一株高效苯胺降解菌及其用途和使用方法[发明专利]

(10)申请公布号 (43)申请公布日 2010.09.15*CN101831391A*
(21)申请号 200910058557.X
(22)申请日 2009.03.10
CGMCC No.2783 2008.12.04
C12N 1/20(2006.01)
C02F 3/34(2006.01)
C02F 1/58(2006.01)
C02F 3/12(2006.01)
C12R 1/01(2006.01)
C02F 101/38(2006.01)
(71)申请人中国科学院成都生物研究所
地址610041 四川省成都市人民南路四段九
号
(72)发明人李旭东 武洪杰 谭周亮
(74)专利代理机构成都赛恩斯知识产权代理事
务所(普通合伙) 51212
代理人彭晓波
(54)发明名称
一株高效苯胺降解菌及其用途和使用方法
(57)摘要
本发明属于环境保护技术领域，具体涉及一
株高效苯胺降解菌及其用途和使用方法。

本发明
高效苯胺降解菌，代号为AN-P1，经鉴定为红球菌
Rhodoccocus sp.，于2008年12月4日在中国菌
种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号
为：CGMCC No.2783；应用于高浓度苯胺废水处理
或苯胺突发污染事故应急处理。

具有对高浓度苯
胺耐受能力强、降解速度快、无二次污染、使用安
全，对原有处理系统中微生物不会造成不良影响
等特点。

(83)生物保藏信息(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书 1 页 说明书 6 页CN 101831391 A
C N 101831391 A
1.一株高效苯胺降解菌，代号为AN-P1，经鉴定为红球菌Rhodoccocussp.，于2008年12月4日在中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为：CGMCC No.2783；该菌细胞形态为球状或短杆状，革兰氏阳性，无鞭毛，不运动，不产芽孢；菌落为淡红色、圆形、边缘整齐、凸状隆起、粘稠；氧化酶阴性、过氧化氢酶阳性；硝酸盐还原阳性。

2.权利要求1所述的高效苯胺降解菌的培养方法为：
培养基成分：每1L含Na
2HPO
4
2g，KH
2
PO
4
0.5g，MgSO
4
·7H
2
O 0.3g，微量元素溶液5mL，
苯胺1g，固体培养基中加入15g/L的琼脂粉；
培养方法：采用上述培养基，对菌种进行活化，活化培养条件为30℃，pH 6-8，摇床160r/min活化24小时；按1-10％接种量扩大发酵培养，培养温度为25-35℃，摇床转速为160r/min，发酵12-16小时。

3.权利要求1所述的高效苯胺降解菌的用途：应用于高浓度苯胺废水处理或苯胺突发污染事故应急处理。

4.权利要求1所述的高效苯胺降解菌的使用方法为：处理高浓度苯胺废水时，以菌体干重计，按接种量0.1‰～0.3‰投加AN-P1菌剂到已运行的苯胺废水生物处理系统中，调整水力停留时间18～32小时；应急处理苯胺突发污染事故时，以菌体干重计，按接种量0.1‰～0.3‰往处理系统中接入AN-P1菌剂，曝气维持处理系统中溶解氧2-6mg/L，调整水力停留时间10～32小时。

一株高效苯胺降解菌及其用途和使用方法
技术领域
[0001] 本发明属于环境保护技术领域，具体涉及一株能快速降解苯胺的高效降解菌及其在高浓度苯胺废水生物处理与苯胺突发污染事故应急处理中的应用。

背景技术
[0002] 苯胺是炼油、染料、农药、医药等工业排放废水中的主要有害污染物，是最常见的水体污染物。

苯胺是有毒有害“三致”物质，危害人体健康。

目前苯胺废水的处理主要采用物化法和生物法，但物化法处理苯胺存在着处理效率低，成本高、二次污染严重、操作复杂等问题；生物处理系统作为应用最为广泛的废水处理工艺，具有对污染物处理速度快、效率高、成本低、处理量大、无二次污染等特点，但由于苯胺是剧毒物质，一旦高浓度苯胺进入生物处理系统就会抑制、损伤其中微生物体系，从而使生物法处理苯胺废水受到极大限制，近年，国内外也开展了许多针对筛选高效苯胺降解菌和处理苯胺废水的工作，如：AN4菌株40小时可降解1000mg/L，2000mg/L苯胺经过44小时后降解12.5％。

