多重耐药大肠埃希菌质粒介导耐药性的研究

多重耐药大肠埃希菌质粒介导耐药性的研究
卓广超;沈俊娅;朱华;冷建杭;丁禹;汪燕;郑辉;丁晓霞
【摘要】Objective To investigate the plasmid- mediated multidrug resistance in Escherichia coli. Methods Ninety five clinical isolates of multidrug resistant Escherichia coli were col ected. Antimicrobial susceptibility was determined by K- B method. PFGE was used to investigate the clonality of clinical isolates. Plasmid conjugation assay was used by filter mating. An S1- PFGE assay on plasmid was performed to determine the plasmid molecular size. PCR amplification and sequencing were used to screen common antimicrobial resistance genes. Results Ninety- five clinical isolates of Escherichia coli exhibited mul-tidrug resistance to penicil in, cephalosporins, quinolones and tetracycline. PFGE result did not support the evidence of clone dissemination. Resistant isolates harbored conjugant plasmid with 40kb- 330kb size, which encoded penicil in, cephalosporins or quinolones resistant determinants, including CTX- M, TEM typeβ- lactamase genes and gene. Conclusion Clinical isolates of Escherichia coli present severe problem of multidrug resistance. The rapid prevalence of resistance may be mainly determined by conjugant plasmid or horizontal gene transfer instead of simple clone dissemination.%目的：了解临床收集的多重耐药大肠埃希菌克隆播散状况及质粒介导耐药性的特性。

方法通过K- B纸片法明确细菌耐药谱，脉冲场凝胶电泳（PFGE）进行耐药菌株的克隆分型，了解其克隆播散情况，通过质粒接合实验获得耐药性质粒的接合菌，用PCR方法筛选接合菌株的常见耐药基因，并利用S1
酶切质粒再进行PFGE的方法判读分析质粒的分子大小，分析菌株间的质粒水平迁移状况。

结果临床分离95株大肠埃希菌均为多重耐药菌，对青霉素类、头孢菌素类、喹诺酮类、四环素类等药物显示出广泛耐药性，PFGE分型显示克隆传播趋势不明显。

耐药菌株常携带可接合性耐药质粒，质粒分子量大小分布在40~330kb，编码多种对青霉素类、头孢菌素类等药物耐药的耐药基因，包括CTX- M型、TEM型β-内酰胺酶基因，以及质粒介导喹诺酮耐药基因qnr等等。

结论临床大肠埃希菌多重耐药性严重，耐药性的快速传播已非同源克隆细菌的简单播散，可接合质粒造成的耐药基因水平转移可能起到了相当重要的作用。

【期刊名称】《浙江医学》
【年(卷),期】2014(000)022
【总页数】5页(P1851-1855)
【关键词】大肠埃希菌;多重耐药性;质粒
【作者】卓广超;沈俊娅;朱华;冷建杭;丁禹;汪燕;郑辉;丁晓霞
【作者单位】310006 杭州市第一人民医院中心实验室;310006 杭州市第一人民医院中心实验室;310006 杭州市第一人民医院中心实验室;310006 杭州市第一人民
医院中心实验室;310006 杭州市第一人民医院中心实验室;310006 杭州市第一人
民医院中心实验室;310006 杭州市第一人民医院中心实验室;310006 杭州市第一
人民医院中心实验室
【正文语种】中文
大肠埃希菌是医院获得性感染常见病原菌，其耐药机制复杂，包括常见的获得水解酶、靶蛋白突变及外排泵异常表达等[1]。

质粒在大肠埃希菌的耐药形成和传播过
程中扮演了非常重要的角色。

耐药性质粒目前在临床病原菌中非常常见，由于质粒很容易捕获外来基因片段或者和外源DNA整合，因此进化的速度很快，其分子量大小可以达到数十甚至上百kb[2]。

常见的临床病原菌携带的耐药质粒大多为可接合质粒，即通过性菌毛相互接触可以将遗传物质（通常是质粒DNA）从供体菌转移到受体菌[3]。

本研究利用临床收集的大肠埃希菌，通过药敏实验、脉冲场凝胶电泳（PFGE）、质粒接合实验、PCR筛选等方法分析菌株间的质粒水平迁移状况及质粒接合对耐药性的转移作用。

1.1 菌株95株分离自我院2009-01—12住院患者，符合多重耐药菌判断标准的大肠埃希菌，菌株来源标本包括全血、痰液、尿、分泌物、腹水、脑脊液等，菌种确认采用的是生物梅里埃公司的Vitek菌种鉴定仪。

