不同禽源和不同毒力新城疫病毒对鸭的感染性

不同禽源和不同毒力新城疫病毒对鸭的感染性
刘梅;程旭;戴亚斌;韦玉勇;周生;潘志明;徐玲霞;焦新安
【摘要】为探讨不同禽源和不同毒力的新城疫病毒(NDV)株对鸭的感染性、致病性以及鸭在家禽新城疫(ND)流行中的意义,本研究选用7个NDV株进行了雏野鸭的人工感染试验,对感染鸭的临床症状、增重、抗体反应、排毒以及组织器官中病毒分布进行了观察.结果表明,鸭源强毒株JSD0812和标准强毒株F48E8对鸭具有强的致病性,感染鸭的发病率和死亡率高达100%,病毒广泛分布于感染鸭的多种组织器官中.鸽源强毒株JSP0204、鸡源强毒株JSC0804、鹅源强毒株JSG0210以及疫苗毒株Mukteswa和La Sota对鸭不具有致病性.感染鸭未出现临床症状,生长发育也未受到影响.它们在鸭体内存在时间也较短.所有感染鸭均有排毒现象,排毒时间和排毒途径因病毒株毒力不同而异.结果表明NDV在进化过程中对鸭的致病性有逐渐增强的趋势.
【期刊名称】《中国预防兽医学报》
【年(卷),期】2010(032)008
【总页数】5页(P586-590)
【关键词】新城疫病毒;感染性;排毒;致病性
【作者】刘梅;程旭;戴亚斌;韦玉勇;周生;潘志明;徐玲霞;焦新安
【作者单位】中国农业科学院,家禽研究所,江苏,扬州,225003;中国农业科学院,家禽研究所,江苏,扬州,225003;中国农业科学院,家禽研究所,江苏,扬州,225003;中国农业科学院,家禽研究所,江苏,扬州,225003;中国农业科学院,家禽研究所,江苏,扬
州,225003;扬州大学,生物科学与技术学院,江苏,扬州,225009;中国农业科学院,家禽研究所,江苏,扬州,225003;扬州大学,生物科学与技术学院,江苏,扬州,225009
【正文语种】中文
【中图分类】S852.65
由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的新城疫(ND)是一种急性、高度传染性疫病，主要侵害鸡和火鸡，亦可感染其它禽类及人类，是禽类重要疫病之一，世界动物卫生组织(OIE)将其列为应呈报疫病，我国将其列为一类动物传染病。

该病自1926年首次报道以来，至今仍在世界各地流行，时有爆发，给养禽业造成了严重的损失[1]。

NDV为单股负链、不分节段的RNA病毒，属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)副粘病毒亚科(Paramyxovirinae)腮腺炎病毒属(Avulavirus)[2]。

NDV的分布和感染谱广泛，可感染50个鸟目中27个目236种以上的禽类，但对不同宿主的致病性差别较大。

一般认为，鸡、火鸡等“经典”宿主感染后表现出较高的发病率和死亡率，其它禽类很少发病，尤其是水禽对其抵抗力较强[1]，即使感染强毒也不表现明显临床症状。

但综观ND流行历史，NDV感染并致病的宿主范围呈逐步扩大趋势。

1997年以来我国各地鹅群先后爆发ND，给养鹅业造成了很大的经济损失[3-4]。

近年来，鸭NDV感染与发病的报道也有逐渐增加的趋势，并从发病和临床健康的鸭体内分离到大量毒力各异的NDV株[5-7]；其中一些分离株对鸭具有较强的致病性[8-10]，这给ND防控工作带来了新的困难。

本研究采用不同禽源和不同毒力NDV株进行鸭的人工感染试验，研究它们对鸭的致病性，探讨鸭在家禽ND 流行中的作用，旨在为家禽ND综合防控提供实验依据。

1 材料和方法
1.1 病毒株、抗原和血清 NDV强毒株JSP0204、JSC0804、JSG0210和
JSD0812分别分离自发病鸽、鸡、鹅和鸭群，由本研究所鉴定和保存。

