聚合酶链反应检测成人牙周病患者病原菌的诊断价值

·论　著·
聚合酶链反应检测成人牙周病患者病原菌的诊断价值
冯志俊１，闫宏２
（１．山西医科大学第二医院口腔科２．检验科，山西太原０３０００１
）摘要：目的　探讨聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测牙周病患者主要牙周病病原菌的诊断价值。

方法　根据细菌１６ＳｒＲＮＡ设计８种主要牙周病病原菌聚合酶链反应引物，采用聚合酶链反应技术检测６５例牙周病患者的主要牙周病病原菌。

结果　６５例牙周病患者牙周袋分泌物中检出７种牙周病病原菌，包括伴放线杆菌４４株，阳性率６７．７％，福赛斯拟杆菌３１株，阳性率４７．７％，直肠弯曲菌５２株，阳性率８０．０％，巨核梭杆菌６１株，阳性率９３．８％，啮蚀艾肯氏菌４８株，阳性率７３．８％，牙龈卟啉单胞菌５８株，阳性率８９．２％，中间普氏菌５４株，阳性率８３．１％，未检出齿垢密螺旋体。

结论　聚合酶链反应检测牙周病患者主要牙周病病原菌具有简便、快速的特点，对牙周病病原学诊断有重要意义。

关键词：牙周病；病原菌；聚合酶链反应
中图分类号：Ｒ４４６．１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００５－４５２９（２０１３）０２－０４７６－
０２ＰＣＲ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｉｎ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐａｔｈｏｇｅｎｓ　ｃａｕｓｉｎｇ　
ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｄｉｓｅａｓｅｓ　ｉｎ　ａｄｕｌｔ　ｐ
ａｔｉｅｎｔｓＦＥＮＧ　Ｚｈｉ－ｊｕｎ，ＹＡＮ　Ｈｏｎｇ
（Ｓｅｃｏｎｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｓｈａｎｘｉ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｉｙ
ｕａｎ，Ｓｈａｎｘｉ　０３０００１，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＯＢＪＥＣＴＩＶＥ　Ｔｏ　ａｓｓｅｓｓ　ｔｈｅ　ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　ｖａｌｕｅ　ｏｆ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）ｉｎ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍａｉｎｐａｔｈｏｇｅｎｓ　ｃａｕｓｉｎｇ　ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ　ｄｉｓｅａｓｅｓ．ＭＥＴＨＯＤＳ　Ｗｅ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ａ　ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ　ＰＣＲ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｆｏｒ　８ｐｕｔａｔｉｖｅｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｐａｔｈｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　１６ＳｒＲＮＡ，ｔｈｅｎ　ｔｈｅ　ＰＣＲ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｗａｓ　ｅｍｐｌｏｙｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｔｈｅ　ｍａｉｎｐａｔｈｏｇｅｎｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　６５ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ　ｄｉｓｅａｓｅｓ．ＲＥＳＵＬＴＳ　Ｔｏｔａｌｌｙ　７ｓｐｅｃｉｅｓ　ｏｆ　ｐａｔｈｏｇｅｎｓ　ｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ　ｐｏｃｋｅｔ　ｓｅｃｒｅｔｉｏｎｓ　ｏｆ　６５ｐａｔｉｅｎｔｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　４４ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ（６７．７％），３１ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　Ｆｏｒｓｙｔｈｕｓ（４７．７％），５２ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　Ｒｅｃｔａｌｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ（８０．０％），６１ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　Ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ　ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（９３．８％），４８ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　Ｎｉｅ　ｅｃｌｉｐｓｅ　Ａｉｋｅｎ　ｂａｃｔｅｒｉａ（７３．８％），５８ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　ａｅｒｏｍｏｎａ（８９．２％），ａｎｄ　５４ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ（８３．１％），ｔｈｅｒｅ　ｗｅｒｅ　ｎｏ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ．ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ　Ｔｈｅ　ＰＣＲ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｉｓ　ｓｉｍｐｌｅａｎｄ　ｒａｐｉｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｔｈｅ　ｍａｉｎ　ｐａｔｈｏｇｅｎｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ　ｄｉｓｅａｓｅｓ，ｉｔ　ｈａｓ　ｇｒｅａｔ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ　ｉｎ　ｔｈｅｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｔｉｏｌｏｇｙ　
ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ　ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｋｅｙ　
ｗｏｒｄｓ：Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ　ｄｉｓｅａｓｅ；Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ；Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ收稿日期：２０１２－１０－２０；　修回日期：２０１２－１１－
３０ 牙周炎致病菌是牙周病感染的重要病原菌，
随着牙周病病因学研究的逐步深入，对龈下微生物检测显得尤为重要。

