溶组织梭菌胶原酶H_在大肠杆菌中的分泌表达

文章编号：1006-3080(2022)06-0797-09DOI: 10.14135/ki.1006-3080.20210924001
溶组织梭菌胶原酶H 在大肠杆菌中的分泌表达
赵钱山1， 刘 晓2， 李素霞1
（1. 华东理工大学生物反应器国家重点实验室, 上海 200237；
2. 上海雅心生物技术有限公司, 上海 200231）
摘要：溶组织梭菌Clostridium histolyticum 胶原酶H （ColH ）作用于胶原蛋白的Y-Gly 处，将其水解成小分子肽。

通过在colH 基因中融合大肠杆菌外膜蛋白A 的信号肽序列，成功构建了分泌高分子量的ColH （116 kDa ）的菌株，结果发现信号肽在N 端的位置影响其分泌效果，N 端若有多余的氨基酸片段会显著降低信号肽引导胶原酶的分泌功能。

通过正交试验与单因素实验对诱导条件和培养基添加剂优化提高其分泌表达量, 结果表明：在诱导温度为25 ℃、诱导菌浓OD 600=0.9、IPTG （异丙基-β-D -硫代吡喃半乳糖苷）浓度为0.1 mmol/L 、装液量为20%，镁离子浓度为10 mmol/L ，诱导2.5 h 后添加w 为2%甘氨酸、诱导培养20 h ，胞外胶原酶活性最高为0.68 U/mL ，是优化前酶活的38.1倍，显著提高了分泌表达量。

研究结果还表明，镁离子的添加可增加ColH 的胞外分泌。

关键词：溶组织梭菌胶原酶H ；正交实验；信号肽；镁离子；分泌表达中图分类号：Q78
文献标志码：A
胶原蛋白是脊椎动物体内最丰富的蛋白质成分，约占体内总蛋白的1/3。

胶原蛋白(Ⅰ型胶原：300 kDa ；长300 nm ，宽15 nm)是由3条左旋α链相互缠绕形成的右手三螺旋结构蛋白[1]，其中，每条α链分为螺旋区和非螺旋区，螺旋区由重复的Gly （甘氨酸）-X -Y 三联体序列构成，通常X 和Y 为脯氨酸和羟脯氨酸。

在体内，胶原蛋白由非螺旋区相互作用形成有序、有层次的结构，如纤丝(I 型、II 型和III 型)和网状结构(IV 型)[2]。

胶原蛋白是构成皮肤、肌腱、韧带等结缔组织的主要成分，为组织提高弹性、支撑和稳定性、同时也参与了细胞的信号传递、迁移、附着和分化[2]。

由于胶原蛋白三螺旋和纤维的独特结构，使其能抵抗大多数蛋白酶的水解。

在生理条件下水解胶原的蛋白酶，称为胶原酶。

其中，研究最多且详细的是脊椎动物的金属蛋白酶家族，已有大量研究表明这些胶原酶与组织发育、癌细胞扩散有密切的联系[3]。

目前也在多种微生物中发现胶原酶，如梭菌属、芽孢
杆菌属、弧菌属等[4-5]。

在微生物胶原酶中，溶组织梭菌胶原酶(EC 3.4.24.3)的研究最为详细，也是目前认为活性最高的微生物胶原酶之一[6]。

与脊椎动物胶原酶相比，溶组织梭菌胶原酶具有广泛的底物特异性，能够在三螺旋区域的Y -Gly 处水解胶原蛋白酶，梭菌胶原酶已广泛用于从各种组织和器官分离细胞和胶原异常相关疾病的临床治疗[7-9]。

溶组织梭菌（Clostridium histolyticum ）是一种严格厌氧的革兰氏阳性菌，是气性坏疽的病原体之一。

已知溶组织梭菌至少能产生7种不同的胶原酶和明胶酶以及各种其他蛋白酶，这严重阻碍了从溶组织梭菌培养液中纯化出高纯度的胶原酶单体，这也是市场上现存的梭菌胶原酶大部分是混合物的主要原因[10-12]。

市场上高纯度梭菌胶原酶的稀缺促使人们研究开发其制备方法，有利用大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、产气荚膜梭菌等表达系统制备该酶的报道，但是枯草芽孢杆菌存在质粒不稳定和蛋白表达水平低效问题，产气荚膜梭菌存在毒素污染风险等问题[13-15]。