1000mg/L苯胺废水48h小时降解80％以上，苯胺浓度高于1000mg/L时降受抑。

台湾专利菌剂H.S.B通过兼氧30～40h，好氧20～30h可以达标处理小于500mg/L的苯胺废水。

(张逸飞，顾挺，王国祥，等.一株苯胺降解菌的分离鉴定及其降解特性环境污染与防治[J].2008，30(02)：12～15.韦朝海，任源，吴超飞，等.专性好氧菌降解苯胺废水的动力学研究[J].环境科学研究，1999，12(4)：15～18.章健，刘庆都苯胺的微生物降解[J].安徽农业大学学报，1997，24(3)：283～286.黄京生.硝基苯废水或苯胺废水或其混合废水的全生化处理方法[P].中国专利：200410065840.2，2005-07-27)。

目前苯胺废水生物处理存在着苯胺耐受浓度低、降解速率慢、达标难等问题。

[0003] 另一方面，苯胺工业的生产工艺及各种人为原因使其成为环境事故的高发行业。

据不完全统计仅1995年至2006年间发生的苯胺爆炸和泄漏事故就达20多起，其中最著名的包括中石油吉林石化和兰州石化的苯胺爆炸事件。

针对突发污染爆炸与泄漏事故，国家明确规定(安监总危化[2006]10号)化工企业必须设有事故池或缓冲池等事故状态下“清净下水”的收集、处置措施。

然而，苯胺突发污染事故发生后，高浓度苯胺废液在得到有效隔离与拦截后，仍需进行快速安全的处理处置，目前大多采用活性炭吸附或物化处理等方法，面临处理不便、二次污染等问题。

因此，如何利用污染事故发生地工厂废水处理站或污水处理厂巨大的污染净化处理容量与能力，强化快速应急处理污染事故产生的高浓度废液，成为污染事故应急处理技术研发的重点。

发明内容
[0004] 本发明的目的是针对苯胺污染事故频发，且苯胺毒性大、降解难、降解速率慢的问题，提供一株能快速降解高浓度苯胺的高效降解菌及其应用于处理突发污染事故的技术。

[0005] 本发明所提供的高效菌AN-P1系从污水活性污泥中，经富集筛选、纯化所得。

该菌株能够以苯胺为唯一碳源、氮源和能源生长。

该菌株鉴定为：红球菌Rhodoccocus sp.，
于2008年12月4日在中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为：CGMCC No.2783。

该菌株菌落为淡红色、圆形、边缘整齐、凸状隆起、粘稠，菌落直径为1.5mm左右；革兰氏阳性，氧化酶阴性、过氧化氢酶阳性；可利用柠檬酸盐、琥珀酸盐等盐类为碳源；硝酸盐还原阳性。

[0006] AN-P1菌在纯培养条件下降解2000mg/L苯胺32h能使出水达到《污水综合排放标准》(GB 8978-1996)一级标准，可快速降解500～2000mg/L的高浓度苯胺，可用于高浓度苯胺废水的生物强化处理。

结合污水处理常规活性污泥系统，以AN-P1为功能菌株，将其按0.1‰～0.3‰(菌体干重)接种量添加于活性污泥系统，应急处理苯胺突发污染事故产生的500～2000mg/L苯胺，AN-P1强化的应急处理系统可在常规污水处理水力停留时间8～35小时内高效去除苯胺，达到国家规定的相关排放标准。

通过16S r DNA，V3区片段PCR-DGGE图谱检测分析结果表明该菌株能有效的保护污水处理系统微生物生态免受高浓度苯胺影响。

[0007] 本发明具有以下优点：
[0008] 1、功能菌株AN-P1对高浓度苯胺耐受能力强、降解速度快，对2000mg/L的苯胺仍具有良好降解效果；
[0009] 2、针对苯胺突发污染事故产生的高浓度苯胺废液，充分利用污染事故发生地工厂废水处理站或污水处理厂巨大的污染净化处理容量与能力，添加苯胺高效降解菌应急处理污染事故，具有操作简便、快速安全、无二次污染等特征。

