益气活血方体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化

益气活血方体外诱导大鼠骨髓间充质
干细胞向神经细胞分化
张运克1,车志英2
(1.河南中医学院第一附属医院,河南郑州450000;2.河南中医学院,河南郑州450008)
摘　要:目的:探讨益气活血方体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的作用。

方法:采用密度梯度离心法分离获取S D 大鼠骨髓单个核细胞层,将细胞经过传代培养使细胞得到扩增和纯化,用流式细胞仪鉴别。

用益气活血方联合二甲亚砜(DMS O )、丁羟茴醚(BH A )和β-巯基乙醇(BME )等对碱性成纤维生长因子(bFG F )预诱导的MS Cs 诱导向神经细胞定向分化。

用免疫细胞化学方法检测诱导1h 、3h 后巢蛋白(nestin )的表达,诱导5h 后神经元特异性烯醇化酶(NSE )和胶质纤维酸性蛋白(G FAP )的表达,鉴定分化细胞的类型,并计数MS Cs 分化的各种细胞的阳性率。

结果:益气活血方体外诱导MS Cs 1h 、3h 后分化为nestin 免疫细胞阳性率为45.5%±3.4%和38.3%±1.8%,诱导5h 后NSE 和G FAP 免疫细胞阳性率为82.3%±2.4%、12.1%±1.6%,与对照组相比有极显著性差异(P <0.01)。

结论:成年大鼠骨髓MSCs 可以在体外培养扩增,益气活血方有体外定向诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的作用。

关键词:大鼠;骨髓间充质干细胞;巢蛋白;神经元特异性烯醇化酶;胶质纤维酸性蛋白;益气活血方中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1002-2392(2008)01-0022-04基金项目:本课题得到河南省自然基金(0611040400)、河南省高校杰出
科研人才创新工程项目(2007KY CX 007)的资助。

收稿日期:2007-09-28 修回日期:2007-12-15
作者简介:张运克(1966-),男,副主任医师,副教授,医学博士,中国中
医科学院博士后,硕士研究生导师,从事中医药防治神经系统疾病的临床与实验研究。

骨髓间充质干细胞((Mesenchymal S tem CellS ,MSCs)属多能干细胞,具有高度自我更新能力和多向分化潜能,体内移植后不良反应较弱,是细胞替代治疗的理想种子细胞,MSCs 能够穿越血脑屏障,促进大小
胶质细胞的形成[1]
,其向神经细胞分化潜能为神经系统损伤后的修复提供了一个新的干细胞来源。

中药及提取物如黄芪、龟板、丹参等可以诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞等诱导分化,但关于中药复方诱导分化的报道较少。

笔者既往的研究证明了益气活血方补阳还五汤具有抑制脑缺血及再灌注模型细胞凋亡、抗自
由基等作用[2,3]
,但关于本方对干细胞分化的影响,尚无相关的报道。

本实验研究旨在探讨益气活血方补阳还五汤对骨髓间充质干细胞向神经细胞进行体外诱导分化,为中药复方联合干细胞移植治疗神经系统疾病的临床应用奠定实验基础。

1　材料
1.1　实验动物　清洁级S D 大鼠,1～2个月龄,雌雄
各半,体重100g ～150g ,共20只,购自河南省实验动物中心。

1.2　药物与试剂　D MEM 培养基,G ibc o BR L 公司提供;胎牛血清,H yclone 公司提供;淋巴细胞分离液,上海恒信公司提供;胰蛋白酶,华美公司提供;Rabit -Anti -Rat nestin ,北京中山公司提供;Rabit -Anti -Rat NSE ,北京中山公司提供;Rattus -anti -Rat G F AP ,Ne o 2Marker 公司提供;H istostain -SP 试剂盒,北京中山公司提供;BH A 、D MSO 、BME ,S igma 公司提供。

实验药物由本院制剂室生产,选用当归60g 、桃仁30g ,川芎30g 加水720ml ,提取挥发油,备用。

药渣及提取液加入黄芪1200g 、赤芍60g 、地龙30g 、红花30g ,再加入920ml 水,煎煮1h ,滤过,药渣再加入8640ml 水,煎煮1h ,滤过,合并两次煎液,浓缩至600m l ,加入挥发油及吐温-803m l ,混匀,装瓶进行高压高温消毒。