通常以细菌培养和一系列的生化反应进行其表型鉴定，但细菌培养烦琐、周期较长，
达不到快速鉴定的目的［
１］。

不同类型的牙周病都有其特定的优势菌，快速鉴定临床样本优势菌种对于患者抗菌治疗策略的制定非常重要。

近年来，随着聚合酶链反应（ＰＣＲ）
等分子生物学技术的不断发展，涌现出了许多牙周炎致病菌的检测方法［２－
４］，为
临床研究牙周炎致病菌提供了快速便捷的方法。

本
研究应用ＰＣＲ技术检测牙周炎患者口腔牙周病病原菌，现将方法报道如下。

１　材料与方法
１．１　研究对象　２０１０年６－１２月在山西医科大学
第二医院口腔科门诊就诊的６５例牙周病患者。

１．２　标本采集　用无菌棉拭子深入牙周袋内５ｍｍ处采集分泌液，置１ｍｌ缓冲盐水的消毒试管内送检。

１．３　ＤＮＡ提取　取５００μｌ临床标本，
离心沉淀１２　０００ｒ／ｍｉｎ，１０ｍｉｎ，于沉淀物中加５％Ｃｈｅｌｅｘ－１００ＤＮＡ提取液，５０℃消化３０ｍｉｎ，煮沸１０ｍｉｎ。

１４　
０００ｒ／ｍｉｎ，离心沉淀１０ｍｉｎ，上清液转入一个新·６７４·中华医院感染学杂志２０１３年第２３卷第２期　Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｎｏｓｏｃｏｍｉｏｌ　Ｖｏｌ．２３Ｎｏ．２　
２０１３
试管中，用作ＤＮＡ模板。

１．４　ＰＣＲ程序　引物设计和合成由上海英俊生物工程公司合成。

ＰＣＲ扩增在总容积２５μｌ反应管中，含１×ＰＣＲ缓冲液，Ｍｇ＋＋，４×ｄＮＴＰ（各０．２ｍｍｏｌ／Ｌ），０．５ＵＴａｑ　ＤＮＡ酶，０．４μｍｏｌ／Ｌ引物和５μｌ　ＤＮＡ模板。

置ＰＣＲ扩增仪中（ＪＭ，ＰＣＴ－２００），９４℃预变性５ｍｉｎ，进入循环：９４℃３０ｓ→退火温度（４０～６０℃）３０ｓ→７２℃３０ｓ，３０个循环，最后７２℃延伸５ｍｉｎ。

阳性对照用标准试验菌株，阴性对照不加ＤＮＡ模板。

扩增产物用１％琼脂糖凝胶电泳，１ＸＴＢＥ（１ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ，０．９ｍｍｏｌ／Ｌ硼酸，０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ，ｐＨ　８．４）缓冲液，ＥＢ染色（０．５ｍｇ／ｍｌ），分子量标准１－Ｋｂ　ｌａｄｄｅｒ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ），紫外检测仪观察结果。

