间接免疫荧光法与线性免疫印迹法联合检测抗核抗体的意义

间接免疫荧光法与线性免疫印迹法联合检测抗核抗体的意义
发表时间：2012-11-14T09:27:21.530Z 来源：《中外健康文摘》2012年第29期供稿作者：叶震璇李红梅刘水和
[导读] 抗核抗体（ANA）是一组将自身真核细胞的各种成分作为靶抗原的自身抗体的总称，主要存在于血清中。

叶震璇李红梅刘水和贵州省人民医院检验科 550002
摘要: 目的分析以间接免疫荧光法( indirect immunofluorescence，IIF) 筛查的抗核抗体( antinuclear antibody，ANA) 结果与线性免疫印迹法检测抗核抗体谱（ANAs）结果的不一致性，分析二者的相互关系方法分别采用IIF和LIA两种方法检测抗核抗体，将IIF-ANA 阳性/LIA-ANAs 阴性和IIF-ANA 阴性/LIA-ANAs 阳性患者分为自身免疫性疾病( AID) 组和非AID 组进行比较分析。

结果 189份标本中， IIF （+）/LIA 阴性（-）105份，占55.56%;IIF (-)/LIA(+)84份，占44.44%。

LIA+标本中，抗核糖核蛋白/史密斯抗原( nRNP/Sm)、抗史密斯抗原( Sm)、抗干燥综合征抗原A(SS-A)、抗Ro-52、抗干燥综合征抗原B(SS-B)、抗scl-70抗原、抗11-16多肽复合体抗原（PM-scl）、抗组氨酰tRNA 合成酶抗原( Jo-1) 抗体、抗着丝点抗体B亚型、抗可增殖抗原抗体、抗组蛋白抗体和抗线粒体抗体M2 亚型( AMA-M2)的阳性率分别为1.02% ～ 27.55% 。

AID 组及非AID 组IIF-ANA 阳性者荧光滴度分布均以1∶100～1∶320为主;荧光滴度为≥1∶1000时，2组间的差异有统计学意义(P＜0.05);AID组中IIF(+)/LIA(-)的荧光模式以细胞核均质型(H)为主，与非AID 组比较，差异有统计学意义(P＜0.01);而非AID 组的荧光模式以细胞核斑点型(S)为主，与AID 组比较，差异无统计学意义(P＞0.05). 结论 IIF 筛查ANA 容易导致AID 患者部分具有重要临床意义的ANA 特异性抗体漏检，而ANA 特异性抗体检测因其测定的抗体数量有限也容易导致AID 患者的ANA 漏检。

IIFANA筛查和LIA-ANAs 特异性抗体检测不能相互代替，对需要通过检测ANA 来排除AID 的患者标本应同时进行IIF-ANA 筛查和ANAs 特异性抗体的检测，以避免仅采用1 种方法进行检测时导致的AID 患者漏诊。

关键词：抗核抗体间接免疫印迹法线性免疫印迹法
抗核抗体（ANA）是一组将自身真核细胞的各种成分作为靶抗原的自身抗体的总称，主要存在于血清中。

ANA 在多种自身免疫病中均呈不同程度的阳性，如SLE、RA、MCTD、SS、等。

ANA 的检测在自身免疫疾病的临床诊断、鉴别诊断、评价疗效和预后估计中具有较大的意义，因此抗核抗体检测在自身免疫性疾病( AID) 诊疗过程中的地位无可替代［1］。

间接免疫荧光法(IIF) 是检测ANA 最重要的方法，被认为是ANA 检测的金标准［2］。

虽然IIF 检测ANA 不具有疾病特异性，但由于其测定的是针对细胞成分的总抗体，检测敏感度高，而被国内外众多实验室广泛采用，并作为ANA 检测的筛选实验［3］。

目前，国内外很多实验室为了节省检测成本，先行IIF 检测，出现阳性再进一步进行ANA 谱( ANAs)的测定。

而在临床工作中， IIF 检测ANA结果与ANAs 的特异性抗体检测结果并不完全符合。

因此，本研究探讨比较2 种检测方法结果不一致的情况，并探讨IIF与LIA两种检测方法之间的相关性。

对象和方法
对象
收集2011 年9月至2011 年12 月贵州省人民医院门诊和住院申请ANA 谱检测的标本189份，男78例，年龄1 ～ 90 岁，女131例，年龄2～78岁。

确诊AID 患者110例，确诊为其他疾病的非AID 患者88例。

所有AID 患者的诊断均符合国际相关学会的诊疗指南。

送检标本均为待检测患者清晨空腹静脉血，离心分离血清后同时采用IIF 法检测ANA 和线性免疫印迹法( lineimmunoassay，LIA) 检测ANA 谱15 项。

