PCR 标记

1、常用的放射性核素
1） 32P：产生射线，灵敏度高，分辨率强，是最 常用的放射性标记物，但半衰期短（14。3天）： 位和位标记。 2） 35S：分辨率高、半衰期长（87。1天）。敏感 度底 O(S) O(S) O(S)


OH- P-O-P-O-P-O-CH2 O O O
O H H(OH)
实时荧光定量PCR原理

所谓实时荧光定量PCR技术，是 指在PCR反应体系中加入荧光基团， 利用荧光信号积累实时监测整个 PCR进程，最后通过标准曲线对未 知模板进行定量分析的方法。

（一）缺口翻译法或切口平移 （nick translation）
5‘
3‘
5’ 5’-3外切酶和5’-3 内切酶 3’ 5’
3‘
限量DNA酶I 5‘
DNA聚合酶I+ 32P-dNTP
5’ 3’
变性
32P部分标记的
单连DNA片段
缺口翻译法的原理
限量DNase I在待标记的双连DNA的每一 条连上产生若干个单连缺口 利用E.coli DNA多聚酶I的5’-3’外切酶的 活性和5‘-3’多聚酶的活性，在缺口处5’末 端每切除一个核苷酸，则在3’末端添加 一个核苷酸，以修补缺口。 随着缺口在5’末端的移动修饰的核苷酸 就掺入到新合成的DNA连中

二、反转录PCR
（Reverse transcription PCR ，RT-PCT)
反转录PCR： mRNA---cDNA------PCR 抽提RNA 反转录合成cDNA PCR 扩增

mRNA 反转录酶+dNTP
AAAAAAA-3’ AAAAAAA-3’ cDNA TTTTTTT-5’
硷基
2、放射性标记物的优缺点
优点：灵敏度高：0。01pg 特异性强 缺点：放射性污染 成本高、半衰期短，不能长期保存

二）非放射性标记物

1、优缺点 优点：无放射性污染 成本低、操作简单 缺点：敏感性、特异性均低于放射性核 素
2、常用的标记物


1）生物素：1-2pg 生物素化核苷酸：bio-16-dUTP bio-11-dUTP 生物素化核苷酸----通过酶触反应掺入到DNA 中去制成探针----杂交----抗生物素蛋白-生物素酶的复合物—加底物—显色 光敏生物素：生物素与光敏基团结合----光敏生 物素-----光敏生物素与核酸探针混合----在强光 的作用下----光敏基团与核酸共价结合---生物素 标记的 探针

缺口翻译法的特点

1）快速、简便、标记的探针均一、特异 性高 2）仅适用于较长的双连DNA 3）DNA多聚酶必须是E。Coli DNA多聚 酶的全酶 4）DNA酶I的浓度一定要适宜
（二）随机引物法（random priming )
随机寡核苷酸引物（random primer)： 含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段 的混合物，可以与任意核苷酸序列杂交， 起到聚合酶反应引物的作用 E。coli DNA聚合酶I的Klenow大片段 （仅具有5-3多聚酶的活性，而无外切酶 的活性）
PCR引物的设计



１、上游引物与目的DNA５’端序列完全相同； 下游引物与目的DNA３’端序列互补 ２、引物长度以15-30个碱基为益； G+C含量为45-55％ ３、避免引物内形成二级结构 ４、两引物间不应发生互补，特别是在３’端， 避免形成引物二聚体 ５、合成的引物应进行纯化 ６、引物的浓度不要太高: 0.1-0.5 mol/L
生物素化的核苷酸和 光敏生物素
生物素 光敏基团
2）地高辛甙元

Dig-dUTP-----通过酶触反应掺入到DNA 中去制成探针----杂交----加抗地高辛-酶 的复合物—加底物—显色 灵敏度较高：0.1pg 特异性较生物素高 是较理想的非放射性标记物
三、探针的标记方法
（一）缺口翻译法或切口平移法 （二）随机引物法 (三）末端标记法 （四）cDNA探针的标记 （五）RNA探针的标记

