氯喹抑制体外培养星形胶质细胞的激活

氯喹抑制体外培养星形胶质细胞的激活
荆丽丽;吴淑华
【摘要】目的研究氯喹对体外培养大鼠海马星形胶质细胞激活的抑制作用,为癫痫的治疗提供实验依据.方法分离新生SD大鼠海马,体外培养星形胶质细胞,经纯化鉴定后分为:对照组、戊四氮(PTZ)组、氯喹干预组(25、50和75 mg/L),经相应处理后,分别用MTT法、免疫荧光、Western blot测定星形胶质细胞数量及活性、星形胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及CyclinD1的表达量.结果与对照组比较,PTZ可激活星形胶质细胞的增殖,使GFAP、CyclinD1的表达量增加(P＜0.05);与PTZ组比较,氯喹阻滞了PTZ激活的星形胶质细胞的增殖(P＜0.05);氯喹可抑制PTZ激活星形胶质细胞异常增加的GFAP的表达;氯喹可抑制PTZ激活星形胶质细胞的CyclinD1的表达量(P＜0.05);与对照组相比,3种结果均显示75 mg/L氯喹对体外培养星形胶质细胞激活的抑制作用较强,并可维持其在正常范围.结论氯喹具有抑制PTZ激活体外培养星形胶质细胞的作用,其可能通过抑制星形胶质细胞的增殖来发挥抗癫痫作用.%Objective To investigate the effects of Chliroquine on Pentylenetetrazole(PTZ)- activated hippocampal astrocytes of rats. Methods eonatal rat (24h) hippocampal astrocytes were obtained and divided into control group, PTZ-activated group and Chliroquine groups with Chliroquine treatment at 25, 50, 75 mg/L. The cell proliferation , expression of glial fibrillary acidic protein ( GFAP) and CyclinDl after the treatments were detected with MTT assay, immunofluorescence cytochemistry and western blot respectively. Results N Results In comparison with control group, PTZ could induce the activation of astrocytes and increase the expressions of GFAP and CyclinDl (P<0. 05) , In
comparison with PTZ-activation group, Chliroquine treatment resulted in significant inhibition of the cell proliferation, GFAP and CyclinDl in the PTZ-activated astrocytes ( P < 0. 05 ). Chliroquine at 75 mg/L showed the strongest inhibitory effects against astrocyte activation while maintained nearly normal level of astrocyte activation in comparison with the control group. Conclusions Chliroquine could inhibit PTZ-induced activation of astrocytes, suggesting that chliroquine may function as potential medicine for epilepsy.
【期刊名称】《基础医学与临床》
【年(卷),期】2011(031)010
【总页数】5页(P1110-1114)
【关键词】星形胶质细胞;癫痫;戊四氮;氯喹
【作者】荆丽丽;吴淑华
【作者单位】滨州医学院病理学教研室,山东烟台264003;滨州医学院病理学教研室,山东烟台264003
【正文语种】中文
【中图分类】R36
癫痫的发病与胶质细胞有关，尤其是星形胶质细胞（astrocyte，Ast）在癫痫的发生中具有重要的作用，表现为细胞数目增多，体积增大、其特异性蛋白胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）表达明显增加［1－3］。

激活的
胶质细胞可导致神经元的长期机能障碍，从而促使癫痫的发作。

氯喹为一种传统的抗疟疾药。

前期的研究证实［3－5］，氯喹可抑制戊四氮（pentylenetetrazole，PTZ）诱导的大鼠痫样发作，但是目前尚无从细胞水平研究来揭示氯喹的抗癫痫机制。

本实验通过研究氯喹对体外培养大鼠海马星形胶质细胞激活的抑制作用来探讨氯喹可能的抗癫痫机制。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物:清洁级24 h SD大鼠20只，体质量2～5 g，雌雄不限。

［山东烟台
绿叶制药有限公司，合格证号:SCXK（鲁）20030008］。

1.1.2 试剂:氯喹、戊四氮和hoechest33342（Sigma公司）;噻唑蓝（MTT）和
二甲基亚砜（DMSO）（Amresco公司）;兔抗-GFAP和兔抗-CyclinD1（Santa Cruz公司）;FITC标记的羊抗兔IgG（H+L）、HRP标记的羊抗兔IgG（H+L）
和羊血清（北京中杉公司）。