[0010] 3、苯胺高效降解菌发酵培养方式简单，降解500～2000mg/L苯胺所需水力停留时间为10～32小时，这与生活污水、工业废水生物处理停留时间基本吻合，且其使用安全，对原有处理系统中微生物及处理效果不会造成不良影响。

具体实施方式
[0011] 实施例1：苯胺降解菌Rhodoccocus sp.AN-P1的筛选分离及处理苯胺废水[0012] 采集成都第一污水处理厂好氧池活性污泥，污泥样品按10％的接种量，30℃、160r/min、逐步提高苯胺浓度富集培养。

然后在含1000mg/L苯胺MSB琼脂平板上划线分离，选择不同形态特征的菌落，重新转接至1000mg/L苯胺的MSB培养基中，相同条件下培养以验证是其苯胺降解能力，进一步纯化直至得到有降解能力的纯培养菌株。

[0013] 合成培养基(MSB)：每1L含Na2HPO42g，KH2PO40.5g，MgSO4·7H2O 0.3g，微量元素溶液5mL，苯胺1g。

固体培养基中加入15g/L的琼脂粉。

[0014] 经反复驯化最终分离纯化得到一株高效苯胺降解菌AN-P1。

菌落为淡红色、圆形、边缘整齐、凸状隆起、粘稠，菌落直径为1.5mm左右；革兰氏阳性，氧化酶阴性、过氧化氢酶阳性；可利用柠檬酸盐、琥珀酸盐等盐类为碳源；硝酸盐还原阳性。

16S rDNA的分析其与嗜吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans)的16S rDNA序列的相似率达98％，经鉴定该菌为红球菌(Rhodoccocus sp.)编号为AN-P1.
[0015] 将该菌以0.3‰接种量(以细胞干重计)接入含苯胺500mg/L、1000mg/L、2000mg/ L的苯胺模拟废水(MSB培养基中添加苯胺)在pH＝7，30℃，160rpm培养，每隔3h取样测定苯胺含量(如表1所示)和COD，测定结果表明分别通过18h、24h、32h降解，苯胺去除率高于99.9％，出水COD分别47.4、85.5、24.2mg/L，出水水质满足《污水综合排放标准》
(GB8978-1996)一级标准。

[0016] 表1AN-P1对不同浓度苯胺模拟废水的降解效果
[0017]
[0018] 实施例2：AN-P1模拟应急处理苯胺突发污染事故废液
[0019] 向生活污水中加入一定量(500mg/L、1000mg/L、2000mg/L)的苯胺，模拟突发污染事故后苯胺进入排水管网冲击污水生物处理系统。

模拟实验系统分两组，一组为对照系统，即常规活性污泥处理系统(MLSS＝2000±100mg/L)；第二组为加入以接种量为0.3‰AN-P1菌株的生物强化应急处理系统(MLSS＝2000±100mg/L)。

30℃，自然pH，160rpm摇床培养模拟处理(溶解氧控制在3～5mg/L)。

500mg/L组每隔1h取样测定苯胺与COD降解效果；1000mg/L、2000mg/L组每隔4h取样测定苯胺与COD降解效果，处理结果表2、表3、表4所示。

同时，对1000mg/L、2000mg/L苯胺突发污染事故模拟废水处理过程中不同时段样品16S r DNA，V3区片段进行PCR-DGGE分析。

[0020] 表2、表3、表4研究结果表明，对500、1000、2000mg/L的苯胺污染事故废液，常规活性污泥系统对苯胺基本无去除，而用AN-P1作为功能菌株对常规活性污泥系统进行强化应急处理突发污染事故苯胺废液，含500mg/L、1000mg/L、2000mg/L苯胺的污染事故废液分别处理10h、20h、32h后，处理出水中苯胺含量和COD达到《污水综合排放标准》(GB8978-1996)一级标准，与已报道的菌株相比，极大的提高了生物处理系统对苯胺耐受浓度和高浓度苯胺废水的处理速度。