随机引物法标记的原理
变性后的探针DNA或RNA与随机引物混 合 随机引物按碱基互补的原则与模板DNA 的相应区域结合 DNA多聚酶I的Klenow大片段即从引物 3’-OH端开始合成互补DNA连 反应中若加入修饰的dNTP即可获得标记 的DNA探针

5‘ 3‘ 变性 3‘ 随机引物 双连 DNA
核酸探针标记 （label of nuclei acid probe ）

一、探针的类型



核酸分子探针是指用放射性核素或其他标记物 标记的、能与特定的靶分子发生特异性相互作 用的DNA或RNA片段。 1． 基因组DNA探针：病毒DNA等 2． cDNA探针；最常用 3． 寡核苷酸探针：10-50bp，测序、点突变 4． RNA探针：稳定性高、特异性强，但RNA 极易降解，不宜操作。

地高辛标记探针的检测
抗地高辛抗体－碱性磷酸酶复合物
＋底物（BCIP+NBT)
紫色的不 溶性化合 物
生物素标记探针的检测

过氧化物酶 ＋ 底物 （ＤＡＢ） 抗生物素蛋白 生物素
棕褐色不溶 性的化合物
（三）膜固相杂交的类型

１、斑点及夹缝印迹杂交（dot blot and slot blot)：检测DNA或RNA（定性或半 定量）
（一）固相支持物的选择 １、硝酸纤维素膜： 在高离子强度下，具有较强的吸附单 连DNA和RNA的能力：80-100ug/cm2 ２、尼龙膜：在低离子强度下，很强的 吸附单连、双连的DNA或RNA；350500ug/cm2

（二）杂交的基本过程：

变性 杂交
洗膜


末端转移酶
5’________DNA___________3’(pdN)n
+nPPi (焦磷酸） T4多核苷酸激酶法（method of T4 polynucleotide kinase)
(三）末端标记法

T多核苷酸激酶法（method of T4 polynucleotide kinase) 3’——————5’OH +32P-P-PA(ATP）
２、Southern 印迹杂交 (Southern blot)：

检测DNA大小、存在状态 DNA电泳

变性
转膜
杂交
重物 玻璃板 吸水纸 凝胶 滤纸
盐桥
Southern转印
3|、 Northern印迹杂交 (Northern blot)：

检测RNA的大小和状态 杂交
RNA电泳 转印 洗膜 显色

３、洗膜
离子强度：0.1x SCC 洗膜温度：低于 Tm值 5-12 C 。 探针长500bp， G+C含量 42%,离子强度 0.1xSSC, 不含甲跣胺， Tm值为67 Ｃ， 则洗膜温度为55-62 Ｃ.

4、杂交信号的检测
１）放射性核素探针的检测：放射自显 影 ２）非放射性核素探针的检测 地高辛标记探针的检测 生物素标记探针的检测

核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization)
基本原理：具有一定同原性的两条核酸单 连在一定条件下（适当的温度、离子强 度等），按硷基互补的原则，重新形成 双连DNA的过程。 杂交的类型： 液相杂交：核酸电镜 固相杂交：膜固相印记杂交、组织细胞原 位杂交、菌落原位杂交
一、膜固相印记杂交
TTTTTTT-5’ cDNA
PCR
RT-PCR
三、荧光实时定量PCR (fluorescence Quantified real time –PCR)
实时荧光定量PCR技术于1996年由美国
Applied Biosystems公司推出，由于该 技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞 跃，而且与常规PCR相比，它具有特异 性更强、有效解决PCR污染问题、自动 化程度高等特点，目前已得到广泛应用。 下面就其定量原理、方法作一介绍。
杂交信号的检测
１、变性（Denaturation)
热变性：95-100C
, 5-10分钟 NaOH ,30分钟
碱变性：0.5Mol/L
２、杂交（hybridization)
变性的单连DNA按碱基配对的原则，在适当 的条件下重新缔合形成双连的过程。