它们的毒
力鉴定结果见表1。

中国标准强毒株F48E8、中等毒力疫苗毒株Mukteswar(Ⅰ系)、弱毒疫苗毒株La Sota(Ⅳ系)由本研究所保存。

上述病毒株种毒用10日龄SPF鸡胚传代复壮，测定各病毒株鸡胚尿囊液的ELD50后备用。

NDV抗原和阳性血清购自青岛易邦生物工程有限公司。

1.2 SPF鸡胚 SPF种蛋购自山东无特定病原鸡实验种鸡场[生产许可证号：
SCXK(鲁)2009 0005]。

1.3 实验动物与分组 1日龄雏野鸭(Mallard，Anas platyrhynchos)由扬州市某养殖户提供。

人工饲养的种野鸭未经ND疫苗免疫。

14日龄时随机采集10只雏鸭
血清检测NDV抗体，结果均为阴性。

15日龄时选择外观健康的鸭进行分组试验。

表1 实验用新城疫病毒分离株的毒力鉴定Table 1 Identification of virulence of Newcastle disease virus isolates used in this study注：MDT：10日龄SPF
鸡胚平均死亡时间；ICPI：1日龄SPF雏鸡脑内接种致病指数；IVPI：6周龄SPF 鸡静脉接种致病指数。

Note:MDT:mean death time in 10-day old embryonated SPF chicken eggs;ICPI:intracerebral pathogenicity index in day-old SPF chickens;IVPI:intravenous pathogenicity index in six-week old SPF chickens.GenBank登录号Accession No.GQ168928 GQ168925
GQ168927 GQ849007病毒株Strain毒株来源Isolated from MDT(h)ICPIIVPI
F蛋白裂解位点氨基酸序列Amino acid sequence at the F protein cleavage site JSP0204 JSC0804 JSG0210 JSD0812鸽Pigeon鸡Chicken鹅Goose鸭Duck 55.0 54.4 54.8 54.6 1.20 1.69 1.74 1.75 0.00 2.66 2.62 2.68序列Sequence 112K-R-Q-K-R-F117112R-R-Q-R-R-F117112R-R-Q-K-R-
F117112R-R-Q-K-R-F117
试验一：75只雏鸭逐只称重后，分为8组。

A1～A7组每组10只，A8组5只，各组鸭平均体重相近。

A1～A7组分别接种7个不同禽源的NDV株，腿部肌注接种，接种剂量为5×108ELD50/只；A8组为对照组，腿部肌注同体积的灭菌生理盐水，试验期为28 d。

自接种病毒后第1 d开始，每隔2 d采集各组鸭的咽喉拭子和泄殖腔拭子，直至接种病毒后第27 d。

每次每组随机选择4只鸭。

每隔7 d对实验鸭进行采血并分离血清，每次每组随机选择5只鸭。

详细观察记录试验鸭的发病和死亡情况。

逐只剖检死亡鸭，观察病变，并无菌采集肠、肝、脾、胰等组织样品。

采集的拭子、血清和组织等样品均置-20℃冻存。

实验结束后，对所有存活鸭进行称重，根据试验鸭的初始体重和终末体重计算平均日增重。

试验二：14只雏鸭分为7组(B1～B7)，每组2只，分别接种7个不同禽源的NDV株，接种病毒途径和剂量及样品采集和实验过程与试验一相同。

1.4 病毒分离分别将各组每次采集的同种拭子样品混合。

同组同种组织样品混合后研磨，按1∶4(v/v)的比例加入灭菌生理盐水，冻融3次。

上述拭子和组织样品15 000 r/min离心5 min，无菌处理后，经尿囊腔接种9日龄～10日龄SPF鸡胚，每个样品接种2枚胚(0.2 mL/胚)，接种后，连续观察5 d。