收稿日期： 2021-09-24
作者简介： 赵钱山（1995—），男，安徽合肥人，硕士生，研究方向重组蛋白酶。

E-mail ：*****************通信联系人： 李素霞，E-mail: *****************.cn
引用本文： 赵钱山, 刘 晓, 李素霞. 溶组织梭菌胶原酶H 在大肠杆菌中的分泌表达[J]. 华东理工大学学报（自然科学版）, 2022, 48(6): 797-805.Citation ： ZHAO Qianshan, LIU Xiao, LI Suxia. Secretory Expression of Clostridium histolyticum Collagenase H in Escherichia coli [J]. Journal of East China
University of Science and Technology, 2022, 48(6): 797-805.
Vol. 48 No. 6华 东 理 工 大 学 学 报（自 然 科 学 版）
2022-12
Journal of East China University of Science and Technology
797
大肠杆菌是目前应用最多的异源蛋白质表达体系。

一般来说，重组蛋白在大肠杆菌中表达具有3种空间定位，即胞质、周质空间和培养基。

虽然在大肠杆菌胞质已经成功表达了梭菌胶原酶，但是鲜有有关分泌表达的报道。

利用大肠杆菌分泌表达梭菌胶原酶时，不需要对细胞进行破碎处理，也避免了胶原酶表达过程中被胞内蛋白酶水解从而提高其稳定性，简化下游纯化工艺等优点[16-17]。

本文通过融合大肠杆菌外膜蛋白A （OmpA ）信号肽实现胶原酶在大肠杆菌中的分泌表达，在此基础上通过正交实验优化诱导表达的条件，通过向培养基中添加试剂进一步提高胶原酶的分泌水平，同时比较了信号肽的位置对分泌的影响。

1 材料与方法
1.1 菌株与质粒
研究使用的克隆菌株（大肠杆菌DH5α）和表达
菌株（大肠杆菌BL21（DE3）），质粒pET28a 均为本实验保存。

pET28a -ColH 质粒委托上海生工生物工程有限公司合成，colH 基因插入在多克隆位点Bam H Ⅰ和Xho Ⅰ限制性酶切位点间。

1.2 主要试剂
Primer STAR DNA 聚合酶、QuickCut 限制性内
切酶、T4DNA 连接酶购自TaKaRa 公司；琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司；Seamless Cloning Master Mix 、IPTG （异丙基-β-D -硫代吡喃半乳糖苷）、卡那霉素购自生工生物工程（上海）股份有限公司；PZ 肽（4-苯基偶氮苄氧基羰基-Pro -Leu -Gly -Pro -D -Arg ）购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司。

1.3 质粒的构建与转化
为实现在大肠杆菌中分泌表达ColH ，根据
pET28a -ColH 模板质粒序列，构建了带有大肠杆菌外膜蛋白A 信号肽的引物（表1）。

以pET28a -ColH 为模板，PCR 扩增出OmpA -ColH 。

将扩增产物用Bam HI 和Xho I 进行双酶切，再用T4连接酶将酶切产物连接到用相同限制酶进行双酶切的pET28a 质粒中，得到信号肽的N 端含有多肽序列的表达质粒（pET28a -noterompA -ColH ）如图1所示。

该质粒转化大肠杆菌DH5α，测序验证正确后，再转化大肠杆菌BL21（DE3），获得分泌表达的菌株，定义为菌株A [18]。

同时，以F2和R2为引物，以pET28a -noterompA -ColH 为模板，利用PCR 扩增出OmpA -ColH 。

将扩增产物与用Nco I 和Xho I 双酶切的pET28a 质粒混合，加入Seamless Cloning Master Mix 得到pET28a -terompA -ColH ，如图1所示。

