一种与萝卜抗根肿病QTL连锁的SSR分子标记及应用[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811186852.9
(22)申请日 2018.10.12
(71)申请人 湖北省农业科学院经济作物研究所
地址 430064 湖北省武汉市洪山区南湖大
道张吴湾43号
(72)发明人 甘彩霞　邓晓辉　崔磊　袁伟玲　
於校青　
(74)专利代理机构 武汉河山金堂专利事务所
(普通合伙) 42212
代理人 胡清堂
(51)Int.Cl.
C12Q 1/6895(2018.01)
C12N 15/11(2006.01)
(54)发明名称
一种与萝卜抗根肿病QTL连锁的SSR分子标记
及应用
(57)摘要
本发明公开了一种与萝卜抗根肿病QTL连锁
的SSR分子标记，所述萝卜抗根肿病QTL有5个位
点，分别是RsCr1、RsCr2、RsCr3、RsCr4和RsCr5，
所述分子标记的正向引物和反向引物序列分别
为SEQ ID NO.1和2。

本发明还公开了此SSR分子
标记的获得方法，包括以下步骤：简化基因组测
序，萝卜高密度SNP遗传图谱的构建，萝卜F 3家系抗
根肿病表型鉴定，萝卜抗根肿病QTL分析，SSR分子
标记的开发及筛选。

可直接利用本发明提供的
SSR分子标记鉴定萝卜的抗根肿病和分子标记辅
助育种，在萝
卜根肿病防治研究中具有重要意义。

权利要求书1页 说明书5页序列表1页 附图7页CN 109280716 A 2019.01.29
C N 109280716
A
1.一种与萝卜抗根肿病QTL连锁的SSR分子标记，其特征在于：所述萝卜抗根肿病QTL有5个位点，分别是RsCr1、RsCr2、RsCr3、RsCr4和RsCr5；所述SSR分子标记为fold92946_4806，所述分子标记的正向引物和反向引物序列分别为SEQ ID NO.1和2。

2.根据权利要求1所述的一种与萝卜抗根肿病QTL连锁的SSR分子标记，其特征在于：所述RsCr1位于第8条连锁群，物理位置为16609003-27278934，RsCr2、RsCr3、RsCr4和RsCr5位于第9条连锁群，物理位置分别为9721983-10350983、10350983-12019236、12031702-12575858、12999688-22628845。

3.根据权利要求1所述的一种与萝卜抗根肿病QTL连锁的SSR分子标记，其特征在于：所述SSR分子标记位于第9条染色体上。

4.一种与萝卜抗根肿病QTL连锁的SSR分子标记的开发方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、简化基因组测序：萝卜抗病材料BJJ和感病材料XNQ杂交，F1代自交获得F 2群体及其F 2:3家系，利用CTAB方法提取F 2群体及亲本幼嫩叶片的DNA，采用RAD -seq进行基因组测序；
S2、萝卜高密度SNP遗传图谱的构建：测序后数据经质控、数据过滤、对比到参考基因组及亲本间多态性筛选获得SNP位点，使用Joinmap 4.0软件进行遗传图谱的构建；
S3、萝卜F 3家系抗根肿病表型鉴定：将F 2:3各编号表型种子播种于50孔穴盘，出苗后3d采用灌根法接种根肿病菌，进行抗性鉴定；
S4、萝卜抗根肿病QTL分析：采用QTL IciMapping 4.0软件进行各表型的QTL定位分析，得到了5个根肿病相关的QTL位点；
S5、SSR分子标记的开发及筛选：在QTL定位区间内共开发20对SSR分子标记，用SSR分子标记依次筛选抗病亲本、感病亲本、F1以及F2群体，即获得目的SSR分子标记。

5.根据权利要求4所述的一种与萝卜抗根肿病QTL连锁的SSR分子标记的开发方法，其特征在于：步骤S1所述测序时，F 2子代平均信息采集深度为0.5X，平均信息采集量不低于0.25G，亲本重测序深度为30X，信息采集量不低于18G。