试剂和仪器
试剂：德国欧蒙公司提供的抗核抗体（马赛克）检测试剂盒、自身抗体检测试剂盒（谱15）、EUROLineScan 自动判别软件、EUROBlotMaster分析仪IIF 检测ANA: 采用HEp-2和猴肝细胞抗原片，以抗体滴度≥1 ∶100 为阳性。

LIA 检测ANAs: 采用LIA 检测ANAs 特异性抗体，包括抗nRNP /Sm、抗Sm、抗SS-A、抗Ro-52、抗SS-B、抗Scl-70、抗PM-Scl、抗Jo-1、抗着丝点蛋白B ( CENP B) 、抗增殖细胞核抗原( PCNA) 、抗核小体( Nukleosome) 、抗组蛋白( Histone) 、抗核糖体P蛋白( rRNP)、抗线粒体－ M2( AMA-M2) 抗体。

结果采用EUROLineScan 软件进行显色结果扫描分析。

统计学方法
采用SPSS17. 0 软件进行统计分析。

IIF与LIA检测结果符合率的比较、IIF(-)/LIA(+)组与IIF(-)/LIA(±)组以及IIF不同滴度组间不同疾病患者比例的比较均采用χ2检验。

2.结果
2.1 184例患者中，确诊为AID患者有110例，占59.78%，非AID患者79例，占40.22%。

确诊的AID患者中IIF（+）有57例，占51.81%，非AID患者IIF（+）48例（61.06%）。

在确诊的AID患者中LIA（+）有53例，占48.18%，非AID患者LIA（+）31例
（38.94%）。

2.2 AID 组及非AID 组LIA-ANAs 结果分析
在确诊的110例AID患者中LIA(+)有53例，占48.18%；79例非AID患者中LIA（+）有31例，占38.94%，两者比较差异有统计学意义(P<0.05).见表1。

表1 AID 组及非AID 组IIF(-)/LIA（+）结果分析（%）
2.3.AID组及非AID组中IIF（-）/LIA（+）患者15种自身抗体检测结果的比较
在84例IIF(－)/LIA(+)组中抗Ro-52、抗SSA、抗nRNP /Sm 、抗PM-Scl 抗体和抗PCNA抗体为主要阳性自身抗体，阳性率为分别为27.55%、25.51%、11.23%、11.23%和7.14%。

AID组与非AID组比较两者无统计学意义（P>0.05）。

见表2。

表2、AID组与非AID组各特异性抗原的比较
2.4 AID组及非AID组IIF（+）、LIA（-）患者荧光滴度分析
105例IIF(+)/LIA(－)患者的荧光滴度分布均以1∶100～1∶320为主，其阳性率分别为62.86%和30.47%。

而 AID 组荧光滴度1:320和
≥1∶1000占36.84%和12.28%，高于非AID 组22.91%。

2组的阳性率比较在1:320时差异无统计学意义(P＞0.05);而在荧光滴度为1:100和≥1:1000时差异有统计学意义(P＜0.05)。

见表3。

表3 AID 组及非AID 组IIF(+)/LIA(-)荧光滴度分析（%）
2.5 AID组及非AID组IIF（+）、LIA（-）患者荧光模式分析
AID 组中IIF(+)/LIA(－)者的荧光模式以混合核型、细胞核颗粒型（S）和细胞核均质型(H)为主，分别占36.84%、21.05%和17.54%，核均质组明显高于非AID 组4.17%(P＜0.01),而非AID 组的荧光模式以混合核型和细胞核颗粒型(S)为主，分别占33.33%和27.08%。

二者差异无统计学意义(P＞0.05)，见表4。

表4 AID组及非AID组IIF荧光模式分析（%）
讨论
IIF 法检测的ANA 是针对整个细胞核、细胞浆、细胞骨架、细胞周期等成分的总抗体，荧光核型的检测有助于相关自身抗原的确认，对临床有重要提示作用。

因而被许多实验室作为ANA 的经典筛选方法，但是该方法对AID没有特异性，且自动化程度低、操作标准化较难［4-5］。

在临床上，很多AID患者的血清IIF检测结果可见多种荧光染色模型的重叠，可能会导致漏珍。

随着技术的发展，许多ANAs 特异性抗体被逐渐认识［6］，其相应的靶抗原纯化技术不断提高， LIA操作简便，易自动化，判读方便，一次可检测多种特异性自身抗体，并且有较高的敏感性和特异性。

因此，作为ANA 检测“金标准”的IIF 法不断受到挑战。

在临床实际工作中，由于检测成本因素的影响，许多实验室仅对IIF 检测ANA 阳性的标本再做进一步的ANAs 特异性抗体检测，而在临床检测中，IIF检测ANA与LIA检测自身抗体结果不完全符合。

