绿色木霉产纤维素酶的分离纯化及化学修饰

绿色木霉产纤维素酶的分离纯化及化学修饰
蔡凤;解彦刚;何晓春
【摘要】通过绿色木霉发酵生产纤维素酶,经硫酸铵盐析、透析袋透析后得到纤维素酶的浓缩酶液,利用甲醇为修饰剂对纤维素酶进行化学修饰.结果表明,甲醇对羧基的修饰导致纤维素酶的活力显著降低,与酶活性部位结合的底物能降低酶修饰的失活程度.经红外光谱判断,甲醇所修饰的纤维素酶的侧链基团为羧基,是纤维素酶的活性基团.
【期刊名称】《广东农业科学》
【年(卷),期】2010(037)007
【总页数】3页(P164-166)
【关键词】绿色木霉;纤维素酶;化学修饰;羧基;FTIR
【作者】蔡凤;解彦刚;何晓春
【作者单位】南京理工大学化工学院,江苏,南京,210094;南通职业大学化工系,江苏,南通,226007;南通职业大学化工系,江苏,南通,226007;南通职业大学化工系,江苏,南通,226007
【正文语种】中文
【中图分类】Q814;Q55
随着世界人口的不断增长和经济的发展，粮食短缺和能源危机已经成为人们不得不面对的现实，纤维素及其能量的应用对解决这些问题有着重要的意义。

纤维素酶具
有高效性和安全性，在对环境和生态问题高度重视的今天，利用纤维素酶来实现生物能的转化利用，在饲料、食品、医药、纺织、化工等领域有着巨大的潜在市场。

酶蛋白是极其复杂的生物大分子，它执行许多重要的生物学功能，酶的化学修饰已成为酶学研究领域的一个重要方向。

化学修饰是探索酶活性部位功能基团常用的方法之一[1-2]，其直接目标是修饰酶的活力的必需基团[3]。

研究参与酶活力中心的各种化学基团的性质，对掌握酶的功能以及催化都有重要的意义。

目前对于纤维素酶的化学修饰研究不多。

本研究以绿色木霉产纤维素酶为对象，以甲醇作为修饰剂对其侧链基团进行化学修饰，以期为纤维素酶的功能基团的确定提供理论依据。

1 材料与方法
1.1 试验材料
供试绿色木霉菌种购自北京微生物研究所。

使用所用的试剂有：DNS试剂、CMC溶液、柠檬酸缓冲液、(NH4)3PO4营养液、透析袋处理液（2%NaHCO3、1 mmol/L EDTA），均为国产分析纯。

供试固态发酵培养基：稻草4.0 g，麸皮1.0 g，(NH4)3PO4营养液 12.5mL，
pH 为 5.0。

121℃灭菌 30min，4℃保存待用。

供试仪器包括Bruker EQUINOX 55型遥感傅里叶变换红外光谱仪（德国Bruker
公司产品）和计算机OPUS/IR软件控制系统。

1.2 试验方法
1.2.1 纤维素酶的固体发酵取出于4℃保存的绿色木霉菌种，接种至装有种子液和玻璃珠的锥形瓶中，于30℃摇床以200 r/min振荡1 h，取出2.5mL移入固体发酵培养基中，搅拌均匀后，于30℃培养箱中培养5 d。

1.2.2 酶液的制备固态发酵后，分别加入pH为4.0、5.0、6.0的柠檬酸缓冲液100mL，30℃保温1 h，纱布过滤后，于8500 r/min离心30min(4℃)，分别收
集上清液，即为粗酶液。

取pH为4.0的粗酶液7份，每份15mL，分别用
20%～80%相对饱和度的 (NH4)2SO4于4℃盐析12 h，于8500 r/min离心
20min(4℃)，收集上清液，用pH4.0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液恢复至原体积，在A280与A550条件下分别测定其蛋白质含量及内切酶活力。

再分别取pH5.0、6.0的粗酶液重复上述过程。

1.2.3 酶活测定在1.5mL0.625 g/mL的羧甲基纤维素钠(CMC-
Na,pH5.0Na2HPO4-柠檬酸缓冲溶液配制)溶液中加入0.5mL酶液，于50℃反应30min，用2mL 10%NaOH终止反应，加入3mL DNS溶液，沸水浴15min，
冷却至室温后测550 nm处吸光度。

由葡萄糖标准曲线得还原糖含量，根据还原
糖量比较酶活力[4]。

1.2.4 蛋白含量测定蛋白测定参照文献[5]。

1.2.5 修饰反应条件的选择使用Bruker EQUINOX 55型遥感傅里叶变换红外光谱仪和计算机OPUS/IR软件控制系统测定纤维素酶的红外光谱，比较分析加入甲醇前后纤维素酶的红外光谱，确定甲醇所修饰的纤维素酶的侧链基团[6]。

