快速检测植物油样品中BHA、BHT、TBHQ的方法及其前处理方法[发明专利]

(10)申请公布号
(43)申请公布日 (21)申请号 201410743611.5
(22)申请日 2014.12.08
G01N 30/06(2006.01)
(71)申请人中粮集团有限公司
地址100020 北京市朝阳区朝阳门南大街8
号
申请人中粮营养健康研究院有限公司
(72)发明人王浩 杨永坛 杨悠悠 刘佟
(74)专利代理机构北京信慧永光知识产权代理
有限责任公司 11290
代理人
杨国强 张淑珍
(54)发明名称
快速检测植物油样品中BHA、BHT、TBHQ 的方
法及其前处理方法
(57)摘要
本发明涉及食品中添加剂的检测领域。

具体
而言，本发明涉及一种用于快速检测植物油样品
中叔丁基羟基茴香醚(BHA)、2,6-二叔丁基对甲
酚(BHT)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)的前处理方法，
所述前处理方法包括以下步骤：(1)将植物油样
品与吸附剂和提取溶剂混合，制备成混合物；(2)
将步骤(1)中得到的混合物进行涡旋振荡，制得
上清液；(3)将步骤(2)中得到的上清液浓缩，得
到待测液。

本发明还涉及采用本发明所述的前处
理方法的快速检测植物油样品中BHA、BHT、TBHQ
的方法。

本发明所述的前处理方法的BHA、BHT、
TBHQ 回收率高、操作步骤快速简单、操作工艺污
染少且成本低。

(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书7页 附图2页CN 105738534 A 2016.07.06
C N 105738534
A
1.一种用于快速检测植物油样品中BHA、BHT、TBHQ的前处理方法，所述前处理方法包括以下步骤：
(1)将植物油样品与吸附剂和提取溶剂进行混合，制备混合物；
(2)将步骤(1)中得到的混合物进行涡旋振荡，制得上清液；
(3)将步骤(2)中得到的上清液浓缩，得到待测液。

2.根据权利要求1所述的前处理方法，其中，在步骤(1)中，所述植物油样品与所述吸附剂的质量比为1:(20-70)，优选为1:(30-60)；相对于0.1g所述植物油样品，所述提取溶剂的体积为5-20mL，优选为7.5-12.5mL。

3.根据权利要求1所述的前处理方法，其中，在步骤(2)中，所述涡旋振荡的功率为20-60W，优选为25-40W；时间为0.3-5分钟，优选为1-3分钟。

4.根据权利要求2所述的前处理方法，其中，在步骤(3)中，将步骤(2)中得到的上清液浓缩至8.0-13.3体积％。

5.根据权利要求1-4中任意一项所述的前处理方法，其中，所述吸附剂选自弗罗里硅土、N-丙基乙二胺键合硅胶、C18键合硅胶和中性氧化铝中的至少一种，优选为中性氧化铝和/或C18键合硅胶。

6.根据权利要求1-4中任意一项所述的前处理方法，其中，所述提取溶剂选自二氯甲烷、丙酮、甲醇和正己烷中的至少一种，优选为丙酮和/或甲醇。

7.据权利要求1-4中任意一项所述的前处理方法，其中，所述方法还包括对在步骤(3)浓缩后得到待测液进行干燥，然后用有机溶剂复溶。

8.根据权利要求7所述的前处理方法，其中，所述干燥的方法选自氮气吹干、旋转蒸发和真空定量浓缩中的至少一种。

9.根据权利要求7所述的前处理方法，其中，所述有机溶剂选自乙腈、四氢呋喃和甲醇中的至少一种，优选为乙腈和/或甲醇。

10.一种快速检测植物油样品中BHA、BHT、TBHQ的方法，所述方法包括：
(1)将植物油样品用权利要求1-9中任意一项所述的前处理方法进行处理，得到待测液；
(2)将步骤(1)中得到的待测液进行液相色谱分析。

快速检测植物油样品中BHA、BHT、TBHQ的方法及其前处理
方法
技术领域
[0001] 本发明涉及植物油样品中抗氧化剂的检测领域，尤其涉及用于快速检测植物油样品中抗氧化剂的前处理方法。