6.根据权利要求4所述的一种与萝卜抗根肿病QTL连锁的SSR分子标记的开发方法，其特征在于：步骤S2所述数据过滤指过滤掉亲本中存在缺失的标记位点、过滤掉亲本中存在缺失的标记位点、过滤掉样品基因型缺失率>50％标记位点或过滤掉在子代偏分离的基因型位点。

7.根据权利要求7所述的一种与萝卜抗根肿病QTL连锁的SSR分子标记的开发方法，其特征在于：过滤掉在子代偏分离的基因型位点是通过筛选显著性水平为P<0.0001卡方检验来实现的。

8.一种与萝卜抗根肿病QTL连锁的SSR分子标记在鉴定萝卜抗根肿病或萝卜分子标记辅助育种中的应用。

权　利　要　求　书1/1页CN 109280716 A
一种与萝卜抗根肿病QTL连锁的SSR分子标记及应用
技术领域
[0001]本发明涉及分子生物学领域，特别涉及与萝卜抗根肿病QTL连锁的SSR分子标记及其应用。

背景技术
[0002]近年来，根肿病(Clubroot disease)在我国东北地区、西南地区、长江中上游等地均有发现，并且发病区域有进一步扩大的趋势。

我国大部分十字花科作物产区受到了根肿病的危害。

根肿病现已成为我国芸薹属作物的主要病害之一。

在世界各地每年因根肿病的危害导致芸薹属作物减产多达10％-15％(Dixon，2009)。

我国萝卜根肿病发病日渐严重。

萝卜根肿病的防治已刻不容缓。

[0003]总结国内外根肿病的防治一般有作物轮作，栽培抗病品种，化学药剂，生物药剂，或者这几种方法综合使用。

Cathcart等(2006)报道了油菜与谷物和豆类3年的轮作可以有效的防治油菜根肿病发病造成的减产，也有油菜与谷物进行2年的轮作报道(Hartman 2012).氟啶胺和氰霜唑可以有效的防治十字花科根肿病，可减轻大白菜根肿病的发病(Townley&Fox，2003；Mitani et al.2003；Gossenet al.2013)。

现有的生物防治、化学防治、农业防治措施虽然在一定程度上起到了防治根肿病的效果，但仍不能从根本上解决大白菜栽培所面临的严重问题。

氟啶胺和氰霜唑虽对根肿病的防治可以起到一定的效果，但是由于较大的用药剂量，污染环境，农药残留和抑制作物正常生长等缺陷不宜大面积推广。

绿色无公害是未来蔬菜生产的发展方向，基于食品安全问题的考虑，化学药剂防治根肿病可能不是最佳的解决方案，适宜作为一种辅助防治手段。

抗病育种具有经济、无污染、安全高效等优点，是根肿病防治的最佳方法。

Peng等(2014)也认为抗病育种应是防治根肿病的根本。

[0004]抗病育种的首要前提是发掘抗病基因。

SNP是基因组中最常见的变异类型,具有分布广、数量多的优点。

传统的SNP标记开发方法通量低、开发成本高，极大地限制了SNP标记在高密度遗传图谱中的应用。

RAD-seq技术具有不依赖于基因组序列的优点，可进行高通量的SNP标记的开发。

[0005]RAD-seq是一个功能强大的SNP开发平台，使用RAD-seq可以发掘大量的SNP标记，进行重要基因的定位。

2008年，Baird等首次将RAD标记应用于第二代测序中，以三刺鱼为研究对象，通过对来自两个在侧鳍性状存在明显差异的亲本及其F2群体中的96个个体进行测序得到了13000个SNPs，最终将控制三刺鱼侧鳍缺失的Eda位点定位在了连锁群Ⅳ上，距离最近的RAD标记为1.5Mb。

2011年，Pfender等通过对黑麦草(Lolium pe-renne)锈病的抗感和易感亲本及由其杂交产生188个F1家系进行RAD-seq，构建了亲本的高密度遗传图谱，定位到了3个与锈病相关的QTL位点。