[0021] 表2功能菌AN-P1应急处理500mg/L苯胺污染事故废液效果
[0023] 表3功能菌AN-P1应急处理1000mg/L苯胺污染事故废液效果
[0025] 表4功能菌AN-P1应急处理2000mg/L苯胺污染事故废液效果
[0026]
[0028] 应急处理过程中微生物PCR-DGGE分析结果表明，应急处理系统与对照系统处理苯胺废液前后过程比较，存在A、B、C三条明显的特征条带，A为AN-P1功能菌的特征带，在应急处理系统中都能检测到清晰的特征带。

条带B在常规活性污泥系统中条带较暗，而强化系统处理苯胺事故模拟废液后其条带B变得清晰明亮，成为优势菌。

条带C在常规活性污泥系统中处理苯胺事故模拟废液后条带亮度变暗，其代表的细菌数量减少，且处理高浓度(2000mg/L)苯胺时其亮度减少更为明显。

而在应急处理系统中处理苯胺后条带C亮度反而
有所增加，表明条带C对应细菌数量增加。

泳道条带数目分析结果表明，1000mg/L、2000mg/
L苯胺废液处理系统应急处理0小时，对照系统条代数为16条，应急处理系统条代数为17条(比对照系统多出一条AN-P1功能菌的特征带)；应急处理20、32小时，对照系统条代数为14条，应急处理系统条代数为18条。

处理前后条带差异表明，当用常规的活性污泥系统应急处理高浓度苯胺废水时，泳道条带数目减少，表明系统中的微生物会受到苯胺的毒害、损伤，从而导致微生物数量、种类减少，系统处理性能下降。

而用AN-P1菌株强化应急处理苯胺事故模拟废液的系统，能保护处理系统中的微生物免受苯胺影响，使系统在细菌数量、种类方面均能保持稳定。

PCR-DGGE结果表明强化后能有效的保护原有生态系统中的微生物免受苯胺影响。

证明AN-P1应用于应急处理苯胺突发污染事故是安全可行的。

[0029] 实施例3：基于SBR工艺的苯胺污染事故废液应急处理
[0030] 取生活污水厂污泥和污水构建SBR工艺系统，反应器编号为1号(常规SBR系统)，2号(应急SBR系统)，有效容积4.5L，MLSS＝2000±100mg/L，汽水比32∶1(溶解氧3～5mg/L)，室温，正常运行期间HRT为8h，稳定运行7d后加入2000mg/L苯胺到1、2号反应器，按0.3‰接种AN-P1菌到2号反应器，每隔四个小时取样测定苯胺含量和COD。

测定结果如表2所示。

应急处理结束后，恢复SBR工艺正常运行处理生活污水，检测COD、氨氮出水水质指标，检测结果如表3所示。

[0031] 如表4所示，苯胺与COD检测结果表明通过36h降解2号SBR应急处理系统出水能到达《污水综合排放标准》(GB 8978-1996)一级标准。

苯胺含量和COD分别为0.67mg/ L，97.7mg/L。

而常规SBR系统苯胺去除率仅为1.7％，COD为6083.3mg/L。

[0032] 表4基于SBR工艺的苯胺污染事故废液应急处理效果
[0033]
[0034] 如表5所示，应急处理苯胺污染事故废液后，常规SBR系统与应急SBR系统对COD 的去除效果正常运行3周期后能恢复达标排放，应急SBR系统氨氮去除效果正常运行7周期后恢复达标，且去除效率日渐提高，常规SBR系统14周期后仍未能恢复。

表明用AN-P1菌强化应急处理系统后不仅能快速高效的去除苯胺，而且可以有效保障处理系统对污染物的净化性能。

[0035] 表5基于SBR工艺的苯胺污染事故废液应急处理后系统正常运行性能考察
[0037] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明精神实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化，均
应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。