背景技术
[0002] 叔丁基羟基茴香醚(BHA)、2,6-二叔丁基羟基甲酚(BHT)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)是油脂中较为常用的人工合成抗氧化剂，具有防止或延缓油脂氧化变质、防止毒素产生、保持油脂中营养成分和脂溶性维生素稳定的作用。

这些脂溶性酚类抗氧化剂的过量添加会对人体健康造成伤害：如大剂量BHA可致癌，BHT有抑制人体呼吸酶活性的嫌疑，TBHQ有致畸致癌的危险。

因此，这些抗氧化剂在食品中的添加量日益引起人们的关注。

对此，国家食品添加剂使用标准GB 2760-2011对油脂中抗氧化剂的最大使用量做出了限量规定：BHA、BHT 和TBHQ均为0.2g/kg(以油脂中的含量计)。

[0003] 植物油富含甘油三酯，使得基质不易净化，对痕量的BHA、BHT、TBHQ残留检测有严重干扰。

因为基质净化不好，会造成色谱柱堵塞、回收率低等影响，从而使对痕量的BHA、BHT、TBHQ残留检测达不到要求。

因此，采用色谱法检测植物油中的BHA、BHT、TBHQ时大多需要对植物油样品进行前处理。

目前，国内外用于研究植物油中BHA、BHT、TBHQ的前处理萃取净化方法主要有液液萃取、固相萃取、比色法、凝胶渗透色谱等方法。

[0004] 例如，国家标准GB/T 23373-2009：食品中BHA、BHT、TBHQ的测定使用凝胶渗透色谱净化系统对样品进行净化，然后应用气相色谱法分析。

该方法需要大型净化仪器，使得成本高，并且前处理时间长，有机试剂用量大，操作过程繁琐。

农业推行标准NY/T 1602-2008：植物油中BHA、BHT和TBHQ的测定使用液液萃取，然后采用反向高效液相色谱法分析。

而这一方法的前处理时间长，操作人员与有机溶剂接触的时间长，危害大，并且操作也比较繁琐，回收率较低。

[0005] 由此可见，上述方法中植物油样品中BHA、BHT、TBHQ的前处理方法以及相应的检测方法存在以下缺陷：(1)提取步骤繁琐，耗时较长，回收率低，无法应对突发事件的快速检测；(2)由于处理过程繁琐，操作人员与有机溶剂接触时间长，危害大；(3)由于处理过程耗时长，人工成本较高。

因此，目前急需一种快速简单、危害小、成本低且回收率高的用于快速检测植物油样品中BHA、BHT、TBHQ的前处理方法以及快速检测植物油样品中BHA、BHT、TBHQ的方法。

发明内容
[0006] 本发明的目的在于，提供一种用于快速检测植物油样品中BHA、BHT、TBHQ的前处理方法，从而克服上述缺陷。

[0007] 本发明的另一目的在于，提供一种快速检测植物油样品中BHA、BHT、TBHQ的方法，从而克服上述缺陷。

[0008] 本发明的发明人在研究中发现，在测定植物油样品中BHA、BHT、TBHQ的含量之前，将植物油样品与吸附剂和提取溶剂进行混合，然后进行涡旋振荡、浓缩，可提高植物油样品中BHA、BHT、TBHQ的回收率。

具体而言，本发明的前处理方法使用吸附剂有效地吸附油脂基质，从而使经过涡旋振荡得到的上清液中的油脂基质大幅度减少，进而减少油脂基质对提取溶剂提取BHA、BHT、TBHQ的影响，提高了植物油样品中BHA、BHT、TBHQ的回收率。

[0009] 因此，一方面，本发明提供了一种用于快速检测植物油样品中BHA、BHT、TBHQ的前处理方法，所述前处理方法包括以下步骤：
[0010] (1)将植物油样品与吸附剂和提取溶剂混合，制得混合物；
[0011] (2)将步骤(1)中得到的混合物进行涡旋振荡，得到上清液；
[0012] (3)将步骤(2)中得到的上清液浓缩，得到待测液。