[0006]由上可知，控制萝卜抗根肿病的QTL的研究将对萝卜根肿病的防治起到重要作用，因此，需要进一步挖掘相关QTL。

[0007]本发明的目的在于提供萝卜中根肿病相关的数量性状位点(QTL)，包括RsCr1、RsCr2、RsCr3、RsCr4和RsCr5，其中RsCr1位于第8条连锁群，物理位置为16609003-27278934，RsCr2、RsCr3、RsCr4和RsCr5位于第9条连锁群，物理位置分别为9721983-10350983、10350983-12019236、12031702-12575858、12999688-22628845。

针对这些位点，筛选到与其性状紧密连锁的SSR分子标记fold92946_4806，其正向引物和反向引物序列分别为SEQ ID NO.1和2。

[0008]本发明的另一个目的在于提供了一种萝卜抗根肿病紧密连锁的分子标记引物的应用，利用该引物，可用于萝卜抗根肿病的鉴定以及萝卜的育种。

[0009]本发明进一步提供一种获得萝卜中与抗根肿病QTL紧密连锁的SSR分子标记的方法，包括以下步骤：
[0010]S1、简化基因组测序：萝卜抗病材料BJJ和感病材料XNQ杂交，F1代自交获得F2群体及其F2:3家系，利用CTAB方法提取F2群体及亲本幼嫩叶片的DNA，采用RAD-seq进行基因组测序；
[0011]S2、萝卜高密度SNP遗传图谱的构建：测序后数据经质控、数据过滤、对比到参考基因组及亲本间多态性筛选获得SNP位点，使用Joinmap4.0软件进行遗传图谱的构建；[0012]S3、萝卜F3家系抗根肿病表型鉴定：将F2:3各编号表型种子播种于50孔穴盘，出苗后3d采用灌根法接种根肿病菌，进行抗性鉴定；
[0013]S4、萝卜抗根肿病QTL分析：采用QTL IciMapping 4.0软件进行各表型的QTL定位分析；
[0014]S5、SSR分子标记的开发及筛选：在QTL定位区间内共开发20对SSR标记,用20对SSR 标记筛选抗病亲本、感病亲本和F1，筛选出具有多态性的标记共5对，再用5对SSR标记筛选F2群体130个单株的DNA样本，获得一个可用于分子标记辅助育种的SSR标记。

[0015]优选的，步骤S1所述测序时，F2子代平均信息采集深度为0.5X，平均信息采集量不低于0.25G，亲本重测序深度为30X，信息采集量不低于18G。

[0016]优选的，步骤S2所述数据过滤指过滤掉亲本中存在缺失的标记位点、过滤掉亲本中存在缺失的标记位点、过滤掉样品基因型缺失率>50％标记位点或过滤掉在子代偏分离的基因型位点。

[0017]更加优选的，步骤S2所述过滤掉在子代偏分离的基因型位点是通过筛选显著性水平为P<0.0001卡方检验来实现的。

[0018]本发明的有益效果是：1.采用RAD-seq技术可以发掘大量的SNP标记，进行重要基因的定位，本发明通过对萝卜根肿病病的抗感和易感亲本及由其杂交产生F2家系进行基因测序得到了1148个SNPs，并构建了萝卜高密度遗传图谱。

2.利用QTL IciMapping V4.0软件ICIM-ADD(完备区间的加性QTL作图法)算法分析萝卜抗根肿病QTL，定位到了5个与根肿病相关的QTL位点。

3.根据QTL的定位区间，开发设计了一系列分子标记，并逐级筛选，最终获得与抗病性能紧密连锁的SSR分子标记。

4.可以直接利用本发明提供的SSR分子标记鉴定萝卜的抗根肿病，并可用于萝卜抗根肿病分子标记辅助育种，而且抗病育种具有经济、无污染、安全高效等优点，是防治根肿病的最佳方法。