每毫升相当于生药2.4g 。

1.3　主要实验设备和仪器　净化工作台,苏州净化集团安泰公司生产;MC O175C O2培养箱,日本S A NY O 生产;O LY MPUS IX -71倒置显微镜,日本O L Y MPUS 生产;荧光显微镜,日本O LY MP US 生产;双重纯水蒸馏器,上海亚荣生化仪器厂生产。

　方法　获取骨髓　%水合氯醛(3Π)腹腔注射
22.1100.m l k g
麻醉S D大鼠,75%酒精消毒下肢及周围皮肤。

无菌分离下肢皮肤和肌肉,充分暴露胫骨和股骨,离体剪断两端,放置于无菌培养皿中。

采用同样方法取另一侧下肢骨。

在净化工作台中,分别剪开股骨和胫骨两端,暴露髓腔。

用5ml注射器吸取L-D MEM培养液冲洗髓腔,收集于15ml离心管内。

2.2　分离骨髓M NCs　参照文献[4]采用密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞(mononuclear cells,M NCs):大鼠骨髓以1:1等体积缓慢加入比重为1.077gΠcm3的淋巴细胞分离液上层。

2000rpmΠm i n水平离心25min,小心吸取单个核细胞层。

加入3Π5倍体积的P BS缓冲液, 1500rpmΠmin、15min离心洗涤2次,弃上清。

获得的M NCs经苔盼蓝染色、光学显微镜下计数活细胞,调整至适当细胞密度接种于T-75培养瓶。

2.3　细胞培养和传代扩增　以1.0(106Πm l的密度接种于含10%胎牛血清的DME M培养液中(T-75培养瓶),置于37℃、体积分数为5%C O2、饱和湿度的CO2孵箱培养。

5d后更换培养液,弃去未贴壁细胞,以后每3d全量换液,同时观察记录倒置显微镜下细胞的形态变化。

待贴壁细胞完全融合后,0.25%(质量体积比)胰酶消化传代,每3d全量换液。

经过不断地传代使MSCs扩增和纯化。

2.4　MSCs的传代和扩增　贴壁细胞完全融合后,参照张化彪等[5]的方法:用0.25%(质量体积比)胰酶消化传代,消化时间为2min～3min,以1:2或1:3传代培养,经过不断地传代使MSCs得到扩增和纯化。

2.5MSCs表面标志鉴定　参见张化彪等[5]的MSCs鉴定方法及结果,对第10代的MSCs应用流式细胞仪检测C D90、CD106、C D45、C D34等。

2.6　体外定向诱导MSCs向神经细胞分化　将第10代的细胞悬液接种于直径40mm塑料培养皿中,细胞生长达80%至90%融合时开始进行诱导分化。

根据W oodbury等的诱导方法进行改良:实验组加入预诱导液为D MEM培养基/体积分数为10%的F BS/10ngΠL bFG F培养24h,益气活血方组而后换为含诱导液2% D MSO、200μm olΠL BH A、5mm olΠL BME、35gΠL益气活血方诱导5h。

对照组换为含诱导液2%DMS O、200μm olΠL BH A、5mm olΠL BME诱导5h。

诱导过程中在倒置显微镜下观察细胞形态变化。

2.7　MSCs分化的神经细胞鉴定
分别在MS Cs诱导后1h、3h时进行神经干细胞标记物-巢蛋白(nestin)的免疫细胞化学染色,在诱导5 h结束时进行神经元特异性烯醇化酶(NSE)和胶质细胞酸性蛋白(G F)的免疫细胞化学染色,在显微镜下随机记数5个非重叠视野(×),分别计算、NS和G F阳性细胞数占细胞总数的比例,结果以均数加减标准差表示。

2.8　统计学分析
本实验结果均采用SPSS10.0进行统计分析。

Nestin、NSE、G F AP阳性细胞数一律采用±s表示,各组阳性细胞数的比较采用方差分析或t检验,以α=0.05作为检验水准。

3　结果
3.1　MSCs的增殖培养　分离的圆形骨髓单个核细胞于3d左右开始伸出突起,2d至6d时细胞增殖较缓慢,逐渐长为梭形,7d至14d时细胞增殖迅速,细胞呈漩涡状生长,并逐渐达到完全融合(见附图1)。

