松花粉抗成纤维细胞复制性衰老的机制

松花粉抗成纤维细胞复制性衰老的机制（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）
【摘要】目的研究松花粉对衰老成纤维单细胞面积、β
半乳糖苷酶染色(SAβgal)阳性率、p16INK4A和p21CIP1表达以及细胞周期的影响。

方法以二倍体成纤维(2BS)细胞建立衰老细胞模型。

生物体视学法分析单细胞面积变化;免疫组化法测SAβgal阳性率;流式细胞术分析细胞周期;RT PCR法测定p16INK4A、p21CIP1基因mRNA表达量。

结果56代细胞出现典型的衰老细胞形态改变，同时SAβgal染色阳性率与G1期细胞比例均增高。

经松花粉处理后，衰老细胞的单细胞面积、SAβgal染色阳性率与G1期细胞比例均显著减少(P0.05);p16INK4A与p21CIP1mRNA的表达量均较衰老模型组明显下调(P0.05)。

结论松花粉具有改善细胞复制性衰老的作用，其分子机制可能与下调p16INK4A及p21CIP1基因mRNA的表达从而改善衰老细胞G1期阻滞有关。

【关键词】细胞衰老;松花粉;生物体视学;细胞周期;P16;P21 【Abstract】Objective To observe the effect of pine pollen on the surface area of single cell, the positive rate of
senescence associated (SA)βgalactosidase stain, the expressions of p16INK4A and p21CIP1 and the phase of cell cycle in 2BS cells. Methods The model of aging cell were made by 2BS cells. The surface area of single cell in each groups were analyzed by the method of biological stereology, the positive rate of SAβgalactosidase stain was determined by immunohistochemistry，the phase of cell cycle was measured by flow cytometry, and the expressions of p16INK4A,p21CIP1mRNA were detected by RT PCR. Results The 56PD cell showed the typical shape changes of aging, the positive rate of SAβgal and the rate of the phase of G1 were both greatly increased (P0.05). After the treatment of pine pollen, the surface area of single cell, positive rate of SAβgal and the rate of the phase of G1 were significantly decreased (P0.05), the expressions of p16INK4A and p21CIP1mRNA were both significantly down regulated (P0.05). Conclusions Pine pollen has the anti aging effect on aging 2BS cells, and its probable molecular mechanism may be related with down regulating the expressions of p16INK4A and p21CIP1mRNA and then improving the G1 phase blocking.
【Key words】Cell senescence;Pine pollen;Biological stereology;Cell cycle;p16;p21
诱发细胞衰老的主要刺激信号分为端粒和非端粒信号。

细胞衰
老受多组基因(如p19,p18,p14,MAPK,MEK，Ras,Raf等)调控。

细胞衰老的信号通路因细胞种类而异，在人胚肺二倍体成纤维(2BS)细胞中这两大类刺激信号主要诱导p53p21pRb和p16pRb途径。

其中，p16与p21是两条信号途径中的核心调控位点，也是目前的研究热点。

松花粉能提高衰老小鼠体内抗氧化酶的活性，抑制自由基的氧化损伤〔1〕;降低线粒体mtDNA4977在衰老细胞的突变率;提高衰老细胞端粒酶活性〔2〕。

本实验以衰老细胞的单细胞面积、β半乳糖苷酶染色(SAβgal)阳性率及细胞周期等指标对衰老细胞模型进行检测，选取p16及p21作为细胞衰老的分子检测指标，探讨松花粉通过作用于细胞内在基因调控机制抗衰老的可能性。

1 材料与方法
1.1 细胞培养、分组与处理人胚肺2BS细胞由北京生物制品研究所建株，27代引入。

细胞寿限为60～70代。

2BS细胞以含15%胎牛血清的MEM培养基于37℃,5%CO2温育箱中。

至30代时随机取8瓶作为年轻对照组，至56代随机取24瓶分成3组即：衰老模型组、松花粉中、高剂量组，每组8瓶，分别以单纯完全培养基，120与240 mg/dl的含花粉血清培养基培养8 d〔2〕，收集细胞。

