酶_DNS比色法测定酵母海藻糖的研究

第32卷第2期 2002年6月
工业微生物
Industrial M icrobiology
Vol.32No.2
June 2002
*
天津市自然科学基金资助项目(编号:013609711)
酶 DNS 比色法测定酵母海藻糖的研究*
王 兰, 肖冬光, 张 正
(天津轻工业学院,天津300222)
摘 要 确定了以酶 DNS 比色法定量测定酵母海藻糖的方法,并对可能影响测定的因素进行了研究。

结果表明,酶 DNS 比色法无设备条件要求限制,且快速、准确、特异性强。

关键词:海藻糖; 酶法分析; DNS 比色法; 酵母 海藻糖是一种广泛存在于自然界的由二个葡萄糖分子经a,a 1,1糖苷键结合而成的非还原性双糖,它的结构稳定,化学惰性,无毒性。

因它对膜及蛋白质具有独特的保护作用而引起了人们的高度重视,目前已在医药、食品、化妆品、农业等方面具有广泛的应用价值,成为了一项极有应用和开发前景的产品[1~3]。

目前最普遍采用的海藻糖分析方法是蒽酮比色法,它有费用低、操作简便等优点,但由于极易受到能同蒽酮反应的物质的干扰,所以其测定结果往往重现性不好易产生波动[4]。

近几年来又发展起了酶法及H PLC 法。

酶法即是利用海藻糖特异性的分解酶对海藻糖进行分解,使其转化为二分子葡萄糖,然后再利用葡萄糖氧化酶及过氧化物酶测定所产生的葡萄糖
[5~7]。

这种方法虽然比蒽酮法精确,
但使用酶类及影响因素较多,不易控制。

HPLC 法是目前最为精确的海藻糖定性、定量方法[4],但这种方法的推广不仅会受到设备条件的限制,而且因对样品的纯度要求高,无法对提取过程中的中间试样进行测定,给研究工作带来了一定的困难。

因此,找到一种既准确又简便的海藻糖测定方法已成为目前研究工作的当务之急。

本实验首先利用对海藻糖具有特异性分解作用的海藻糖分解酶将一分子海藻糖分解成二分子葡萄糖[8],然后再利用二硝基水杨酸法测定所产生的葡萄糖,从而定量测定海藻糖。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种
面包酵母BY 11(本实验室保存)1.1.2 主要试剂
标准海藻糖(Sig ma 公司生产),TREHALASE (Sigma 公司生产),3,5-二硝基水杨酸。

1.1.3 主要溶液
0.1mol/L 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH5.6);
DNS(3,5-二硝基水杨酸)显色剂。

1.1.4 主要培养基 YEPD 培养基.1.2 方法
1.2.1 水杨酸法快速测定葡萄糖1.2.2 TREHALASE 法分解海藻糖
取一洁净试管加入0.1%海藻糖溶液0.25mL,TREHALASE 0.025U 及0.1mol/L 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 5.6)0.25mL,混合均匀后迅速放入37 水浴中反应,反应完毕即加入0.5mL DNS 显色剂,沸水浴中煮5m in,以流动水冷却后再加4mL 蒸馏水摇匀,同时以蒸馏水代替海藻糖作一对照,在540nm 处读其光密度值,对照葡萄糖标准曲线计算葡萄糖生成量,并换算出海藻糖量。

C T =1.05C G
其中,C T 为海藻糖浓度,C G 为增加的葡萄糖浓度。

1.2.3 酶 DNS 法测定海藻糖的程序
样品处理!测酶处理前葡萄糖浓度C 1!酶法分解海藻糖!测酶处理后葡萄糖浓度C 2!计算增加的葡萄糖浓度(C 2-C 1)!换算成海藻糖的含量。

2 结果与讨论
2.1 样品的处理2.1.1 测定胞内海藻糖
取用YEPD 培养基培养至稳定态的BY 11菌种,用水洗涤2次,然后用不同的方法进行处理,用酶 DNS 比色法所测海藻糖含量结果见表1。

表1 不同前处理方法对胞内海藻糖
测定结果的影响
处理方法
海藻糖含量(mg/mg 菌体干重)
95 10m i n 离心所得上清液0.08095 20m i n 离心所得上清液0.100玻珠震荡5min 离心所得上清液0.078玻珠震荡10min 离心所得上清液
0.089
从上表可以看出,用不同的方法处理所得的结果有所不同,最好的方法为95 处理20min,这可能是由于此方法能使胞内海藻糖提取较为完全的缘故。

2.1.2 测定发酵液内海藻糖
测定发酵液内海藻糖不需要特别的前处理,因为海藻糖分解酶的特异性比较强[8]
,仅对a,a-海藻糖起作用,可将一分子海藻糖分解成二分子葡萄糖。