[0013] 优选地，所述方法还包括将在步骤(3)浓缩后得到的待测液进行干燥，然后用有机溶剂复溶。

[0014] 另一方面，本发明提供了一种快速检测植物油样品中BHA、BHT、TBHQ的方法，所述方法包括：
[0015] (1)将待测植物油样品用本发明所述的前处理方法进行处理，以得到待测液；[0016] (2)将步骤(1)中得到的待测液进行液相色谱分析。

[0017] 本发明所提供的前处理方法以及采用这一前处理方法的检测方法具有如下优点：植物油样品中BHA、BHT、TBHQ的回收率高；操作步骤简单，大大减少了操作人员与大量有机溶剂接触的时间，减少了污染，显著降低了处理成本。

[0018] 本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明
[0019] 图1是BHA、BHT、TBHQ混合标准溶液(浓度均为10.0mg/L)的液相色谱图；[0020] 图2是经本发明的前处理方法处理得到的植物油样品的液相色谱图；
[0021] 图3是植物油样品加BHA、BHT、TBHQ混合标准溶液(加标量为100mg/kg)经本发明的前处理方法处理得到的待测液的液相色谱图。

具体实施方式
[0022] 以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。

应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

[0023] 一方面，本发明提供了一种用于快速检测植物油样品中BHA、BHT、TBHQ的前处理方法，所述前处理方法包括以下步骤：
[0024] (1)将植物油样品与吸附剂和提取溶剂混合，制得混合物；
[0025] (2)将步骤(1)中得到的混合物进行涡旋振荡，得到上清液；
[0026] (3)将步骤(2)得到的上清液浓缩，得到待测液。

[0027] 在根据本发明的前处理方法的步骤(1)中，植物油样品、吸附剂、提取溶剂可以以任意比例混合。

为了使吸附剂能够更充分地吸附油脂基质，进而使提取溶剂能够更充分地提取BHA、BHT、TBHQ，植物油样品与吸附剂的质量比优选为1:(20-70)、进一步优选为1:(30-60)；相对于0.1g植物油样品，提取溶剂的体积优选为5-20mL、更优选为
7.5-12.5mL。

[0028] 在根据本发明的前处理方法的步骤(2)中，涡旋振荡的功率优选为20-60w、更优选为25-40w；涡旋振荡的时间优选为0.3-5分钟、更优选为1-3分钟。

[0029] 在一个实施方式中，优选地在根据本发明所述的前处理方法的步骤(3)中，将步骤(2)中得到的上清液浓缩至8.0-13.3体积％。

[0030] 本发明中，将步骤(2)中得到的上清液浓缩至8.0-13.3体积％是指，将步骤(2)中得到的上清液浓缩至该上清液的8.0-13.3体积％。

[0031] 在一个优选实施方式中，为了进一步提高BHA、BHT、TBHQ的回收率，本发明的前处理方法还包括对在步骤(3)浓缩后得到的待测液进行干燥，然后用有机溶剂复溶。

[0032] 在根据本发明的方法中，干燥是指将浓缩物中的提取溶剂完全蒸发，从而得到干燥的BHA、BHT和TBHQ。

其中，在本发明的前处理方案中所用的干燥方式可以为氮气吹干、旋转蒸发和真空定量浓缩中的至少一种，为了节省时间，干燥方式优选为氮气吹干。

[0033] 优选地，用有机溶剂将干燥的BHA、BHT和TBHQ复溶至步骤(3)中浓缩后的体积。

用于复溶的有机溶剂可以为任何常规的能够溶解BHA、BHT和TBHQ的溶剂。

为了进一步提高BHA、BHT和TBHQ的回收率，有机溶剂优选选自乙腈、四氢呋喃和甲醇中的至少一种，进一步优选为乙腈或甲醇。

[0034] 在另一优选实施方式中，为了更准确的计量BHA、BHT以及TBHQ的含量，在步骤(3)浓缩前，取相当于所用提取溶剂的一半体积的上清液，然后对该部分上清液进行浓缩、干燥，再用有机溶剂复溶至步骤(3)浓缩后所得的体积。