参照文献〔3，4〕配制松花粉血清液，使其终浓度分别为120与240 mg/dl。

1.2 仪器与试剂FACScan 流式细胞仪(Beckman coulter);CMIAS病理图像分析系统(北航);PCR仪(ABI 9700);凝胶成像仪(Bio Rad)。

类标准胎牛血清(FBS)购自民海生物，MEM培养基(含非必需氨基酸、谷胺酰胺)为Invitrogen产品。

细胞衰老相关β半乳糖
苷酶染色试剂盒(上海杰美);cDNA试剂盒(Invitrogen，superscript Ⅲ逆转录试剂盒);流式细胞周期检测试剂盒(上海杰美)。

1.3 细胞形态观察及单细胞面积测定各组细胞相差显微镜下观察形态改变(×100)。

同时每瓶细胞高倍镜下随机取5个视野拍照(×400)。

采用CMIAS软件获得各组单细胞平均表面积值(μm2)。

1.4 细胞衰老相关β半乳糖苷酶(SAβGal)染色取每组细胞各1瓶，去培养液，以PBS冲洗两遍，按细胞SAβGal染色试剂盒说明染色后置于37℃,5%CO2温育箱中温育,6 h后观察细胞着色情况(衰老细胞染成蓝绿色)。

计数各组衰老阳性表达细胞百分比。

1.5 RT PCR法检测p16INK4A及p21CIP1mRNA的表达p16INK4A、p21CIP1特异基因及βactin 内参基因的引物均由上海生工合成。

βactin引物〔5〕：上游5′GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3′,下游5′CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC3′,扩增片段为500 bp;p16INK4A引物〔5〕：上游5′ATGATGATGGGCAGCGCC3′,下游5′CGAGGTTTCTCAGAGCCT3′，扩增片段为346 bp;p21CIP1引物〔6〕:上游5′CATTTGGTGGACCCAAAGAC3′,下游5′CCTCCCTTCCCCAAAGTTTA3′，扩增片段为304 bp。

RNA提取与测定：采用Invitrogen 公司Trizol试剂提取细胞总RNA。

紫外分光光度计测定其吸光度值并计算RNA浓度。

1%琼脂糖凝胶电泳检测其片段完整性。

逆转录反应：反应总体积为20 μl，其中总RNA为5 μl，随机引物(oligo (dT)1 μl、M MLV 200 U、RNase抑制剂40 U、
10 mmol/L dNTPs 1 μl、0.1 mmol/L DTT 2 μl、5×RT 缓冲液4 μl。

65℃变性5 min后，37℃温育50 min后，70℃、15 min后终止反应。

PCR反应：反应体系为20 μl，分别含cDNA模板2.0 μl、Taq酶0.4 μl、dNTP 0.25 mmol/L、引物1.0 μl、10×PCR缓冲液2.0 μl。

反应条件：94℃5 min，94℃30 s,56～62℃30 s，72℃40 s，35个循环;最后72℃延伸10 min。

其中βactin退火温度为62℃;p16INK4A退火温度为56℃;p21CIP1退火温度为56℃。

取6 μl PCR扩增产物，2 μl上样缓冲液在1%琼脂糖凝胶电泳上做产物检测分析，80 V,30 min电泳，EB染色，以GEL DOC2000型紫外凝胶成像系统拍照，对特异基因条带进行灰度扫描，并对各特异基因/βactin的比值进行分析。

1.6 细胞周期测定细胞培养至80%～90%融汇时，彻底收集细胞入15 ml离心管，离心5 min,去上清得细胞沉淀。

再按细胞周期流式检测试剂盒说明进行操作。

EXPO32 ADC软件进行检测(美国Beckman Clouter)，Multicycle for windows DNA(美国Beckman,Clouter)软件行细胞周期分析。