未贴壁细胞在连续换液过程中被不断清除。

原代细胞完全融合后进行传代,传代细胞于24h内贴壁,变为梭形,7d左右可达完全融合。

3.2　MSCs表面标志鉴定结果　经流式细胞仪检测,荧光三标的结果显示MSCs的均一性达到95%左右, CD90、C D106阳性,共同阳性率为95.04%;CD45、CD34呈阴性。

四个因子的标记率分别为:C D90阳性率95. 92%、CD106阳性率98.47%、C D45阳性率0.17%、CD34为8.49%。

3.3　MS Cs诱导分化为nestin、NSE和G FAP结果　见表1、附图3-5。

表1　MSCs诱导分化为nestin、
NSE和G FAP阳性细胞率(,%)
组别1hnes tin细胞3hnestin细胞NSE细胞G FAP细胞
对照组40.3±3.230.6±2.978.6±3.08.5±1.8
益气活
血方组45.5
±3.43338.3±1.83382.3±2.43312.1±1.63
注:同对照组诱导组比较,3P<0.05,33P<0.01。

对诱导1h、3h的细胞进行神经干细胞标志物nestin的免疫细胞化学鉴定。

诱导5h的细胞进行神经元细胞标志物-NSE、星形胶质细胞标志物-G F AP 的免疫细胞化学鉴定。

DA B显色棕黄色为阳性细胞,各种标记蛋白均为胞浆着色。

益气活血方组在1h、3h 诱导分化nestin细胞,诱导分化NSE细胞与氧化剂诱导组相比,有极显著性差异(P<0.01),在诱导分化G FAP细胞分别有极显著性差异(P<0.01)和显著性差异(P<0.05)。

4　讨论
临床上常用益气活血药物治疗神经系统疾病如脑梗塞、脑出血等,经多年的临床实践验证,该类药物具有确切的疗效,前期的研究证明:该类药物有抗脑缺血再灌注损伤、抗细胞凋亡、抗自由基损伤等多种作用,对神经系统损伤有修复作用。

应用干细胞移植治疗脑血管病等造成的神经系统损伤具有广阔的前景,从干细胞的诱导分化方面研究益气活血药物的作用,对中
AP
200nestin E AP
医基础理论及方剂学理论的创新将起到积极的作用。

MSCs 属多能干细胞,具有高度自我更新能力和多向分化潜能,体内移植后不良反应较弱,将成为细胞替代治疗的理想种子细胞,MSCs 能够穿越血脑屏障,促
进大小胶质细胞的形成[6]
,其向神经细胞分化潜能为神经系统损伤后的修复提供了一个新的干细胞来源。

MSCs 取代神经干细胞(neur on stem cell s ,NS Cs )移植治疗中风等脑血管疾病,克服了外源性NSCs 主要来源于胚胎组织,取材困难、来源受限,且面临着伦理、免疫排斥等多方面的问题而严重限制了其临床应用等缺点[7]。

而且骨髓资源丰富,骨髓MS Cs 易分离培养,并且在培养扩增中不会自动分化等,因而较NSCs 具有更广阔的应用前景。

应用抗氧化剂诱导大鼠MSCs 后,发现有较多的分化细胞表达神经元标记物NSE ,少量分化细胞表达胶质细胞标记物G F AP 。

在大鼠MSCs 诱导过程中应用免疫细胞化学法鉴定了诱导1h 及3h 时神经干细胞标记物巢蛋白(nestin )的表达情况,结果显示,诱导1h 后nesti n 的表达率较高,3h 后有所下降,表明神经干细胞在诱导过程中逐渐分化为神经细胞而数量逐渐减少。

应用益气活血方对MSCs 向神经细胞进行诱导分化,结果发现NSE 、G F AP 及nestin 的表达明显增强。

说明益气活血方具有体外诱导MS Cs 向神经细胞分化的作用。

近年来,国内学者进行了中药及提取物诱导MSCs 分化的研究,取得了一定的成果。

撒亚莲等[8]用川芎嗪诱导MSCs 15m i n 到3h ,细胞胞体逐渐增大,并伸出细长突起形似神经元样细胞;免疫组化显示NF -M 、NSE 、nestin 、MAP -2和G AP -43表达阳性,而G FAP 阴性,初步证实川芎嗪也可诱导MSCs 分化为神经元样细胞。