同上步骤，该质粒转化的大肠杆菌BL21（DE3），定义为菌株B 。

pET28a-noterompA-ColH 6Histag RBS
RBS Other
tag
ColH ColH 6Histag
6Histag
Thrombin site T7 tag
pET28a-terompA-ColH CATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGT
图 1 构建的两种ColH 分泌质粒结构示意图
Fig. 1 Schematic representation of two ColH secretory expression plasmids
表 1 本研究使用的引物Table 1 Primers used in this work
Primer names
Primer sequence （5′–3′）
F1ATCGAGGATCC ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGG
TTTCGCTACCGTAGCGCAGGCC GTCCAGAACGAAAGCAAACGCTAC
R1ATCGACTCGAGACGACCAACGCTGCCTTC
F2AAGGAGATATACCATG AAAAAGACAGCTATCGCGATTGC
R2
GGTGGTGGTGCTCGA GACGAC
The underlined part is the restriction site; The oblique part is the signal peptide sequence; The bold part is the homologous sequence of primer and carrier terminal
798华 东 理 工 大 学 学 报（自 然 科 学 版）第 48 卷
1.4 胶原酶活性的测定
胶原酶活性测定采用PZ肽为底物的方法[19]，胶原酶活性的计算公式如下：
其中：A为样品溶液的吸光度；A B为空白对照的吸光度；V T为反应液体积；V E为萃取混合物中乙酸乙酯体积；ε为PZ-Pro-Leu在320 nm下的消光系数，ε= 21 cm2/μmol；V为样品溶液的体积；V R为转移至柠檬酸中的反应液体积；B为吸收路径长度，cm；T为孵育时间；D为稀释倍数。

在测定条件下，一个酶活力单位定义为每分钟从底物PZ肽中释放相当于1 μmol 的PZ-Pro-Leu的酶量。

1.5 胶原酶在大肠杆菌中的分泌表达条件优化
将构建的分泌表达菌株接种在含50 μg/mL卡那霉素的LB（Luria-Bertani）培养基中，在37℃、200 r/min 下培养到一定菌浓后，加入一定量的IPTG在一定温度下诱导表达。

诱导一定时间后取4.5 mL的菌液，在10 000 r/min、4 ℃、离心5 min条件下分别收集培养液和细胞沉淀。

用9 mL、50 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0；含5 mmol/L Ca2+）悬浮收集细胞，超声破碎（超声时间5 s，间歇时间5 s，超声功率180 W；循环次数33次），在10 000 r/min、4 ℃、离心5 min 条件下收集上清和不溶性组分。

SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶）电泳鉴定其表达情况，并测定胞外培养基与胞内可溶性组分中胶原酶活性（以下简称胞内活性）。

通过正交试验优化胶原酶分泌的培养条件[20-21]。

设置4个实验因素：诱导温度、诱导剂IPTG浓度、诱导时菌浓、装液量，每个因素设3个水平，如表2因素水平表所示。

选用L18(37)正交表来设计实验。

实验以胞外酶活和总酶活作为结果的考察指标。

表 2 因素水平表
Table 2 Factor level table
Factors
Levels
Inducing
temperature/℃
c(IPTG)/
(mmol·L−1)
OD600
Loading
volume fraction/% 1200.10.4510
2250.50.9020
330 1.0 1.8030
在正交试验优化的最优培养条件下，通过单因素实验分析甘氨酸添加浓度和添加时间、金属离子添加种类和添加量以及诱导表达时间对胶原酶分泌表达的影响，进一步提高胶原酶的分泌量。

2 结果与讨论
2.1 信号肽的位置对胶原酶分泌的影响
分别用酶切连接与无缝克隆成功构建pET28a-noterompA-ColH和pET28a
-terompA-ColH 2种质粒。

对3种菌株（加不含信号肽的原始菌株）诱导20 h后，
通过SDS-PAGE电泳分析胶原酶的分泌情况，并测
定胞外活性，结果如图2所示。

从图2中可以看出，
信号肽的插入促进胶原酶的分泌，并且信号肽N端
多余的氨基酸片段影响胶原酶的分泌效果。

由于菌
(a) SDS-PAGE analysis of the extracellular
component at 10% gel concentration
(b) Enzymatic activity of the extracellular
component hydrolyzing PZ peptide
kDa
ColH 116 kDa
E
n
z
y
m
e
a
c
t
i
v
i
t
y
/
(
U
·
m
L
−
1
)
200.0
116.0
97.2
66.4
44.3
M123
0.06
0.04
0.02
P r o
t o b
a c t e
r i a
S t r a
i n A
S t r a
i n B
＊＊
＊＊＊
＊
∗∗∗∗∗∗
—P<0.05; —P<0.01; —P<0.001
图 2 3种重组菌株胶原酶的胞外分泌情况
Fig. 2 Extracellular secretion of collagenase in the three recombinant strains
第 6 期赵钱山，等：溶组织梭菌胶原酶H在大肠杆菌中的分泌表达799
株B 胞外活性是菌株A 的3倍，所有接下来的实验以菌种B 为研究对象。

有报道认为，将含信号肽的目的基因插入载体的Bam H Ⅰ和Xho Ⅰ之间，可以成功分泌出目的蛋白，所以就推断位于信号肽N 端多余的氨基酸片段不会影响信号肽的功能[22-23]。