建立杂交条件需要考虑的因素
１）离子强度：５x SSC ２）杂交温度：杂交反应在低于Tm值1525 Ｃ温度下进行 一般，探针长500bp，G+C含量为５０％， 离子强度为５x SSC；杂交液中不含甲酰 胺，Tm 值为93。4Ｃ，杂交温度68 Ｃ， 含甲酰胺，Tm值为68。4 Ｃ，杂交温度 42。4 Ｃ ３）减少非特异性杂交反应：预杂交
T4多核苷酸激酶

————————5’32P+PPA
三、探针的标记方法
（一）缺口翻译法或切口平移（nick translation） （二）随机引物法（random priming ) (三）末端标记法 （四）cDNA探针的标记（反转录制备单 连cDNA探针） （五）RNA探针的标记（体外转录的方 法）
3‘ 5‘
Klenow大片段
32P-dNTP
变性
随机引物标记法
随机引物法的特点

1）不但可用于双连DNA的标记，而且 可用于单连DNA和RNA的标记 2）操作简单 3）标记率高
(三）末端标记法
末端脱氧核苷酸转移酶法（terminal deoxynucleotide transferase) 5’——DNA——3’OH+-32 p-dNTP
引物的设计
目的ＤＮＡ：５’－ATG GGA AGC TGC TGT TAC CTC CGC ACT TCG GAC-----------------CTC CTA AGA CAC TCT CTA CAG-3’ 上游序列：５’－ ATG GGA AGC TGC TGT TAC CTC －３’ G+C=11/21=52% 下游序列：５’－CTG TAG AGA GTG TCT TAG GAG-3’ G+C=10/21=48%
一、常规多聚酶连反应
（一）原理： PCR是体外酶促合成特异ＤＮＡ片段的 方法。由高温变性、低温退火及适当温 度延伸等几步反应组成一个周期，循环 进行，使目的ＤＮＡ得以迅速扩增。 变性----退火------延伸-----延伸

9ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ °c 55 °c 72°c 30-35循环
5’
3’
5’ 3’
变性
退火 延伸
第二循环
（二）PCR 的特点
１。操作简单 ２。省时：1-2 hr ３。灵敏度高：pg ４。特异性强 ５。对原始材料质量要求低 ６。有一定程度的单核苷酸错误掺入

（三）影响ＰＣＲ的因素



１、模板：ng量的克隆DNA或g的染色 体DNA ２、引物：特异性应强 ３、Mg2+浓度: 1.5-2 mmol/L量 ４、dNTP 的浓 度: 单核苷酸浓度 200umol/L 5、 Taq DNA聚合酶的用量:100l 反应液 中加入2。5U的酶 ６、循环参数：；25-35
二、探针的标记物
理想的标记物：敏感度高；特异性强； 不影响探针分子的主要理化特性；标记、 检测方法简单、探针保存时间长；对环 境无污染、对人体无损害；价格低廉。 一）放射性标记物 二）非放射性标记物

（一） 放射性标记物 ----放射性核素
利用放射性核素能产生射线的特性将核 素标记在核酸合成所必需的NTP或dNTP 上，通过一定方法掺入到DNA 或RNA 中 去制成探针，与待测的核酸杂交后，核 素产生的或射线可使底片感光的特性， 通过放射自显影的方法进行检测。 产生射线的核素：32P、3H、35S 产生射线的核素：125I

二、组织、细胞的原位杂交

用标记的核酸探针与组织切片或细胞涂 片中的核酸进行杂交并对其进行检测和 定位的方法
三、菌落与噬菌体斑的原位杂交
平皿
培养
膜－－杂交
PCR技术的原理和应用

PCR：Polymerase chain reaction Mullis: 1983发明， 1993获诺贝尔奖 Sarki:1985将PCR用于镰刀红细胞贫血 的诊断。 Erlich: 分离纯化了适用于PCR的Tag酶