收集24 h～120 h内死亡及孵化结束时的存活胚尿囊液。

对于接种后24 h内胚死亡的样品，则再次接种。

检测各代尿囊液血凝性，若结果为阴性，则继续传代，直至第3代。

1.5 血凝试验(HA)和血凝抑制(HI)试验 HA和HI试验均参照文献[11]进行，分别以鸡红细胞和鸭红细胞为指示细胞。

1.6 数据统计分析平均日增重和抗体滴度采用Fisher氏保护最小显著差数测验(PLSD)法比较。

2 结果
2.1 不同NDV株对鸭的致病性各组鸭在试验期间的发病率和死亡率统计结果见
表2。

A4组鸭接毒后第2 d开始发病，第4 d、5 d、6 d各死亡3只、5只、2只。

A5组鸭于接种病毒后第2 d开始发病并死亡1只，第3 d、4 d、5 d各死亡3只、4只、2只。

上述两组的发病率和死亡率均为100%。

其它各组鸭表观正常，未见发病与死亡。

A4和A5组鸭接种病毒后的临床症状和病理变化基本一致。

除A5组个别鸭未表
现明显症状即死亡外，其余鸭主要表现为食欲下降或废绝，排白色稀粪，精神萎顿，站立不稳，最后衰竭而死。

A4组部分鸭于接种病毒后第3 d开始出现单腿或双腿麻痹现象，第5 d开始表现出扭头、转圈等神经症状。

A4和A5组鸭的病程均较短，而A5组比A4组病程更短，死亡更快。

病死鸭病变主要表现为：脑膜充血、出血，脑水肿、充血；脾脏肿大或萎缩，出血并有大小不等的灰白色坏死灶；胰脏充血、出血，有灰白色坏死灶；食道粘膜有灰白色坏死点；肠壁肿胀，肠黏膜出血，尤以十二指肠和空肠前部肠粘膜最为严重。

从病死鸭组织样品中均可分离出病毒，其血凝性可被NDV阳性血清抑制。

除A4和A5组外，其余各组鸭的平均日增重见表2。

统计分析显示各组间均无显
著差异(p>0.05)，表明这些病毒株感染对鸭的生长发育没有影响。

上述结果表明，鸭源JSD0812株和标准强毒F48E8株对鸭均具有很强的致病性，根据病程的长短，F48E8株的致病性高于JSD0812株。

其它毒株对鸭均无致病性。

2.2 不同NDV株诱导的抗体反应除A4和A5组外，其余各组鸭的HI抗体水平
检测和分析结果表明，各组鸭接种病毒后均可产生一定水平的抗体，但抗体水平有一定程度的差异。

虽然有时一些组间差异未达到显著水平(p>0.05)，但总体结果
显示，A2和A3组的抗体水平较高，A6和A7组次之，A1组最低。

空白对照组
抗体一直为阴性(图1)。

表2 实验鸭的发病率、死亡率和平均日增重Table 2 Morbidity,mortality and mean daily weight gain of experimental infected ducklings注：1.同列数据
肩标字母相同者表示差异不显著(p>0.05)。

2.nd：实验鸭已于试验结束前死亡，
未统计。

Note:1.Data within each column with the same superscript letter are not significantly different(p>0.05).2."nd"means not done,since the experimental ducklings in the groups died before the end of the experiment.组别GroupA1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8接种毒株Strain JSP0204 JSC0804 JSG0210 JSD0812 F48E8 Mukteswar La Sota Saline发病率Morbidity(%)(发病数/接毒
数)0(0/10)0(0/10)0(0/10)100(10/10)100(10/10)0(0/10)0(0/10)0(0/5)死亡率Mortality(%)(死亡数/接毒
数)0(0/10)0(0/10)0(0/10)100(10/10)100(10/10)0(0/10)0(0/10)0(0/5)平均日增重Mean daily weight 23.44±0.94a 23.13±1.15a 23.00±2.89a nd nd
22.54±1.21a 22.29±0.79a 23.29±0.63a
2.3 鸭感染不同NDV株后的排毒情况感染鸭咽喉和泄殖腔拭子病原分离结果表明，鸭感染不同NDV株后均可排毒，但排毒时间和排毒途径因毒株而异(表3)。

在排毒时间方面，虽然A4和A5组于接种病毒后第6 d全部死亡，但总的结果显示这两组的排毒时间较长，而A5组在感染后第1 d(24 h)即有病毒排出。

A1、A2、A3和A6组排毒时间相对较短，仅于感染后第3 d有病毒检出。

在排毒途径方面，A2～A5组的咽喉和泄殖腔拭子中均可检出病毒，而A1、A6组仅在泄殖腔拭子中检出病毒。

A7组于感染后第3 d和第7 d分别在泄殖腔拭子和咽喉拭子中检出病毒。

空白对照组所有拭子样品病毒检测结果均为阴性。

表3 实验鸭咽喉和泄殖腔拭子样品病原分离结果Table 3 The virus isolation from swab samples of experimental infected ducklings注：+：样品病原分
离结果为阳性；-：样品病原分离结果为阴性；nd：试验鸭已全部死亡，未检测。