本次研究是对ANA与LIA两种检测方法的结果不一致性进行比较分析，探讨二者之间的关系。

本次研究发现两种检测结果并不完全一致，不能相互替代。

以HEp-2 细胞为抗原基质检测ANA 时，基质中的抗原存在分布不均、含量过低以及不同固定方法对特定抗原的破坏等因素的影响，可能导致部分特异性抗体的漏检。

如果实验室以IIF 作为ANA 初筛试验，初筛阳性后再进行ANAs 特异性抗体检测，容易造成一部分ANA 假阴性的患者中有重要临床意义的ANAs 特异性抗体漏检，导致AID 患者的误诊、漏诊［7］。

另一方面，由于LIA-ANAs 检测的特异性抗体数量极其有限，而AID 患者体内存在的自身抗体多达上百种，从理论上分析该方法不能代替针对总抗体的IIF-ANA 检测。

本研究的IIF ( -) /LIA（+）组84例患者中， AID患者有53例，占48.18%；非AID 31例，占38.94%，且差异有统计学意义。

该结果表明:在IIF( -) /LIA （+）患者中，存在大量AID 患者，当IIF 阴性时也有必要进行LIA-ANA 检测，ANA 的IIF 检测无法替代ANAs 的特异性抗体检测。

本研究的IIF( -) /LIA（+）组84份标本特异性抗体结果表明，IIF 检测ANA 可导致几乎所有种类的ANAs 特异性抗体漏检，其中最容易漏检的特异性抗体为抗Ro-52、抗SS-A，其次抗nRNP /Sm 、抗PM-Scl 抗体和抗PCNA抗体。

这些漏检的特异性抗体都具有重要的临床意义，因此，无论从不同检测方法的本质特征还是从实际临床意义来看，IIF-ANA 的检测不能完全代替LIA-ANAs 的检测［3］。

若仅用ANAs 特异性抗体检测结果来直接代替针对总抗体的ANA 筛查实验也会造成一部分患者ANA 假阴性结果，导致AID 患者的漏诊。

本研究中IIF-ANA( + ) /LIA-ANAs （-）组105例患者中AID 患者57例，占54.29%，高于非AID患者45.71%。

进一步的IIF 不同滴度与疾病关系结果表明，IIF 滴度1∶100、1∶320、≥1∶1000 各组中，AID 患者的比例均高于非AID 患者，在荧光滴度≥1∶1000时差异有统计学意义。

无论从临床意义还是不同检测方法的特征来看，LIA-ANAs 的特异性抗体检测不能完全代替IIF-ANA 的筛查。

因此，当自身抗体检测结果阳性，提示该患者是AID 的高危人群，应长期随访、密切观察，这也符合目前对于疾病早期发现、早期治疗的诊疗原则。

总之，ANAs 特异性抗体检测具有疾病特异度和较高的检测敏感度，而IIF-ANA 筛查具有抗体检测的全面性。

无论是从方法学角度还是实际临床意义分析，本次分析结
果均表明IIF-ANA 筛查和LIA-ANAs特异性抗体检测不能相互代替，临床应对需要通过检测ANA 来排除AID 患者的标本同时进行IIF-ANA的筛查和LIA-ANAs的检测，以避免仅用一种方法检测导致的AID 患者漏诊。

参考文献
［1］ Meroni PL，Schur PH. ANA screening: an old test with new recommendations ［J］. Ann Rheum Dis，2010，69:1420-1422. ［2］ Peterson LK，Wells D，Shaw L，et al. Novel method for quantitative ANA measurement using near-infrared imaging ［J］. J Immunol Methods，2009，349: 1-8.
［3］ Hoffman IE，Peene I，Veys EM，et al. Detection of specific antinuclear reactivities in patients with negative anti-nuclear antibody immunofluorescence screening tests［J］. Clin Chem，2002，48: 2171-2176.
［4］ Hahm D， Anderer U. Establishment of HEp-2 cell preparation for automated analysis of ANA fluorescence pattern ［J］. Cytometry A，2006，69: 178-181.
［5］ Sack U，Conrad K，Csernok E，et al. Autoantibody detection using indirect immunofluorescence on HEp-2 cells ［J］. Ann NY Acad Sci，2009，1173: 166-173.
［6］ Damoiseaux JG，Tervaert JW. From ANA to ENA: how to proceed ［J］. Autoimmun Rev，2006，5: 10-17. ［7］ Peene I，Meheus L，Veys EM，et al. Detection and identification of antinuclear antibodies ( ANA) in a large and consecutive cohort of serum samples referred for ANA testing ［J］. Ann Rheum Dis，2001，60: 1131-1136.184。