但在进行葡萄糖的测定中,由于水杨酸法测定葡萄糖有一定的测定范围,若发酵液内葡萄糖含量过高则会影响酶解后葡萄糖含量的测定,所以,酶解前若发酵液内葡萄糖含量高,则需要进行适当的稀释。

2.2 葡萄糖标准曲线的制作
采用DNS 比色法测定海藻糖分解酶(TREHA LASE)分解底物海藻糖所生成的葡萄糖量需先找出葡萄糖浓度与吸光度值之间的关系。

以葡萄糖量( g /mL)为纵坐标,相应的光密度值为横坐标作出的标准曲线如图1所示。

图1 葡萄糖标准曲线
对以上数据进行回归分析,得回归方程Y =25.86+599.13X,可信度达99.86%,其线性高度显
著。

2.3 海藻糖的存在对葡萄糖测定的影响
取洁净的试管14支,配成浓度分别为0 g/mL 、100 g/m L 、200 g/mL 、400 g /mL 、600 g/mL 、800 g /mL 和1000 g/m L 的葡萄糖液各2支,其中1支内加入海藻糖(最终浓度400 g/mL)。

采用DNS 比色法测各溶液在540nm 波长处的光密度值,结果见表2。

表2 海藻糖对葡萄糖测定的影响
葡萄糖浓度( g/mL)0
100
2004006008001000OD G
00.1010.2740.6260.9501.2691.652
葡萄糖浓度( g/mL)0100200
4006008001000海藻糖浓度( g/mL)400400
400
400
400
400
400
OD G+
T
00.0930.2640.5891.0891.2471.440
为判断海藻糖对葡萄糖测定是否有影响,将以上OD G 及OD G+T 两组数据进行T-检验,所得结果见表3(表中V 代表方差)。

表3 T 检验结果
组别数目平均值标准差标准误160.812000000.593810410.242422082
6
0.78700000
0.552011230.22535764T 值
自由度Prob>|T|当V 1=V 2时0.07559.90.9413当V 1∀V 2时
0.0755
10.0
0.9413
For Ho:V 1=V 2,F=1.18DF=[5,5]Prob>F=0.876
结果表明,F 检验不显著(F=1.18p=0.875>0.05),说明两总体方差差异不显著,应选择方差相等时的平均数来检验结果,这里,t =0.0755p =0.9413>0.05,因而,两处理平均数间差异不显著。

由此可见,海藻糖的存在对葡萄糖的测定无显著影响。

2.4 培养基其它成分对酶反应及葡萄糖测定的影响
测定发酵液内海藻糖的含量一直都因培养基内其它成分较为复杂而显得比较困难,而海藻糖分解酶对海藻糖分解的高度特异性使发酵液内海藻糖的测定成为可能。

为研究培养基其它成分对酶反应及葡萄糖测定的影响,我们用YEPD 培养基和水分别加入等量的葡萄糖和海藻糖进行酶反应前后的
DNS 比色,结果如表4。

第2期
王 兰,等:酶-DNS 比色法测定酵母海藻糖的研究
第32卷
表4 培养基成分对海藻糖测定的影响
成分YEPD培养基+
葡萄糖+海藻糖
水+葡萄糖+
海藻糖
酶反应前OD
1
值0.1380.136
酶反应后OD
2
值0.7070.709 OD2-OD10.5650.573
由上表可知,培养基对酶反应及葡萄糖测定无影响。

2.5 最低酶量的确定2.5.1 同一反应时间不同酶加量对酶反应速度的影响
为了使酶反应完全,一般情况下,酶反应应在酶大大过量的情况下进行。

取10支洁净的小试管按如下加样量(表5)操作,然后放入37水浴中反应1h,反应完毕后,用DNS比色法测定540nm处吸光值,所得结果见图2。

表5 酶反应各管加样量
管号123456789
0.1%海藻糖(mL)0.250.250.250.250.250.250.250.250.25 0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH5.6)(mL)0.250.250.250.250.250.250.250.250.25
TREHALASE(U#10-3)1122334455667788
99
图2 不同酶量下反应所测定的OD值
由图2可明显看出,在相同的时间内,随着酶量的增加,酶反应的速度逐渐增加,当所加酶活力为0.55U(相当于理论所需酶活的5倍)时,反应速度趋于恒定,继续增加酶量,反应速度并不增加,说明底物反应已趋于完全。

因此,在此反应体系及反应条件下,所选择的最低酶活加量应为理论所需酶活的5倍。

2.5.2 延长反应时间对酶反应速度的影响
由于TREHALASE耐热性比较强,相对比较稳定,因此,可考虑适当延长酶反应时间而减少酶的用量(因酶价格较高)。

选择采用表6所示反应体系进行操作,然后放入37水浴中反应1h、2h、3h、4h、表6 酶反应体系(0.515mL)
反应物体积最终浓度
海藻糖溶液(0.1%)0.25mL485.4 g/mL
0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸
钠缓冲液(pH5.6)
0.25mL0.05mol/L
TREHALASE15 L0.025U 5h、6h,反应完毕后,用DNS比色法测定吸光值,所得结果见图3。