[0035] 在根据本发明的方法中，所述植物油样品可以为含有BHA、BHT和TBHQ中的一种或多种的任何植物油样品。

采用本发明的前处理方法提取植物油样品中的BHA、BHT和/或TBHQ时，其回收率可以高达77-95％，优选情况下可以达到90-95％。

[0036] 在根据本发明的方法中，所述吸附剂可以为本领域常规的用于吸附油脂基质的吸附剂。

为了能够更充分地吸附植物油中的油脂基质，更好地避免油脂基质堵塞色谱柱，提高BHA、BHT、TBHQ的回收率，所述吸附剂可以选自弗罗里硅土、N-丙基乙二胺键合硅胶、C18键合硅胶和中性氧化铝中的至少一种，优选为中性氧化铝和/或C18键合硅胶。

[0037] 在根据本发明的方法中，所述提取溶剂可以为本领域常规的用于从植物油样品中提取BHA、BHT和TBHQ的有机溶剂。

优选地，所述提取溶剂选自二氯甲烷、丙酮、甲醇和正己烷中的至少一种，进一步优选为丙酮和/或甲醇。

[0038] 另一方面，本发明提供了一种快速检测植物油样品中BHA、BHT、TBHQ的方法，所述方法包括：
[0039] (1)将待测植物油样品用根据本发明的前处理方法进行处理，得到待测液；[0040] (2)将步骤(1)中得到的待测液进行液相色谱分析。

[0041] 在本发明一个特别优选的实施方式中，快速检测植物油样品中BHA、BHT、TBHQ的方法包括以下步骤：(1)将待测植物油样品与吸附剂和提取溶剂在容器中按照一定的比例混合，制得混合物，其中，所述待测植物油样品与吸附剂的质量比为1:(30-60)；相对于0.1g植物油样品，所述提取溶剂的体积为7.5-12.5mL；(2)将步骤(1)中得到的混合物在功率为25-40w条件下涡旋振荡1-3分钟，得到上清液；(3)取相当于提取溶剂的一半体积的上清液，浓缩至8.0-13.3体积％，然后用氮气吹干的方式干燥，再用乙腈或甲醇溶剂复
溶至步骤(3)中浓缩后得到的体积，得到待测液；(4)将得到的待测液进行液相色谱分析。

在该优选的实施方式中，所述吸附剂为中性氧化铝和/或C18键合硅胶，所述提取溶剂为丙酮/或甲醇。

[0042] 根据本发明的快速检测植物油样品中BHA、BHT、TBHQ的方法，BHA、BHT、TBHQ的回收率均可以达到77-95％，优选情况下可以达到90-95％。

[0043] 在本发明中，进行液相色谱分析的方法可以采用本领域常用的方法，例如可以采用UltiMate3000液相色谱仪检测BHA、BHT、TBHQ的浓度。

[0044] 实施例
[0045] 以下通过实施例对本发明作进一步说明。

[0046] 在以下实施例、对比例和试验例中，甲醇、乙酸(色谱纯)购自SIGMA公司。

中性氧化铝(100～300目)购自天津光复公司。

BHA、BHT以及TBHQ标准品购自SIGMA公司。

植物油样品购自中国粮油有限公司，均视为无BHA、BHT、TBHQ的植物油，在以下实施例、对比例和试验例中人为向植物油样品中添加了BHA、BHT、TBHQ混合标准溶液。

在实施例和试验例中使用的液相色谱仪为UltiMate3000液相色谱仪(配备DAD检测器，美国戴安公司)。

[0047] 色谱柱：Agilent C18柱，150mm×4.6mm，5μm；液相色谱条件：流速为0.8mL/min，进样量10μL，柱温25℃；流动相：流动相A为甲醇，流动相B为1％乙酸水溶液，流动相配比见表1；二极管阵列检测器(DAD)检测器波长280nm。