下表同。

Note:"+"means virus isolation positive;"-"means virus isolation negative;"nd"means not done,all inoculated ducklings died.The same as in the following table.A1JSP0204 A2JSC0804 A3JSG0210------n d------n d
A4JSD0812 A5F48E8 nd nd nd nd nd nd A6Mukteswar A7La Sota A8Saline Laryngopharyngeal Cloacal Laryngopharyngeal Cloacal Laryngopharyngeal Cloacal Laryngopharyngeal Cloacal Laryngopharyngeal Cloacal Laryngopharyngeal Cloacal Laryngopharyngeal Cloacal Laryngopharyngeal Cloacal--------++-------+++++++++-+-+--------++++--------+--------- 2.4 不同NDV株在感染鸭组织中的分布至接种病毒后第5 d，第B4和B5组鸭已全部发病死亡，其余各组鸭均存活。

鸭组织器官中的病毒检测结果显示，在B4和B5组病死鸭的多种组织器官中均可检出病毒。

在接毒后第5 d，除第B6组的胰腺外，其余存活鸭的组织器官中均未检出病毒(表4)。

表4 接毒后第5 d新城疫病毒在鸭组织器官中的分布Table 4 Distribution of Newcastle disease virus in tissues of the ducklings on day 5 post inoculation组别Group脑心脏Heart肠接种毒株Strain inoculated JSP0204 JSC0804 JSG0210 JSD0812 F48E8 Mukteswar La Sota Brain肝脏Liver脾脏Spleen胰腺Pancreas肾脏Kidney肺脏Lung喉气管Laryngotrachea Intestine B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7- - - + + - -- - - + + - -- - - + + - -- - - + + - -- - - + + + -- - - + + - -- - - + + - -- - - + + - -- - - + + - -
3 讨论
本研究采用的不同禽源和不同毒力的NDV株进行鸭的人工感染试验，综合感染鸭的发病和增重情况等指标分析表明，鸭源JSD0812和F48E8株对鸭具有很强的致病性，感染鸭的发病率和死亡率均高达100%。

而感染鸭的病程显示，F48E8株对
鸭的致病性比JSD0812强。

其它病毒株对鸭则无致病性，感染鸭未表现明显临床症状，生长发育也未受到显著影响。

病毒感染诱导产生的抗体水平在一定程度上与病毒在机体内的复制效率相关。

病毒复制效率高，则诱导的抗体水平相应较高。

本研究中，除鸭源JSD0812和F48E8株外，其余毒株以鸡源JSC0804株和鹅源JSG0210株诱导的抗体水平较高，Mukteswar株和La Sota株次之，鸽源JSP0204株最低。

表明不同毒株在鸭体内的复制效率有一定程度的差异，这也部分反映它们对鸭感染性的强弱。

感染鸭排毒和组织器官中病毒分布检测结果也显示，不同NDV株对鸭的感染性差异。

从排毒情况分析，JSP0204、JSC0804、JSG0210、Mukteswar等4个病毒株的排毒时间均较短，在本实验设计的检测时段内，仅在接种病毒后第3 d检测到排毒现象。

据此推测，这些病毒株的排毒时间至多为3 d。

然而，JSC0804和JSG0210株可同时经咽喉和泄殖腔排毒，而JSP0204和Mukteswar株仅经泄殖腔排毒，表明前两个病毒株可在咽部和肠道中复制，而后两个毒株可能不能在咽部复制。

La Sota株的排毒检测结果似乎有些意外。

在感染后第3 d和第7 d分别从接种病毒鸭的泄殖腔拭子和咽喉拭子中检出病毒，而在此期间的感染后第5 d，在两种拭子和所有检测的组织器官中均未检出病毒。

因此，感染后第7 d咽喉拭子中病毒检测结果尚存有疑问，其排毒时间和排毒途径似应与JSP0204和Mukteswar两个病毒株一致。

感染鸭组织器官中病毒检测结果显示，至感染后第5 d，除感染Mukteswar株的鸭胰腺外，感染 JSP0204、JSC0804、
JSG0210、Mukteswar和La Sota株的鸭组织器官(尤其是肠道和咽喉)中均检测不到病毒，至于在此前一段时间除肠道和咽喉外的一些组织中是否有病毒存在本研究尚不能确定。

然而，即使它们能在这些组织中复制，持续时间也很短暂，基本上是呈一过性感染。

与上述5个病毒株不同的是，JSD0812株和F48E8株感染后的排毒时间较长，而F48E8株则在感染1 d(24 h)后即开始排毒，对鸭的感染性可能
比JSD0812株还要高。