本文实验结果说明信号肽N 端多余的氨基酸片段显著影响了胶原酶的分泌效果。

2.2 诱导条件对胶原酶分泌的影响
正交试验中各因素对于分泌酶活和总酶活的影
响趋势如图3所示，IPTG 浓度和诱导时菌浓的影响趋势相同，从而确定了最优IPTG 浓度为0.1 mmol/L ，诱导时菌浓为0.9。

诱导后的生长温度和装液量对于分泌酶活和总酶活的影响表现出相反的趋势，装液量10%有利于目的蛋白的分泌，但总活性却是最低，不利于进一步的优化以增加分泌量，综合考虑确定装液量20%为进一步优化实验的条件。

诱导后的生长温度，30 ℃条件下，虽然利于胶原酶的分泌，但胶原酶总表达量却显著降低；20 ℃诱导，虽然利于胶原酶的表达，但是胶原酶的分泌却显著降低，综合考虑
下，诱导后生长温度选择25 ℃。

图4分析了诱导后胞外目的蛋白的分泌（图4(a)），和胞内的目的蛋白（图4(b)），从图中的结果可以看出，各组间的差异还是比较大的，如：分泌较多的9组（30 ℃，10%装液量）的胞内目的蛋白的量很低；总活性最高的13组（20 ℃，30%装液量）胞内目的蛋白的量最高，但分泌量却是最低的，这与正交试验中，各因素对酶活影响的趋势相吻合。

2.3 培养基中添加剂对胶原酶分泌的影响
重组蛋白在大肠杆菌中的分泌表达不仅受到信
号肽、诱导表达条件（培养基成分，诱导温度，诱导剂浓度等）的影响，也受到细胞膜通透性（尤其是细胞外膜）的影响[17]。

目前可以通过多种实验策略来增加细胞膜的通透性，如选择具有细胞膜或细胞壁缺陷性的菌株（如L -型细菌）、共表达策略（如共表达大肠菌素E1溶解蛋白和细菌素释放蛋白）、向培养基中添加一些化学成分（如Ca 2+、甘氨酸、曲拉通X -100、吐温80等）[22,24-25]。

为进一步提高大肠杆菌胶原酶的分泌量，本文研究了培养基中添加甘氨酸、钙镁金属离子对胶原酶分泌的影响。

E x t r a c e l l u l a r a c t i v i t y /(U ·m L −1)
T o t a l a c t i v i t y /(U ·m L −1)
Inducing temperature/℃
E x t r a c e l l u l a r a c t i v i t y /(U ·m L −1)T o t a l a c t i v i t y /(U ·m L −1
)c (IPTG)/(mmol·L −1)
E x t r a c e l l u l a r a c t i v i t y /(U ·m L −1)T o t a l a c t i v i t y /(U ·m L −1
)
OD 600
E x t r a c e l l u l a r a c t i v i t y /(U ·m L −1)T o t a l a c t i v i t y /(U ·m L −1
)
Loading volume fraction/%
Total activity;Extracellular activity
图 3 正交试验的因素指标趋势图
Fig. 3 Factor index trend chart of orthogonal experiment
800华 东 理 工 大 学 学 报（自 然 科 学 版）第 48 卷
2.3.1 甘氨酸的添加量对胶原酶分泌的影响　在上述正交试验确定的最优条件下，在诱导5 h 后向培养基中添加质量分数分别为0.5%，1.0%，1.5%，2.0%的甘氨酸。