1.2 方法
1.2.1 Ast的体外培养与鉴定:断颈处死乳鼠后浸泡于75%乙醇5 min消毒。

分离
海马，体式显微镜下剥离被膜，剪碎、离心，按106/cm2接种于25 cm2细胞培养瓶，于37℃，5%CO2培养箱中进行培养，待细胞长满瓶底90%左右进行传代，获得的Ast进一步经免疫荧光鉴定，鉴定后分组培养，相应处理［6］。

1.2.2 氯喹对PTZ激活体外培养大鼠海马Ast活性的影响:运用MTT比色法检测
各组Ast的活细胞数量。

将传代细胞按8×104个/cm2的密度接种于96孔板，
每孔100 μL。

含10%胎牛血清培养基培养24 h后，用5%胎牛血清培养基配制
药物干预组:a为正常组，b为PTZ激活组（10 mmol/L），c为PTZ+氯喹低剂量组（10 mmol/L和25 mg/L），d为PTZ+氯喹中剂量组（10 mmol/L和50
mg/L），e为PTZ+氯喹高剂量组（10 mmol/L和75 mg/L）。

每组6个复孔，
每孔加入100 μL含药培养基继续培养24 h后，弃培养基，D-Hanks洗2遍，加入含MTT 20 μL的培养基，37℃孵育4 h，吸净上清液，加入DMSO 150 μL，
于电动摇床摇动10 min左右，待结晶物充分溶解后，于酶标仪上测A值，测定波长492 nm，以A值反映各组Ast活细胞的数量。

1.2.3 氯喹对体外培养PTZ激活大鼠海马Ast GFAP表达的影响:运用免疫荧光法
检测各组Ast GFAP的表达。

传代细胞进行爬片，37℃，5%CO2培养箱孵育24 h，用5%胎牛血清培养基配制药物，分组。

作用24 h后，弃培养基，多聚甲醛固定4 h，0.2%曲拉通破膜15 min，羊血清37℃封闭30 min，兔抗-GFAP 4℃孵
育过夜，FITC标记的羊抗兔IgG（H+L）37℃孵育30 min，hoechest33342染
核10 min（避光）。

以上各步骤之间用0.01 mol/L PBS充分洗涤。

甘油封片，
荧光倒置显微镜观察照相。

于病理图像分析系统分析吸光度值，以积分吸光度值（IA）反映各组细胞的情况。

1.2.4 氯喹对体外培养PTZ激活大鼠海马AstCyclinD1表达的影响:运用Western blot法检测各组AstCyclinD1的表达量。

将传代细胞以5×105个/cm2的密度种植于24孔板中，含10%胎牛血清培养基培养24 h后，用5%胎牛血清培养基配
制药物，分组。

作用24 h后，弃去含药培养基，以预冷PBS清洗，加入细胞裂解液（含PMSF）于冰上裂解，30 min后将裂解液吸出装入 EP管，以4℃、12 000 r/min离心5 min，将上清吸出，分装于EP管内，－20℃保存。

用BCA法
绘制标准蛋白曲线，求出各样品蛋白浓度，确定含20 μg蛋白的上样体积。

将变
性后的样品上样，并加入预染Marker，确定所需蛋白 CyclinD1及内参β-actin
的条带位置。

电泳（浓缩胶80 V，分离胶110 V），电泳完毕后根据预染Marker提示的位置将2条蛋白带分别切下，湿转转印槽转膜（100 V，70 min），37℃封闭2 h，然后分别加入兔抗CyclinD1及β-actin 4℃孵育过夜，二抗37℃
孵育1 h，ECL曝光，分别分析吸光度值。

以CyclinD1及β-actin吸光度值之比
来比较CyclinD1蛋白表达量。

1.3 统计学分析
计量数据以均数±标准差（±s）表示，应用SPSS13.0统计软件进行处理，多组计量资料组间差异比较采用单因素方差分析，组间比较用LSD法。

2 结果
2.1 Ast的培养及鉴定
原代培养的大鼠海马Ast，倒置显微镜下可见细胞生长较好，贴壁良好，胞突明显，细胞向外伸出长短不一的突起，胞质丰富，其中可见清晰的卵圆形细胞核。