它们广泛分布于感染鸭多种组织器官中，表明它们完全具备在鸭体内充分复制能力。

本研究结果显示，NDV对鸭的感染性和致病性与其毒力总体上呈正相关。

然而，虽然JSC0804、JSG0210、JSD0812和F48E8同为强毒株，但它们对鸭的感染性和致病性仍有差异。

究其原因，除可能存在的不同毒株受体特异性及其感染后机体干扰素介导的抗病毒作用等方面的差异外[12-13]，病毒毒力的差异可能也是一个
重要的因素。

由于鸭本身对NDV感染具有一定的抵抗力，NDV的毒力可能需要
达到一定“阈值”才能赋予其在鸭体内充分复制并致病的能力，而现行的传统NDV毒力评判方法尚不足以区分强毒株间毒力上的差异。

需要说明的是，鸽源JSP0204株对于鸽子为强毒，但用传统的毒力鉴定方法鉴定为弱或中等毒力毒株。

从本实验结果分析，该毒株对鸭的感染能力比Mukteswar和La Sota两个病毒株还要弱。

值得注意的是，F48E8株和JSD0812株对鸭表现出很强的致病性。

F48E8株是国内在1948年从鸡分离到的强毒株，对鸡、鹅、鸭均有很强的致病性，但在此后的几十年时间内，我国并未见鹅、鸭群大规模发生ND的报道，其原因尚不明了。

JSD0812株则是最近从产蛋量锐减并伴有发病和死亡的产蛋鸭群分离到的一个病
毒株，该病毒株对鹅和鸡也表现为强致病性[11,14]。

鉴于近年来鸭ND病例不断
增多的情况，无论这些病原的来源和遗传变异情况如何，NDV在进化过程中对鸭
的感染和致病能力可能正在逐渐增强
虽然不同NDV株对鸭的感染性和致病性存在一定程度的差异，但它们均可在鸭体内复制并排毒，进一步证实鸭在NDV传播和流行过程中起着重要作用。

因此，只有积极采取多禽种同步防控的策略，才能真正有效地控制ND的发生和流行。

【相关文献】
[1]Saif Y M,Fadly A M.Diseases of poultry[M].12th ed,Ames,Iowa:Blackwell
Publishing,2008,75-115.
[2]International Committee on Taxonomy of Viruses.ICTVdB index of
viruses[EB/OL]./ICTVdb/Ictv/index.htm.
[3]丁壮，王承宇，向华，等.鹅副粘病毒分离株生物学特性的研究[J].中国预防兽医学报，2002，
24(5)：390-391.
[4]刘梅，李文良，戴亚斌，等.鹅源Ⅰ型禽副粘病毒JG97株F基因的分子特征分析[J].中国预防兽
医学报，2008，30(1)：17-21.
[5]Higgins D A.Nine disease outbreaks associated with myxoviruses among ducks in Hong Kong[J].Trop Anim Health Prod,1971,3(4):232-240.
[6]程龙飞，傅光华，黄瑜，等.半番鸭源禽1型副粘病毒FM01株的分离鉴定与F蛋白基因分析[J].中国预防兽医学报，2006，28(5)：499-502.
[7]宋战胜，王晶钰，赵伟，等.鸭源新城疫病毒的分离鉴定[J].动物医学进展，2007，28(5)：22-25.
[8]陈少莺，胡奇林，陈仕龙，等.鸭副粘病毒的分离与初步鉴定[J].中国预防兽医学报，2004，
26(2)：118-120.
[9]黄瑜，李文扬，程龙飞，等.番鸭副粘病毒Ⅰ型的分离鉴定[J].中国预防兽医学报，2005，27(2)：148-150.
[10]刘梅，韦玉勇，戴亚斌，等.一株鸭源新城疫病毒强毒株的分离与初步鉴定[J].中国动物传染病
学报，2010，18(2)：67-71.
[12]GB 16550-2008.新城疫诊断技术[S].北京：中国标准出版社，2009.
[13]Ito T,Kawaoka Y,Kameda C,et al.Difference in receptor specificity between newcastle disease virus originating from chickens and waterfowl[J].J Vet Med Sic,1999,61(8):951-953.
[14]Park M S,Garcí a-Sastre A,Cros J F,et al.Newcastle disease virus V protein is a determinant of host range restriction[J].J Virol,2003,77:9522-9532.
[15]刘梅，周生，戴亚斌，等.不同禽源新城疫病毒强毒株对鹅的致病性研究[J].中国家禽，2010，32(4)：26-29.。