计算细胞增殖指数(PI)=S%+G2/M%。

1.7 统计学处理数据以x±s表示，采用SPSS13.0软件进行统计分析。

多组间比较方差齐性时行单因素方差分析，LSD 方法进行多组间两两比较;方差不齐时,采用非参数分析进行多组间比较，Dunnett′s T3方法进行多组间两两比较。

2 结果
2.1 各组细胞形态学变化56代衰老细胞形态不规则多突起，细胞体积增大，胞质内见颗粒样物质聚集，细胞轮廓增强，数目减少。

见图1。

120 mg/dl松花粉组，细胞立体感增强，大细胞数目减少，胞质内颗粒样物质减少。

240 mg/dl松花粉组与120 mg/dl松花粉组细胞形态无明显差异。

图1 各组细胞形态比较(×100)
2.2 各组单细胞面积测定衰老细胞出现立体感减弱，胞质平铺，细胞表面积增大。

单细胞面积在56代细胞中较30代细胞明显增大(P0.05)，松花粉组较56代对照组均显著减小(P0.05)，但120与240 mg/dl松花粉组之间差异不显著(P0.05)。

见表1。

2.3 细胞SAβgal染色见图2，SAβgal染色阳性率在56代细胞中较30代细胞显著增高(P0.001)。

120 mg/dl松花粉组与240 mg/dl松花粉组均较56代对照组显著降低(P0.001)。

见表1。

图2 细胞衰老相关β半乳糖苷酶染色图(×100)
2.4 RT PCR结果
2.4.1 总RNA完整性分析总RNA电泳结果示见图3，4组细胞中提取的总RNA其28S,18SrRNA条带完整，且28S的表达量约为18S的两倍，提示总RNA提取完整。

且提取的总RNA吸光度分析，OD260/OD280比值为1.7～2.0，证明所提取的总RNA无蛋白质污染，提取质量较高。

2.4.2 p16INK4A及p21CIP1基因mRNA水平在30代细胞中p16与p21的mRNA均维持较低的表达;而在56代细胞中，p16INK4A 与p21CIP1mRNA表达量出现显著上升(P0.05)，并在松花粉处理后
出现显著的下降(P0.05)，同时与120 mg/dl花粉血清液组比较，240 mg/dl花粉血清组p16INK4A与p21CIP1mRNA表达量显著降低(P0.05)，见表2。

2.5 细胞周期与30代对照组比较，56代细胞G0/G1期比例增加显著增加(P0.001)，PI显著下降(P0.001),而花粉处理组细胞G0/G1期细胞比例较对照组明显回落(P0.05)，PI指数显著升高(P0.05)。

同时，松花粉240 mg/dl组与120 mg/dl组之间，G0/G1期,S期细胞比例和PI指数均出现显著性差异(P0.01)。

见表3。

表1 各实验组单细胞面积、细胞SAβgal染色的变化(与56代对照组比较：1)P0.05，2)P0.001表2 各组p16INK4A和p21CIP1mRNA水平与56代对照组比较：1)P0.05，2)P0.001;与120 mg/dl组比较：3)P0.05表 3 松花粉对2BS细胞细胞周期的影响与56代对照组比较：1)P0.001，2)P0.05，3)P0.01;与120 mg/dl与比较：4)P0.01
3 讨论
本实验采用经典的衰老人胚肺2BS细胞模型，以细胞形态观察及衰老相关指标来对衰老细胞模型进行评估。

结果在衰老细胞中出现典型的衰老形态特征以及单细胞面积增大，SAβgal阳性率增加、G1期阻滞、PI指数下降等衰老相关指标的改变，提示衰老细胞模型建立成功。

经松花粉处理后细胞的衰老形态特征被弱化，衰老相关改变受到抑制，与衰老模型组相比表现出单细胞面积减小，SAβgal 阳性率下降，G1期细胞比例减少，PI指数升高等改变。

再次验证了松花粉具有抗衰老的效果。

细胞复制性衰老理论认为细胞衰老的一个重要特征即G1期阻滞，指细胞由于增殖能力受到抑制，大量的细胞DNA增殖停留在G1期，不能进入DNA合成期S期，及其后的G2/M期，表现为细胞群中G1期的细胞比例显著升高，而S、G2、M期比例在细胞群中显著减少，似出现G1期细胞聚积，称为衰老细胞G1期阻滞，反映DNA 增殖过程的受阻或中断。