2 结果与分析
2.1 葡萄糖标准曲线
试验以葡萄糖为标准样，测不同已知浓度的葡萄糖溶液反应后的吸光度，绘制标准曲线，求出在试验操作条件下，吸光度OD550与还原糖浓度的线性关系。

由图1可知，其线性回归方程为：y=0.2662x+0.0331，R2=0.995，说明线性关系良好。

图1 葡萄糖标准曲线
2.2 最佳盐析条件的确定
图2和图3表明：当上清液中硫酸铵相对饱和度为0～30%时，纤维素酶蛋白含
量较多，酶活力也较高；随硫酸铵相对饱和度的逐渐增大，上清液中的纤维素酶蛋白及酶活力越来越小。

当饱和度由30%变化到50%时，上清液的酶活力变化最大，
即所析出沉淀中纤维素蛋白酶的含量最多，此后趋于平稳。

由此判断：缓冲液的pH对盐析影响很小，(NH4)2SO4盐析的最佳相对饱和度区间为30%～50%。

图2 纤维素酶活力与相对饱和度曲线
图3 蛋白含量与相对饱和度关系曲线
2.3 纤维素酶的纯化浓缩
上清液用50%饱和度硫酸铵盐析，沉淀用少量pH4.8醋酸缓冲液溶解，透析袋透析至BaCl2检验无沉淀后，过0.074 mm硅胶柱，收集酶活峰值洗脱液。

纤维素
酶液在透析袋中用PEG20000吸水后，得到浓缩酶液。

2.4 修饰侧链基团的确定
纤维素酶液中加入过量甲醇及反应条件所需的盐酸，于20℃保持数小时，用
PEG20000吸水浓缩至原体积。

测定修饰前后的纤维素酶固体的红外光谱（图4、图5）。

图5中1653cm-1吸收峰表示有C=O存在，较未修饰的1625cm-1的
C=O（图4）略蓝移；指纹区的1020cm-1强吸收峰认为是由酯的C-O伸缩振动引起的；1430cm-1的双峰和2840cm-1、2950cm-1吸收峰是CH3的对称和反对称伸缩峰。

图4中3700～3000cm-1的宽而强的吸收峰为水峰，可能掩盖了应出现在3400～3200cm-1的宽而强的OH吸收峰。

综合以上波谱分析，确定甲醇所修饰的纤维素酶的侧链基团是羧基。

图4 纤维素酶的红外光谱
图5 甲醇修饰后纤维素酶的红外光谱
2.5 甲醇对酶活的影响
向纤维素酶与pH4.8的CMC溶液的反应体系中加入一定体积不同浓度的甲醇，
以去离子水代替甲醇为参比（定义其酶活力为100%），使用DNS法测酶活。

从图6可看出，随着加入的甲醇浓度的增大，经甲醇修饰的纤维素酶的相对活力几
乎呈直线下降[7]，初步判断甲醇对纤维素酶的修饰发生在活性部位或必需基团上。

图6 50℃、pH 5.0 、0.2 mol/L HAc-NaAc缓冲液下纤维素酶活力与不同浓度甲醇曲线
2.6 底物保护作用
以1∶1的比例将甲醇加入不同浓度的CMC醋酸缓冲液中，再加入纤维素酶液，使用DNS法测定于50℃反应30min后的酶活力，以去离子水代替CMC和甲醇作对照（图7）。

从图7可以看出，随着底物浓度的增加，相对酶活不断增大；当CMC浓度为0.5 g/mL时，纤维素酶的相对活力为95%，而CMC浓度为0.1
g/mL时，相对酶活仅为68%。

说明底物对酶具有保护作用，而且这种保护作用随底物浓度的增加而增大。

图7 不同浓度底物对酶活的保护
试验结果表明，底物浓度的增加降低了纤维素酶被甲醇修饰的失活程度，甲醇所修饰的羧基位于纤维素酶的活性部位，而不只是仅仅作为结构成分的基团[8]。

3 结语
利用绿色木霉固体发酵产生的纤维素酶，经分离提纯后，使用甲醇作为修饰剂，测定修饰前后的纤维素酶固体的红外光谱。

首先确定甲醇所修饰的纤维素酶的侧链基团为羧基，通过测定甲醇对酶活的作用，经甲醇修饰的纤维素酶的相对活力下降，判断甲醇对纤维素酶的修饰发生在活性部位或必需基团上，以CMC醋酸缓冲液作为底物，底物浓度的增加降低了纤维素酶被甲醇修饰的失活程度，判定甲醇所修饰的羧基位于纤维素酶的活性部位。

本研究为纤维素酶活性基团的确定提供了理论依据。

参考文献:
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