[0048] 表1 流动相配比表
[0049]
时间(min)流动相A(％)流动相B(％)
04060
7.51000
11.51000
13.04060
15.04060
[0050] BHA、BHT以及TBHQ的标准色谱图的制备，具体的操作步骤如下所示：
[0051] 将BHA、BHT和TBHQ标准品分别用甲醇配制成浓度为1000mg/L的标准储备溶液。

用甲醇将BHA、BHT和TBHQ的1000mg/L标准储备溶液配制成浓度均为100mg/L的混合标准溶液；将三者浓度均为100mg/L的上述混合标准溶液用甲醇逐级稀释成浓度分别为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0mg/L的标准溶液，然后用UltiMate3000液相色谱仪进行色谱分析，并根据峰面积对浓度绘制标准曲线。

结果，线性方程分别为TBHQ：Y＝0.119X-0.009，相关系数为0.999；BHA：Y＝0.128X-0.009，相关系数为0.999；BHT：Y＝0.086X-0.006，相关系数为0.999。

[0052] 回收率计算公式：
[0053]
[0054] 相对标准偏差计算公式：
[0055]
[0056] 其中，RSD为相对标准偏差，S为标准偏差，n为实验重复次数，x为每次实验测定值，为n次实验测定值的平均值。

[0057] 检出限(LOD)为，BHA、BHT、TBHQ组分在检测器上产生三倍基线噪声信号时对应的油脂样品中BHA、BHT、TBHQ的浓度。

[0058] 实施例1
[0059] 将0.2g植物油样品、6g中性氧化铝、15mL甲醇和BHA、BHT、TBHQ标准溶液(三者浓度均为100mg/L)200μL在50mL的离心管中进行混合，得到混合物；在涡旋振荡的功率为25W的条件下，将所得的混合物进行涡旋振荡1min，得到上清液；准确量取得到的上清液7.5mL，将其浓缩至0.2mL，然后用氮气吹干的方式干燥，再用1mL的甲醇溶剂复溶，得到待测液。

[0060] 将得到的待测液，用UltiMate3000液相色谱仪进行色谱分析。

根据色谱分析的峰面积通过线性方程得出BHA、BHT、TBHQ的浓度，然后计算BHA、BHT、TBHQ的回收率，回收率分别为80％、77％、80％。

[0061] 实施例2
[0062] 将0.2g植物油样品、12g中性氧化铝、25mL甲醇和BHA、BHT、TBHQ标准溶液(三者浓度均为100mg/L)200μL在50mL的离心管中进行混合，得到混合物；在涡旋振荡的功率为30W的条件下，将所得的混合物进行涡旋振荡3min，得到上清液；准确量取得到的上清液12.5mL，将其浓缩至0.2mL，然后用氮气吹干的方式干燥，再用1mL的甲醇溶剂复溶，得到待测液。

[0063] 将得到的待测液，用UltiMate3000液相色谱仪进行色谱分析。

根据色谱分析的峰面积通过线性方程得出BHA、BHT、TBHQ的浓度，然后计算BHA、BHT、TBHQ的回收率，回收率分别为86％、82％、87％。

[0064] 实施例3
[0065] 将0.2g植物油样品、10g中性氧化铝、20mL甲醇和BHA、BHT、TBHQ标准溶液(三者浓度均为100mg/L)200μL在50mL的离心管中进行混合，得到混合物；(2)在涡旋振荡的功率为40W的条件下，将所得的混合物进行涡旋振荡2min，得到上清液；准确量得到的上清液10mL，并将其浓缩至0.2mL，然后用氮气吹干的方式干燥，再用1mL的甲醇溶剂复溶，得到待测液；
[0066] 将中得到的待测液，用UltiMate3000液相色谱仪进行色谱分析。

根据色谱分析的峰面积通过线性方程得出BHA、BHT、TBHQ的浓度，然后计算BHA、BHT、TBHQ的回收率，回收率分别为94％、90％、95％。

[0067] 实施例4
[0068] 将0.2g植物油样品、10g弗罗里硅土、20mL甲醇和BHA、BHT、TBHQ标准溶液(三者浓度均为100mg/L)200μL在50mL的离心管中进行混合，得到混合物；在涡旋振荡的功率为25W的条件下，将所得的混合物进行涡旋振荡1min，得到上清液；准确量取得到的上清液10mL，将其浓缩至0.2mL，然后用氮气吹干的方式干燥，再用1mL的甲醇溶剂复溶，得到待测液。