其中G0/G1期调控点在细胞周期调控中甚为关键。

CyclinD为细胞周期蛋白、CDK为细胞周期蛋白依赖激酶与CDKI(细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子)协同调控细胞周期的变化，其中cyclinD与CDK 是细胞周期的正调控因子，促进细胞增殖、分化;CDKI 是CDK的抑制物，导致细胞周期停滞，阻断细胞增殖，为细胞周期的负调控因子。

在衰老细胞中cyclinD、CDK与CDKI均发生量与活性的变化。

P16INK4A与p21CIP1分别为CKI内NK4和CIP/KIP两大家族的核心成员〔7〕。

p16INK4A基因主要通过p16cyclinD/CDK RB 途径调控细胞周期。

P16INK4A是CDK4/6的特异性抑制剂，能特异抑制cyclinD CDK4/6RB途径的磷酸化过程，使RB蛋白保持非磷酸化状态，减少了转录因子E2F的释放，使E2F依赖的G1晚期调控蛋白不能表达，细胞不能进入S期，停滞在G1期。

p16蛋白在正常生长细胞中表达水平较低〔8〕，但是在细胞多次复制接近衰老时其表达水平逐渐增高〔9〕，2004年Janakiraman 〔10〕提出p16INK4a能作为测定细胞衰老的分子标记。

p21CIP1(又名P21WAF1,p21SDI1)是CDK的广泛抑制剂。

主要由p53 介导DNA损伤及致癌信号引起的p21转录活化。

通过p21cyclinD/ CDK RB的细胞周期调控途径可阻抑细胞的增殖。

但p21CIP1同时还可与增殖细胞周期核抗原(PCNA)结合，致使PCNA 依赖的DNA修复受抑，细胞复制停留在G1期。

目前普遍认为，p21CIP1通过以上两种途径调控细胞周期。

研究显示，p21表达上调和DNA损伤凝集点出现、p53 磷酸化及长期的细胞周期停滞存在显著相关性，而且在老化细胞中p21上调和染色体末端DNA损伤有直接关系〔11，12〕。

有报道，在衰老细胞中p21CIP1的mRNA表达量比年轻细胞增加10～20倍〔13〕。

有学者认为p21CIP1具有与p16INK4A相同的衰老相关分子生物学指标价值。

本研究在成功建立的衰老人胚肺成纤维细胞衰老模型上，观察到衰老细胞中p16INK4A，p21CIP1表达均显著增加，与已知结论相符。

同时，用RT PCR法观察了松花粉对衰老细胞p16INK4A和p21CIP1基因表达的影响,发现衰老细胞在松花粉处理后p16INK4A 与p21CIP1mRNA表达水平出现显著下调。

说明松花粉显著抑制了p16INK4A与p21CIP1mRNA的表达,并分别通过p16cyclinD CDK4/6RB通路与p21cyclinD/CDK RB通路延缓了细胞衰老的启动和衰老进程,这可能是松花粉抗2BS复制性衰老的主要分子机制之一。

同时，在120与240 mg/dl的含花粉血清培养基处理组之间，G1期比例，PI指数，p16INK4A与p21CIP1mRNA表达量均存在
显著性差异，提示松花粉的抗衰老效果具有剂量依赖性。

总之，本实验从衰老细胞的表观指标方面再次验证了松花粉的抗衰老效果，同时从衰老的内在基因调控方面探讨了松花粉抗衰老的分子机制，分析了两个重要的细胞周期调控因子p16INK4A与p21CIP1mRNA表达量的变化情况，提示松花粉可能通过抑制p16INK4A及p21CIP1mRNA的表达，并可能通过释放其下游的Rb 与PCNA蛋白，推进细胞DNA增殖进程，改善衰老细胞G1期阻滞情况，从而达到抗衰老作用。

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