夏文杰等[9]用丹参酮ⅡA 诱导MS Cs 5h 后,胞体收缩,突起伸出;免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE 、NF -M 、nestin 表达阳性,G FAP 阴性,证实了丹
参酮ⅡA 具有类似作用。

刘金保等[10]
用当归诱导3h 后大部分MS Cs 转变为神经元样细胞,出现胞体和突起;免疫组化显示NSE 及nestin 呈阳性、G FAP 阴性。

中风属本虚标实之证,气血为本,血瘀为标,气虚血瘀证是中风病的主要病证。

中风急性期气血功能失常,气虚血瘀,脑髓受损,病理表现为神经细胞发生坏死或凋亡,而NSCs 的增殖、迁移和分化调控机制受损,导致神经功能缺损。

NSCs 的激活和内源性修复机制的调控,与气血密切相关,均有赖于气血功能的协调。

益气活血法可能参与诱导NSCs 的增殖与分化,从两个途径发挥作用。

一是表现出益气扶正功效,以发挥正气抗邪护脑作用,调控内源性修复机制。

二是通过活血化瘀等功效,祛邪除害,加强神经细胞对缺血、缺氧、
神经化学毒素的耐受性,抗缺血神经元的凋亡等,改善
不利于NS Cs 生长的有害环境,避免邪气亢盛损伤脑髓。

本实验应用益气活血方诱导MSCs 向神经细胞分化,特别是向神经干细胞的分化,通过神经干细胞的进一步分化发挥脑保护作用。

5　附图
图1　MSC 呈漩涡状生长达到融合(×200)
图2　MSCs 诱导5h 后的细胞呈神经元样形态(×200)
图3　诱导1h 后细胞表达nes tin
情况(DA B 显色,×200)
图　诱导5后细胞表达NS 情况(D B 显色,×)
4h E A 200
图5　诱导5h 后细胞表达G FAP
情况(DA B 显色,×200)
参考文献:
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红景天苷对戊巴比妥钠所致小鼠
睡眠时间影响的实验研究
李尔逊,许光辉,李廷利3,郭冷秋,黄莉莉
(黑龙江中医药大学中药药理教研室,黑龙江哈尔滨150040)
摘　要:目的:观察红景天苷对戊巴比妥钠致小鼠睡眠时间的影响。

方法:本实验采用延长戊巴比妥钠所致小鼠睡眠时间的实验,研究红景天苷镇静催眠的药理作用。

翻正反射消失即睡眠开始,实验指标为睡眠潜伏期和睡眠持续时间。

结果:红景天苷能明显缩短戊巴比妥钠(55mg Πkg ,i 1p 1)所致小鼠睡眠的睡眠潜伏期和显著延长睡眠持续时间。

结论:红景天苷具有明显的镇静催眠作用,且量效关系显著。

关键词:红景天苷;镇静;催眠中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1002-2392(2008)01-0025-02收稿日期:2007-11-10 修回日期:2007-12-30
作者简介李尔逊,男,为黑龙江中医药大学3级中西医结合临床医
学专业本科学生。

3通讯作者李廷利教授,博士生导师。

红景天苷(4-hydroxy -phenethyl )-β-D -gluco 2pyranoside ,C14H 20O7:300130)是传统中药红景天的药理活性成分。

红景天可以调节神经系统,具有消除抑郁、提高工作效率、耐缺氧、抗辐射和消除疲劳等作用,并且可预防高原病和改善睡眠[1,2]。

作为一种具有“适应原”作用的传统中药,红景天已被许多在特殊环境
下活动的人员,如潜水员、航天员、飞行员和登山运动员等,用于增强机体抵抗恶劣环境的能力[3,4]。

此外,研
究发现红景天可以延长人的生命。

研究表明红景天的
的主要活性成是红景天苷[5]。

本研究的目的是通过实
验观察红景天苷对戊巴比妥钠所致小鼠睡眠时间影响。

1　实验材料和方法
111　药物　地西泮(DZP ,210mg Πkg )作为阳性对照药物。

红景天苷(pur ity 98%)购于天津尖峰天然产物研究开发有限公司。

使用前,将药物用注射用水溶解。

1　动物　本实验使用体重～雄性小鼠(黑龙
江中医药大学实验动物中心)。

每只小鼠在实验中只
:200:122022g。