图3 酶反应速度曲线
由图3可见,酶反应在最初1h内,由于底物浓度较高,酶反应速度较快。

随着反应时间的延长,底物浓度降低,酶反应速度开始下降,反应4h后,底物基本消耗完全,反应随之停止。

另外,比较图2、图3可以看出,随着反应时间的延长,酶反应速度有所下降,说明酶活也在随反应时间延长而下降,酶反应4h反应完全,此时所计算出的酶活已相当于理论需酶活的9.1倍。

但由于反应时间较长,实际所用的酶量有所减少,由此可见,测定底物浓度应在酶大大过量的情况下测定。

基于此原因,同时考虑到酶在储存、反应过程中反应体系及反应时间的延长对酶活力的影响,在37反应4h的酶反应条件下,测定底物海藻糖浓度所加酶量至少应为理论所需酶活的9倍以上。

第2期 工 业 微 生 物第32卷
2.6 酶 DNS比色法的误差分析
在洁净的小试管内加入0.25m L的0.1mol/L 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH5.6)、0.25mL0.1%的海藻糖溶液和15 L TREHALASE,然后放入37水浴锅内反应4h(相当于理论所需酶活的9.1倍),反应完毕后,加入0.5mL3,5-二硝基水杨酸试剂并混合均匀,沸水浴中加热5m in后取出以流动水冷却,再加入4mL蒸馏水,摇匀,在540nm处测光吸收值,结果见表7。

表7 酶 DNS比色法测定结果和实际含量对照表
管号
12
所测定的OD值
葡萄糖含量( g/mL)
海藻糖含量( g/mL)
海藻糖平均含量( g/mL)
反应体系中海藻糖实际含量( g/mL)测定值相当于实际的误差
0.720.71 457.2450.6 480.06473.2
481.6
485.4
-0.78%
注:误差=海藻糖测定值 海藻糖实际值
海藻糖实际值
#100%
由上表可见,酶-DNS比色法测定结果相对于实际含量的误差为-0.78%即为负误差,说明测定结果比实际结果略小,可能因为在反应后期,酶的底物浓度太低,影响了酶的作用。

但总的来讲,酶-DNS比色法测定海藻糖的误差相当较小,比较能反映海藻糖含量的实际水平。

3 结 论
(1)本方法适用于胞内及发酵液内海藻糖的测定。

(2)胞内海藻糖的测定需进行前处理,一般95处理20min为较好的方法。

(3)在发酵液海藻糖测定过程中,若酶解前发酵液内葡萄糖的含量较高,应进行适当的稀释。

(4)因为TREHALASE对海藻糖的特异性较强,所以发酵液内其它种类的糖对海藻糖的测定无影响。

(5)利用此方法测定海藻糖,在37反应4h的酶反应条件下,所加TREHALASE的酶活应为理论所需酶活的9倍以上。

参考文献
[1] 张红缨、刘洋等.海藻糖的生物合成和相关酶的特性,微生物
学通报,1998,25(4),236-238
[2] 陈炜、何秉旺.酶法合成海藻研究的新进展.微生物学报,1998,
25(3),164-166
[3] 戴秀玉、程苹等.海藻糖的生理功能、分子生物学研究及应用前
景.微生物学通报,1995,22(2),102-104
[4] Julio C.Ferreira,Vania M.F.Paschoalin et parison of th ree
different methods for trehalose determination in yeast extracts.
Food Chemistry,1997,60(2),251-254
[5] Iri s Ki enle et al.Assay of trehalose w ith acid trehalase purified
from Saccha romyces cerevisia e.Yeast,1993,9,607-611
[6] Uirik Schu lze,M ichael Elleskov Larsen et al.Determination of in
tracellular trehalose and glycogen in S a ccharomyce s ce r e visia e.
Analytical Biochemistry,1995,228.143-149
[7] P.S.Araujo,Ana C.Panek et al.Determination of trehal ose in bio
logical samp les by a simp le and stable trehalase prep aration.Ana lytical Biochemistry,1989,176,432-436
[8] John Londesboroguh,Kaij a Varmo.Characteriz ation of tw o treha
lases in b aker∃s yeast.Biochem.J,1984,219,511-518
Determination of trehalose by enzyme DNS colorimetric method
WANG Lan,XIAO dong guang,ZHAN G Zheng
(T ianjin universtry of Light indu stry,Tianji n300222)
Abstract The method for detect ing trehalose by using enzyme DNS c olorimet ric met hod and the factors affect ing deter minat ion were st udied.T he results show ed t hat this method was accuacy,fast,specific and wit hout t he limit ation of t est ing instruments.
Key words trehalose;enzymat ic analysis;DN S colorimet ic method;yeast
第2期王 兰,等:酶-DNS比色法测定酵母海藻糖的研究第32卷。