对虾后南美白对虾出现了死亡， 试验南美白对虾的病死率达到了 100%，而且试验 南美白对虾的病症与自然病症基本相同，并从人工 感染的病虾肝胰腺中又可再次分离到与原菌株生 理生化特性一致的菌株，由此判定菌株 QPX1 是引 起该病的病原菌。