[0069] 将得到的待测液，用UltiMate3000液相色谱仪进行色谱分析。

根据色谱分析的峰面积通过线性方程得出BHA、BHT、TBHQ的浓度，然后计算BHA、BHT、TBHQ的回收率，回收率分别为75％、70％、72％。

[0070] 实施例5
[0071] 将0.2g植物油样品、10g C18键合硅胶、20mL甲醇和BHA、BHT、TBHQ标准溶液(三者浓度均为100mg/L)200μL在50mL的离心管中进行混合，得到混合物；在涡旋振荡的功率为25W的条件下，将所得的混合物进行涡旋振荡1min，得到上清液；准确量取得到的上清液10mL，将其浓缩至0.2mL，然后用氮气吹干的方式干燥，再用1mL的甲醇溶剂复溶，得到待测液。

[0072] 将得到的待测液，用UltiMate3000液相色谱仪进行色谱分析。

根据色谱分析的峰面积通过线性方程得出BHA、BHT、TBHQ的浓度，然后计算BHA、BHT、TBHQ的回收率，回收率分别为65％、62％、63％。

[0073] 对比例1
[0074] 向5g植物油样品中加入BHA、BHT、TBHQ标准溶液(三者浓度均为1000mg/ L)250μL，采用液液萃取的方法提取BHA、BHT和TBHQ，具体的方法步骤为：
[0075] (1)将上述加标样品置于15mL具塞离心管中；
[0076] (2)加入8mL甲醇，旋涡混合3min，放置2min，以3000r/min离心5min，取出上清液于25mL容量瓶中；
[0077] (3)将残渣物按步骤(2)再提取2次，合并上清液于25mL容量瓶；
[0078] (4)用甲醇定容至刻线，经0.45μm有机滤膜过滤，滤液用UltiMate3000液相色谱仪进行色谱分析。

[0079] 根据色谱分析的峰面积通过线性方程得出BHA、BHT、TBHQ的浓度，然后计算BHA、BHT、TBHQ的回收率，回收率分别为90％、85％、89％。

[0080] 试验例1
[0081] 分别称取3组0.2g的植物油样品，按照实施例3的方法分别对各组植物油样品进行前处理，不同的是，通过添加BHA、BHT、TBHQ混合标准溶液(三者浓度均为100mg/L)，使得3组植物油样品中，相对于植物油样品的重量，混合标准溶液的浓度分别为5.0mg/kg、20.0mg/kg、100mg/kg(在每一组样品中，BHA、BHT、TBHQ浓度是相同的)，每组样品重复6次。

[0082] 检测按照实施例3的方法得到的BHA、BHT、TBHQ的浓度，并分别计算每组6次重复的BHA、BHT、TBHQ的平均回收率和相对标准偏差(RSD)，其结果如表2所示。

植物油样品的液相色谱图如图2所示；植物油样品加BHA、BHT、TBHQ标准溶液(加标量为100mg/kg)的液相色谱图如图3所示。

[0083] 表2 BHA、BHT以及TBHQ的回收率和精密度
[0084]
[0085] 相比对比例1，采用本发明的检测植物油样品中BHA、BHT、TBHQ的方法，回收率高达90-95％，操作步骤快速简单、工艺污染少且成本低。

[0086] 另外，从表2和图1-3可以看出，采用本发明的用于快速检测植物油样品中BHA、BHT、TBHQ的前处理方法不仅能够对各种常见的植物油样品进行前处理，而且还能够对含有宽范围浓度的BHA、BHT、TBHQ的植物油样品中的BHA、BHT、TBHQ进行准确的检测，且回收率较高、操作步骤快速简单、操作工艺污染少且成本低。

[0087] 以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

[0088] 另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

[0089] 此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

图1
图2
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11图3说 明 书 附 图CN 105738534 A。