[0019]图1为实施例2中SNP筛选流程。

[0020]图2为萝卜高密度SNP遗传图谱及QTL。

[0021]图3为实施例5中20对SSR引物多态性筛选胶图。

[0022]图4为实施例5中10对SSR引物多态性筛选胶图。

[0023]图5为实施例5中5对SSR引物多态性筛选胶图。

[0024]图6为实施例5中标记fold85542_3901筛选胶图。

[0025]图7为实施例5中标记fold90186_4344筛选胶图。

[0026]图8为实施例5中标记fold50705_2160筛选胶图。

[0027]图9为实施例5中标记fold54075_2310筛选胶图。

[0028]图10为实施例5中标记fold92946_4806筛选胶图。

[0029]图11为分子标记fold92946_4806的抗病连锁鉴定图。

[0030]图12为萝卜第九条染色体的重建图谱。

具体实施方式
[0031]下面将结合实施例对本发明的实施方案进一步的描述，但并不是限制本发明的范围，仅作示例说明。

实施例中所述的萝卜抗病材料BJJ和感病材料XNQ、BJJ和XNQ杂交后自交获得的F2群体、F2单株自交获得F2:3家系均由湖北省农业科学院经济作物研究所提供，根肿菌4号生理小种由沈阳农业大学园艺学院朴钟云教授提供。

[0032]实施例1：简化基因组测序
[0033]采取130个F2单株及亲本的幼嫩叶片，利用CTAB方法提取萝卜基因组DNA。

采用限制性内切酶EcorI消化基因组DNA于37℃进行酶切15min，酶切后并随机打断，用1％琼脂糖胶电泳后回收300bp-500bp的DNA，末端修复后加A，：加Solexa接头P2Adapter(P2接头为分叉的Y型接头，可阻止未连接P1接头的片段扩增)，并纯化，取5μL用于PCR扩增，1％琼脂糖胶纯化回收350-550bp DNA后进行文库检测并上机测序，测序仪器为Illumina Hiseq 4000，F2子代平均信息采集深度为0.5X，平均信息采集量不低于0.25G，亲本重测序深度为30X，信息采集量不低于18G。

[0034]F2家系原始数据经过滤后共产出63.5Gb数据，亲本BJJ和XNQ原始数据过滤后分别为22.53Gb和19.85Gb。

亲本BJJ和XNQ对比统计结果见表1。

[0035]表1亲本BJJ和XNQ测序结果对比统计结果
[0036]
[0037]实施例2：SNP遗传标记的获得
[0038]测序后数据经质控、数据过滤、对比到参考基因组及亲本间多态性筛选获得SNP标记(图1)。

[0039]将所有过滤后所得的每个样品的过滤后数据利用SOAP2软件与华大组装参考基因
组序列R.sativus.sequence.v130428.chr.fa(394M)进行比对，并统计比对信息。

[0040]利用一致性序列，筛选出与参考序列比对的多态性位点，并进行过滤，获得每个样品的SNP位点信息。

用亲本和子代得到SNP和一致性序列，将所有个体的SNPs整合在一起，得到整个群体的高质量的基因型标记。

在进行SNP整合时，如果该基因型的质量值小于20、拷贝数大于1.5、亲本基因型的深度小于5或大于300、子代基因型的深度小于3或大于300，将这样的基因型记作缺失，用“-”表示。

[0041]选取标记：将上步所得到的基因分型文件按照F2群体的特点对其进行如下条件的过滤，最后将获得的分离位点用于遗传图谱的构建。

[0042]1)过滤掉亲本中存在缺失的标记位点；
[0043]2)过滤掉亲本中存在缺失的标记位点(即仅保留在两存差异的纯合位点)；[0044]3)过滤掉样品基因型缺失率>50％标记位点；
[0045]4)过滤掉在子代偏分离的基因型位点(通过显著性水平为P<0.0001卡方检验来筛选)；
[0046]最后获得1148个SNP位点，使用Joinmap 4.0软件对获得的标记进行遗传图谱的构建，各连锁群统计结果见表2。