在诱导12 h 和24 h 时分别取样测定胞外活性和总活性，结果如图5所示。

从图5(a)可以看出，随着培养基中甘氨酸量的增加，胞外活性也逐渐增加。

从图5(b)中可以看出，诱导后生长12 h ，随着培养基中甘氨酸量的增加，总活性逐渐降低；但在24 h ，反而呈现增加的趋势，而胞外活性却是逐渐增加。

这可能是分泌到培养基中酶的稳定性高于胞内的稳定性。

随着培养基添加甘氨酸量的增加，胞外活性逐渐增加，但是培养基中甘氨酸的添加量多会抑制大肠杆菌的生长，因此本文确定甘氨酸的添加量为2.0%（质量分数，下同）。

2.3.2 甘氨酸的添加时间对胶原酶分泌的影响　在
确定了培养基中甘氨酸浓度后，研究了甘氨酸的添加时间对胶原酶分泌的影响，结果如图6所示。

从图中可以得出，在诱导2.5 h 时添加甘氨酸，胞外活性与
ColH 116 kDa
ColH 116 kDa
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
M
kDa 200.0116.097.266.4
44.3
kDa (a) Extracellular components
(b) Intracellular soluble components
1~18— Experiments 1~18
200.0116.0
97.266.444.3
11
12
1314
15
1617
18
12345678910
M 11
12
1314
15
1617
18
图 4 SDS-PAGE 电泳分析胶原酶ColH 的分泌表达鉴定Fig. 4 SDS-PAGE analysis of ColH expression and secretion
E x t r a c e l l u l a r a c t i v i t y /(U ·m L −1)
T o t a l a c t i v i t y /(U ·m L −1)
000.5 1.0 1.5 2.000.5 1.0 1.5 2.0
00.5 1.0 1.5 2.000.5 1.0 1.5 2.0
0.20.4
0.60
0.5
1.0
1.5
w (Glycine)/%
(a)
w (Glycine)/%
(b)
Inducing time/h:
12;
−24
−图 5 甘氨酸添加量对ColH 表达和分泌的影响
Fig. 5 Effects of amount of glycine added on ColH expression and secretion
第 6 期赵钱山，等：溶组织梭菌胶原酶H 在大肠杆菌中的分泌表达801
总活性都为最大值。

甘氨酸添加时间过早过晚都会显著影响胶原酶的表达和分泌。

甘氨酸添加过早，菌体还未来得及表达胶原酶菌体的生长已经受到抑制；甘氨酸添加过晚，此时的菌体老化产胶原酶的能力受到很大限制，而且诱导后期菌体的生长速率的降低会造成菌体含有甘氨酸的比率降低从而严重影响胶原酶的分泌。

2.3.3 钙镁离子的添加对胶原酶分泌的影响　肽聚
糖是大肠杆菌细胞壁的主要成分，甘氨酸能促进周质蛋白分泌到培养基的主要原因是它能替换肽聚糖中的D -Ala ，从而影响肽聚糖的合成和交联[26]。

甘氨酸虽然促进了周质蛋白的释放，但同时菌体变得十分脆弱，这一点从菌体OD 600值的降低和CFU/OD （单位OD 600的菌落形成数）的下降可得。

钙离子是ColH 的辅因子，它能增加胶原酶的稳定性，同时对大肠杆菌细胞也有稳定作用[27-28]。

研究报道无论何种因素造成菌体的自溶，向培养基中添加镁离子都会减弱这种因素对菌体自溶的效果[29]。

培养基中添加不同浓度的钙镁离子对胶原酶分泌的影响，结果如图7和图8所示。

钙镁离子的添加
都减弱菌体自溶性，表现在OD 600值的升高，但是添加钙离子抑制了胶原酶的分泌，同时未能促进胶原酶表达；添加镁离子促进胶原酶的分泌，同时也促进胶原酶表达，培养基中添加10 mmol/L 氯化镁对胶原酶表达和分泌的促进效果最好。

钙镁离子对胶原酶分泌的不同效果可能是，钙离子对外膜起主要稳定作用，阻碍周质中胶原酶向培养基中的释放，而镁离子可能对内膜的稳定作用更明显，对周质中胶原酶向培养基中的释放阻碍作用很小。

添加10 mmol/L 钙离子或镁离子，诱导24 h 胶原酶的分泌率（前者为57.8%，后者为80.7%）的差异可以证明我们的猜测。

钙离子能促进环糊精葡萄糖基转移酶（分子量66 kDa ）在大肠杆菌分泌，本文结果表明钙离子不能促进ColH （分子量116 kDa ）分泌的原因，这种差异可能是因为分子量的不同造成的，但仍需要大量的实验证明[27,30]。

2.4 诱导时间对胶原酶分泌的影响
在最优诱导条件下，进行两组实验（实验组在培
养基中添加甘氨酸和镁离子，对照组不加）考察诱导时间对大肠杆菌胶原酶分泌的影响，结果如图9所
E x t r a c e l l u l a r a c t i v i t y /(U ·m L −1)
T o t a l a c t i v i t y /(U ·m L −1)
00.51.01.5
0.5
1.0
1.5
02.55.07.510.012.5
02.55.07.510.012.5
02.55.07.510.012.502.55.07.510.012.5
Added time/h
(a)
Added time/h
(b)
Inducing time/h:
12;
−24
−图 6 甘氨酸添加时间对ColH 表达和分泌的影响Fig. 6 Effect of time of glycine added on ColH expression and secretion
E x t r a c e l l u l a r a c t i v i t y /(U ·m L −1)
0.20.40.60.8T o t a l a c t i v i t y /(U ·m L −1)
0.5
1.0
1.505
10203005
102030
05
10203005
102030
c ca 2+/(mmol·L −1)
c ca 2+/(mmol·L −1)
(a)
(b)
Inducing time/h:12;−24
−图 7 钙离子对ColH 表达和分泌的影响
Fig. 7 Effects of calcium ion on ColH expression and secretion
802
华 东 理 工 大 学 学 报（自 然 科 学 版）第 48 卷
示。