多重耐药菌判断标准：对于青霉素类、含抑制剂β-内酰胺类、头孢菌素类、碳青霉烯类、氨基糖苷类、喹诺酮类6类典型的抗菌药物，如果有其中3类或者3类以上抗菌药物耐药，认为其为多重耐药菌。

1.2 方法
1.2.1 质粒接合通过滤膜法进行质粒接合实验，供体菌为临床分离多重耐药大肠埃希菌，受体菌为利福平耐药的大肠埃希菌菌株EC600。

分别用LB液体培养基培养供体菌和受体菌4h后，按1∶1混合，取20μl混合液点在0.22μm孔径GSWP型硝化纤维素膜上（美国Millipore公司），将纤维素膜放在含有
50μg/ml氨苄青霉素和700g/ml利福平的MH平板上过夜培养，筛选出阳性菌落克隆即为成功接收质粒的受体菌。

1.2.2 药敏实验对临床分离大肠埃希菌通过K-B纸片法进行以下药物的药敏实验：阿米卡星、复方新诺明、美罗培南、亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、头孢吡肟、头孢他啶、头孢唑林、氨苄西林、四环素、氨曲南、环丙沙星、哌拉西林、庆大霉素、头孢哌酮/舒巴坦、头孢噻肟、头孢西丁、阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林
/舒巴坦、头孢呋辛。

药敏折点判断标准参考临床实验室标准化研究所文件（CLSI，2012），标准菌株ATCC25922作为药敏实验质控菌株。

1.2.3 PFGE分型对临床分离大肠埃希菌进行PFGE分子分型，取2ml培养后
菌液进行低熔点胶包埋，再经过蛋白酶K和内切酶XbalI的酶切，PFGE电泳的条件是：6V/cm，脉冲间隔时间5～20s，14℃，0.5×TBE，电场角度120°，总时
间为24h；PFGE条带只有3个或3个以下差异认为它们是具有同源关系的相近克隆。

PFGE所用marker为沙门菌Braenderup血清型H9812菌株酶切产物[4]。

1.2.4 S1酶切鉴定质粒大小细菌包埋后用S1核酸酶（TAKARA公司）1μl于120μl体系中进行酶切，37℃水浴50min，再进行PFGE，PFGE电泳条件为
6V/cm，脉冲间隔时间2.16～63.8s，14℃，0.5×TBE，电场角度120°，总时间
为20h。

S1核酸酶仅可降解细菌染色体DNA而保留环状的质粒DNA，并促使质粒DNA脱离超螺旋状态，再经过PFGE电泳后可精确读出质粒分子量大小。

1.2.5 耐药基因的PCR扩增筛选利用细菌煮沸法制备DNA模板，PCR扩增筛选常见
耐药基因，包括blaCTX-M-1、blaCTX-M-9、blaTEM、blaSHV[5]、blaKPC[6]、blaDHA[7]、qnrA、qnrB、qnrS、aac（6＇）-Ib（可同时扩增出aac（6＇）-
Ib-cr）[8]及armA[9]，所用引物序列、扩增片段长度及退火温度见表1。

1.3 统计学处理实验数据均录入Microsft Office Excel 2003表格，部分结果
采用百分数（%）表示。

PFGE结果胶图使用BioNumerics软件进行同源关系分析。

2.1 临床分离菌株药敏结果临床分离95株大肠埃希菌均为多重耐药菌，耐药
情况非常严重（表2），氨苄西林的耐药率为100%，对头孢菌素的耐药率也很高，三代头孢菌素头孢噻肟的耐药率达到了93.7%，四代头孢菌素头孢吡肟的耐药率
也达到了88.4%。

含抑制剂的头孢菌素保持了较低的耐药率，但整体敏感性也明
显下降，有相当比例的菌株达到了中介，例如头孢哌酮/舒巴坦的耐药率虽只有
21.1%，但中介的比例却占了36.8%，使得非敏感菌株达到了较高的57.9%。

头
孢西丁的敏感性尚可，敏感菌株占68.4%，而氨曲南的敏感率只有8.4%。

碳青霉烯类药物美罗培南和亚胺培南作为治疗多重耐药阴性菌的“王牌”药物虽然保持了较高的敏感性，但也出现了3株耐药菌株，给临床耐药菌的治疗敲响了警钟。

氨
基糖苷类药物阿米卡星的耐药率只有17.9%，可以作为临床治疗的又一选择，而
喹诺酮类药物环丙沙星以及复方新诺明、四环素等药物耐药率都超过了80%，临
床治疗效果已大大下降。