[0047]从表2的统计结果中可看出，该遗传图谱共含有1148个遗传标记，覆盖萝卜基因组总长度894.6cM，标记间的平均遗传距离为0.7cM。

采用Joinmap 4.0软件，进行连锁群的遗传图谱的整合，得到该群体的基因组遗传图谱，遗传图谱结果展示见图2。

[0048]表2萝卜遗传图谱统计信息
[0049]
[0050]
[0051]实施例3：萝卜F3家系抗根肿病表型鉴定
[0052]将F2:3各编号表型种子播种于50孔穴盘。

出苗后3d采用灌根法(接种根肿病菌孢子浓度为1×107·mL－1)，分别用4号生理小种对25个植株进行抗性鉴定。

土壤保持湿润，温度不低于10℃。

接菌6周后，洗净根部泥土，按0～3级标准调查单株发病情况。

分级标准为：0级，根部无肿瘤；1级，侧根有微小肿瘤；2级，侧根有较大肿瘤或主根有节状小瘤；3级，主侧根有明显肿瘤。

0级为抗病，其他均为感病。

抗病性鉴定在长阳火烧坪育苗温室进行。

[0053]实施例4：萝卜抗根肿病QTL定位分析
[0054]QTL定位分析软件为中国农科院研发的QTL IciMapping V4.0软件(http:// /software/)。

采用QTL IciMapping V4.0软件的BIP功能，进行各表型
的QTL定位分析。

将准备好的数据文件导入软件中，选择ICIM-ADD(完备区间的加性QTL作图法)算法，LOD阈值选择2.5，Step选择1.0进行QTL作图分析，最后可得到*.qic文件为最终的结果文件；然后再利用该软件的ICIM Addtive Mapping功能进行QTL定位结果图形的绘制。

[0055]共检测到5个与萝卜根肿病抗性相关的QTL位点，RsCr1、RsCr2、RsCr3、RsCr4和RsCr5(图2)，表型变异为7.26％～31.38％(表4)。

其中RsCr1在第8条连锁群上，RsCr2、RsCr3、RsCr4和RsCr5在第9条连锁群上。

RsCr1与拟南芥的At4和大白菜A08上的Crr1/ PbBa8.1具有同源区间。

[0056]表4萝卜抗根肿病QTL鉴定
[0057]
[0058]实施例5.SSR分子标记的开发及筛选
[0059]在定位区间内共开发20对SSR标记，用20对SSR标记筛选抗病亲本、感病亲本和F1，筛选出具有多态性的标记共5对，分别是图3-5是相对应的SSR引物多态性筛选胶图。

所述的5对分子标记分别是fold85542_3901、fold90186_4344、fold50705_2160、fold54075_2310和fold92946_4806。

再用这5对SSR标记筛选F2群体130个单株的DNA样本(图6-10)，获得一个可用于分子标记辅助育种的SSR标记。

[0060]该SSR标记fold92946_4806可用于萝卜抗根肿病分子标记辅助育种，标记引物序列为P r i m e r_F：t c t c t t c t t t t c t c a g c t g g c a t t(S E Q I D N O.1)，P r i m e r_R：agaagcacgaatacccaagttctg(SEQ ID NO.2)。

[0061]重建图谱-第九条染色体，对比之前QTL定位结果比较新开发标记在图谱中的位置，确定QTL位点关联标记，结果如图12所示。

[0062]对位于QTL位点中的fold92946_4806标记做抗病连锁鉴定，选择感病单株30株，抗病单株30株，检测标记的基因型。

结果见图11，证明该分子标记与抗病位点紧密连锁。

[0063]对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

序列表
<110> 湖北省农业科学院经济作物研究所
<120> 一种与萝卜抗根肿病QTL连锁的SSR分子标记及应用<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tctcttcttt tctcagctgg catt 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agaagcacga atacccaagt tctg 24
序　列　表1/1页CN 109280716 A
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图2
图3
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图5
图6
图7
图8
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图10
图11
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