原代培养的细胞经免疫荧光鉴定，GFAP免疫反应阳性率达90%以上（图1）。

图1 GFAP免疫荧光染色激光共聚焦图片Fig 1 GFAP immunofluorescence staining cell picture by confocal microscope（bar=10 μm）
2.2 氯喹对PTZ激活体外培养大鼠海马Ast活性的影响
PTZ可以显著激活体外培养的Ast，氯喹对PTZ激活的细胞活性具有显著的抑制
作用，以75 mg/L浓度的氯喹抑制效果最好（表1）。

表1 氯喹对PTZ激活大鼠海马Ast活性的影响Table 1 Effect of Chliroquine
on the activity of rat hippocampal astrocytes in vitro（±s，n=6）＊P ＜
0.05 compared with control;▲P ＜0.05 compared with PTZ group.group A value contral 0.150+0.019▲PTZ 0.299+0.027*PTZ+Chl（25 mg/L）
0.244+0.023＊▲PTZ+Chl（50 mg/L） 0.186+0.106＊▲PTZ+Chl（75 mg/L）0.170+0.088▲
2.3 氯喹对体外培养PTZ激活大鼠海马Ast GFAP表达的影响
在各组体外培养的大鼠海马Ast，GFAP在PTZ组表达较氯喹干预组和对照组强（图2、3，表2）。

图2 GFAP免疫荧光染色细胞图片Fig 2 Immunofluorescence staining cell
pictures of GFAP（Bar=50 μm）A.control group;B.PTZ
group;C.PTZ+Chliroquine（25 mg/L）group;D.PTZ+Chliroquine（50 mg/L）group;E.PTZ+Chliroquine（75 mg/L）group
图3 GFAP免疫荧光hoechest33342复染Fig 3 Immunofluorescence stained pictures of GFAP by hoechest33342（bar=50 μm）A.control group;B.PTZ group;C.PTZ+Chliroquine（25 mg/L）
group;D.PTZ+Chliroquine（50 mg/L）group;E.PTZ+Chliroquine（75 mg/L）group
表2 氯喹对PTZ激活大鼠海马Ast GFAP表达的影响Table 2 Effect of Chliroquine on the GFAP of PTZ-activited rat hippocampal astrocytes（±s，n=6）＊P ＜0.05 compared with control;▲P ＜0.05 compared with PTZ group.group IA value co ntral 14 4641+31 056▲PTZ 38 8511+31
679*PTZ+Chl（25 mg/L） 243 369+37 678＊▲PTZ+Chl（50 mg/L） 168 880+15 915▲PTZ+Chl（75 mg/L）139 295+19 822▲
2.4 氯喹对体外培养PTZ激活大鼠海马Ast CyclinD1表达的影响
PTZ可显著激活大鼠海马Ast，使CyclinD1过度表达。

而氯喹对PTZ激活的Ast 具有抑制作用（图 4，表3）。

图4 CyclinD1的Western blot检测结果Fig 4 Western blot analysis of CyclinD1 expressionN.control group;P.PTZ group;C1.PTZ+Chliroquine（25 mg/L）group;C2.PTZ+Chliroquine（50 mg/L）group;C3.PTZ+Chliroquine （75 mg/L）group
3 讨论
Ast是中枢神经系统重要的胶质细胞，随着研究的深入，Ast的作用越来越受到广大学者的关注，其广泛参与中枢神经系统疾病损伤的过程，大量研究表明，Ast与
癫痫的发生密切相关［7－8］。

表3 氯喹对PTZ激活大鼠海马AstCyclinD1表达的影响Table 3 Effect of Chliroquine on the CyclinD1 of PTZ-activited rat hippocampal astrocytes （±s，n=6）＊P ＜0.05 compared with control;▲P ＜0.05 compared with PTZ group.group cyclinD1/β-actin contr al 1.347+0.007▲PTZ
1.975+0.003*PTZ+Chl（25 mg/L） 1.764+0.008＊▲PTZ+Chl（50 mg/L）1.554+0.050＊▲PTZ+Chl（75 mg/L）1.257+0.032▲
氯喹作为传统的抗疟疾药，用于治疗疟疾。