在培养基中添加甘氨酸和镁离子，虽然在诱导开始阶段抑制胶原酶的合成，但是诱导后期会促进胶原酶的表达，可能是胶原酶分泌到培养基会降低对菌体的负荷促进胶原酶的继续合成。

在诱导20 h 时，实验组的胞外活性和总活性都到达最大值，分别为0.68 U/mL 和0.85 U/mL ，其中胞外活性是优化前的38.1倍。

3 结　论
（1）利用OmpA 信号肽实现了在大肠杆菌中分
泌表达高分子量的ColH 。

（2）信号肽在N 端的位置影响分泌能力，N 端多余的氨基酸片段显著降低信号肽引导的胶原酶的分泌功能。

（3）通过优化诱导表达条件，使胞外胶原酶活性达到0.68 U/mL ，是优化前的38.1倍。

（4）培养基中添加钙镁离子都能促进大肠杆菌
的生长，但只有镁离子能促进ColH 的分泌。

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1.0
1.5
T o t a l a c t i v i t y /(U ·m L −1)
0.5
1.0
1.5
2
5
1020025
1020
025
10200251020
c mg 2+/(mmol·L −1)
c mg 2+/(mmol·L −1)
Inducing time/h:12;−24
−(a)
(b)
图 8 镁离子对ColH 表达和分泌的影响
Fig. 8 Effects of magnesium ion on ColH expression and secretion
Total activity;Extracellular activity;
Intracellular activity
E n z y m e a c t i v i t y /(U ·m L −1)
(a) Without glycine and magnesium
Inducing time/h
E n z y m e a c t i v i t y /(U ·m L −1)
(b) With glycine and magnesium ion Inducing time/h
图 9 诱导时间对ColH 表达和分泌的影响
Fig. 9 Effect of inducing time on ColH expression and secretion
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804华 东 理 工 大 学 学 报（自 然 科 学 版）第 48 卷
第 6 期赵钱山，等：溶组织梭菌胶原酶H在大肠杆菌中的分泌表达805
Secretory Expression of Clostridium histolyticum Collagenase H in
Escherichia coli
ZHAO Qianshan1, LIU Xiao2, LI Suxia1
(1. State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai
200237, China; 2. Shanghai Yaxin Biotechnology Co. Ltd, Shanghai 200231, China)
Abstract: Clostridium histolyticum collagenase H (ColH) recognizes the Y-Gly of collagen and hydrolyzes it into small peptides. The high molecular weight ColH (116 kDa) secreting strain was successfully constructed by fusing colH gene with signal peptide sequence of outer membrane protein A. In this study, we found that the secretion of ColH was affected by the position of the signal peptide at the N-terminal, and the presence of excess amino acid fragments at the N-terminal significantly reduced the secretion function of the signal peptide-guided collagenase. Orthogonal experiment and single factor experiment were used to optimize the induction conditions and medium additives to improve the secretory expression. Under the conditions of inducing temperature of 25 ℃, the cell density (OD600) of 0.9, IPTG concentration of 0.1 mmol/L, liquid volume of 20%, magnesium ion concentration of 10 mmol/L, and 2% glycine were added at 2.5 h after induction, the highest extracellular collagenase activity was 0.68 U/mL after induction for 20 h, which was 38.1 times of that of before optimization, and the secretory expression level was remarkably increased. Glycine added into the culture medium is a common strategy to promote the secretion of recombinant protein. Experimental results demonstrated that the amount and time of glycine added after induction showed the greatest influence on the secretion of collagenase. The addition of calcium and magnesium ions in the medium can promote the growth of E.coli. The results also showed that only the addition of magnesium ion can promote the secretion of ColH.
Key words: Clostridium histolyticum collagenase H；orthogonal experiment；signal peptide；magnesium ion；secretory expression。