ＰＣＲ引物序列见表１。

表１　ＰＣＲ特异性引物序列及退火温度
Ｔａｂｌｅ　１　Ｔｈｅ　ＰＣＲ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ａｎｎｅａｌｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ
病原体引物　寡核苷酸序列（５′→３′）退火温度（℃）扩增长度（ｂｐ）伴放线放线杆菌ＧＣＴＡＡＴＡＣＣＧＣＧＴＡＧＡＧＴＣＧＧＡＴＴＴＣＡＣＡＣＣＴＣＡＣＴＴＡＡＡＧＧＴ　５０　５００
福赛斯拟杆菌ＧＣＧＴＡＴＧＴＡＡＣＣＴＧＣＣＣＧＣＡＴＧＣＴＴＣＡＧＴＧＴＣＡＧＴＴＡＴＡＣＣＴ　６０　６００
直肠弯曲菌ＴＴＴＣＧＧＡＧＣＧＴＡＡＡＣＴＣＣＴＴＴＴＣＴＴＴＣＴＧＣＡＡＧＣＡＧＡＣＡＣＴＣＴＴ　５０　６００
巨核梭杆菌ＡＴＴＧＴＧＧＣＴＡＡＡＡＡＴＴＡＴＡＧＴＴＡＣＣＣＴＣＡＣＴＴＴＧＡＧＧＡＴＴＡＴＡＧ　４０　１０００
啮蚀艾肯氏菌ＣＴＡＡＴＡＣＣＧＣＡＴＡＣＧＴＣＣＴＡＡＧＣＴＡＣＴＡＡＧＣＡＡＴＣＡＡＧＴＴＧＣＣＣ　４５　７００
牙龈卟啉单胞菌ＡＧＧＣＡＧＣＴＴＧＣＣＡＴＡＣＴＧＣＧＡＣＴＧＴＴＡＧＣＡＡＣＴＡＣＣＧＡＴＧＴ　６０　４００
中间普氏菌ＴＴＴＧＴＴＧＧＧＧＡＧＴＡＡＡＧＣＧＧＧＴＣＡＡＣＡＴＣＴＣＴＧＴＡＴＣＣＴＧＣＧＴ　５０　６００
齿垢密螺旋体ＴＡＡＴＡＣＣＧＡＡＴＧＴＧＣＴＣＡＴＴＴＡＣＡＴＴＣＡＡＡＧＡＡＧＣＡＴＴＣＣＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＡ　６０　３００
２　结　果
６５例成人牙周病患者龈下组织中主要病原菌检出率依次为巨核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌、直肠弯曲菌、啮蚀艾肯氏菌、伴放线放线杆菌、福赛斯拟杆菌，未检出齿垢密螺旋体见表２。

表２　６５例牙周炎患者病原菌检出率（％）Ｔａｂｌｅ　２　Ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅｓ（％）ｏｆ　ｔｈｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎｓ
ｉｎ　６５ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｔｉｓ
病原菌株数检出率伴放线放线杆菌４４　６７．７
福赛斯拟杆菌３１　４７．７
直肠弯曲菌５２　８０．０
巨核梭杆菌６１　９３．８
啮蚀艾肯氏菌４８　７３．８
牙龈卟啉单胞菌５８　８９．２
中间普氏菌５４　８３．１
３　讨　论
近年来的研究认为，几种牙周细菌是牙周炎发生发展的病原菌。

流行病学调查研究对牙周细菌进行鉴定和定量分析，发现与牙周病有关的病原菌有伴放线放线杆菌、福赛斯拟杆菌、直肠弯曲菌、巨核梭杆菌、啮蚀艾肯氏菌、牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌、齿垢密螺旋体等［５］。

其中伴放线放线杆菌是局限性青少年牙周病的主要致病菌［６］，牙龈卟啉单胞菌是成人牙周病的主要致病菌、中间普沃菌在老年性牙周病中起重要作用。

近年来厌氧培养技术不断改进和发展，专性厌氧菌的检出率明显提高。

无芽胞厌氧菌是体内正常菌群的重要成分，在口腔约＞９０．０％，与需氧菌共同构成口腔正常菌群。

随着ＰＣＲ等分子生物学技术的不断发展，涌现出了许多牙周炎致病菌的检测方法，为临床研究牙周炎致病菌提供了快速便捷的方法，把牙周炎致病菌的检测引入到了一个全新的水平。

总之，ＰＣＲ技术检测牙周病病原菌具有简便、快速、敏感、特异之特点，对牙周病病原菌诊疗具有重要意义。

参考文献
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ｓｔａｎｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　ｐｅｒｉｏｄｏｎ－
ｔａｌ　ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ，２０１１，３８（１１）：７－１６．
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中华医院感染学杂志２０１３年第２３卷第２期　Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｎｏｓｏｃｏｍｉｏｌ　Ｖｏｌ．２３Ｎｏ．２　２０１３。