在传统治疗的基础上，氯喹作为辅助药物治疗1组星形胶质母细胞瘤的病例，结果实验组的存活时间较对照组延长1倍，表明氯喹对星形胶质母细胞瘤细胞的增殖具有明显的抑制作用［9］。

有研究证实［10］，氯喹可与培养的成纤维细胞的DNA双螺旋结合形成复合物，从而影响其增殖，而成纤维细胞与Ast在脑内的特性类似，如损伤后的修复等。

通过前期动
物实验研究发现［3］，氯喹对Ast特异性蛋白GFAP、PCNA的表达有抑制作用，抑制了大脑皮质和海马区的Ast增殖活性，从而减轻了痫样发作的程度和抑制痫
样放电的作用。

通过对离子型NMDAR的研究表明［4］，氯喹可干预Glu-NMDAR信号传导通路的激活，从而影响癫痫的发生和发展。

同时，氯喹对IL-1β，TNF-α 等一些细胞因子也具有抑制作用［5］。

氯喹的这一作用可能在防治癫痫的发生和发展方面具有重要意义。

实验结果表明，PTZ可以激活体外培养的Ast，提高细胞活性，促进细胞增殖，使GFAP、CyclinD1表达增加。

而氯喹可以抑制PTZ对Ast的激活作用，并且随着
氯喹浓度的增加，抑制作用也随之增强。

25、50和75 mg/L抑制作用逐渐增强，其中75 mg/L可将Ast的活性和GFAP的表达维持在正常范围内，推测氯喹的抗癫痫机制可能在于抑制了PTZ对Ast的异常激活而影响神经元兴奋传递。

基于上述实验结果并结合文献分析，推测氯喹可抑制Ast的异常激活。

氯喹的这
种作用机制可能在癫痫的防治方面具有重要的意义，但是更进一步的机制有待于深入研究。

参考文献:
［1］Avola R，Di Tullio MA，Fisichella A，et al.Glial fibrillary acidic protein and vimentin expression is regulated by glucocorticoids and neurotrophic factors in primary rat astroglial cultures［J］.Clin Exp Hypertens，2004，26:323 －333.
［2］Pekny M，Nilsson M.Astrocyte activation and reactive gliosis
［J］.Glia，2005，50:427 －434.
［3］Zhang S，Zhu C，Liu Q，et al.Effects of chloroquine on GFAP，PCNA and cyclinD1 in hippocampus and cerebral cortex of rats with seizures induced by pentylenetetrazole［J］.Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2005，25:625－628.
［4］张树华，朱长庚，刘庆莹，等.氯喹对戊四氮致痫大鼠皮质和海马谷氨酸和NMDAR1表达的影响［J］.中国组织化学与细胞化学杂志，2006，15:18－23. ［5］张树华，朱长庚，刘庆莹，等.氯喹对戊四氮致痫大鼠皮质和海马白细胞介素1β及肿瘤坏死因子α表达的影响［J］.中国组织化学与细胞化学杂志，2005，14:491－495.
［6］谢裕华，易春智，项晓伟，等。

新生大鼠大脑皮质星形胶质细胞的体外培养［J］.广州中医药大学学报，2009，26:277－280.
［7］Jabs R，Seifert G，Steinhauser C.Astrocytic function and its alteration in the epileptic brain［J］.Epilepsia，2008，49:3－15.
［8］Vessal M，Dugani CB，Solomon DA，et al.Might astrocytes play a role in maintaining the seizure-prone state?［J］.Brain Res，2005，
1044:190 －203.
［9］Bricen E，Calderon A，Sotelo J.et al.Institutional experience with chloroquine as an adjuvant to the therapy for glioblastoma multiforme ［J］.Surg Neurol，2007，67:388 －391.
［10］Cohen SN，Yielding KL.Inhibition of DNA and RNA polymererase reactions by chloroquine ［J］.Biochemistry，1965，54:521－524.。