2.2 PFGE分子分型结果77株大肠埃希菌成功进行了PFGE分型，结果显示这
些临床分离株的脉冲型非常分散（图1），条带一致的同一克隆出现很少，具有同一克隆型的菌株数最多不超过4株。

说明本研究收集菌株基本为散发克隆，只有
临床上小范围的耐药传播克隆株，但耐药性传播更重要的原因已变成耐药基因在菌株间的水平迁移，使得各种不同克隆型菌株都演变成临床多重耐药菌。

2.3 可接合性质粒的大小分布95株大肠埃希菌中有73株成功获得了携带耐药
质粒的接合菌，占总菌株数的76.8%，73株接合菌中，表型产超广谱β内酰胺酶（ESBLs）菌株共64株，占87.7%，接合质粒通过S1酶切再PFGE电泳后可精
确判读出质粒大小，大部分菌株仅携带一个可接合性质粒，有10株接合菌携带有两个质粒，质粒大小在40～330kb（图2）。

质粒的大小表现出了很强的多态性，即使是在菌株脉冲型相同的情况下，它们所携带的质粒大小也差别明显。

2.4 耐药基因的PCR筛查对所有73株接合菌进行了耐药基因的PCR扩增筛选，筛选耐药基因包括blaCTX-M-1、blaCTX-M-9、blaTEM、blaSHV、blaKPC、blaDHA、qnrA、qnrB、qnrS、aac（6＇）-Ib及armA，筛选结果（表3）显示有72株接合菌携带blaTEM，是播散最广的β-内酰胺酶，除此之外，CTX-M型
β-内酰胺酶出现得也较多，对于大肠埃希菌来说CTX-M型β-内酰胺酶大多为携
带CTX-M-9组，共37株，CTX-M-1组只有6株。

其它耐药基因携带情况分别
为：blaSHV 2株、blaDHA 3株、qnrB 3株、qnrS 4株、aac（6＇）-Ib 12株，没有发现携带qnrA、blaKPC和armA的菌株。

临床多重耐药菌的泛滥已给感染性疾病的治疗带来了很大难题，尤其对于革兰阴性菌来说，多重耐药大肠埃希菌已经占据了临床分离耐药菌的首位。

本研究收集来自同一家三级甲等医院的95株大肠埃希菌，通过药敏实验明确其耐药谱，并采用PFGE进行耐药菌株的克隆分型，了解其克隆播散情况，再通过质粒接合实验，获得耐药性质粒的接合菌，用PCR方法筛选接合菌株的常见耐药基因，并利用S1
酶切质粒再进行PFGE的方法判读质粒的分子大小，分析菌株间的质粒水平迁移状况及质粒接合对耐药性的转移作用。

所有菌株都对3类或3类以上抗菌药物耐药，且对氨苄西林全部耐药。

它们对头
孢菌素类显示了很高的耐药性，而对含抑制剂的头孢菌素保持了一定的敏感，说明大部分菌株均为产ESBLs菌株。

产ESBLs菌株在国内非常普遍，且大多为质粒携
带耐药基因，一份国内多中心2002—2011年共10年的大肠埃希菌耐药性研究表明，10年间临床分离大肠埃希菌ESBLs携带率已经从52.2%上升到了70.0%，处于一个相当高的耐药水平，而近几年ESBLs携带率在浙江地区也均稳定在60%～70%高区间内[10]。

耐药基因PCR筛查也证实，本研究菌株的ESBLs类型以质粒编码CTX-M-9组为主。

大肠埃希菌对碳青霉烯类药物维持了较低的耐药率，耐药菌株只有3株，而对接
合菌的耐药基因筛选并未发现质粒介导碳青霉烯酶基因blaKPC，说明国内KPC
型碳青霉烯酶在大肠埃希菌中还较少出现。

对于临床治疗来说碳青霉烯类药物是治疗多重耐药革兰阴性菌的最后防线[11]，目前已出现KPC型碳青霉烯酶在同为肠
杆菌科细菌的肺炎克雷伯菌中广泛流行，有报道携带blaKPC质粒的肺炎克雷伯菌ST11克隆型已成为国内主要流行克隆[12]，如果出现blaKPC携带质粒水平转移
至大肠埃希菌，会引起大肠埃希菌KPC型碳青霉烯酶的大规模传播，将给院内感
染性控制带来威胁。

细菌耐药性的流行趋势现在已非简单的克隆播散，耐药基因的水平迁移越来越成为主要原因，而质粒在这种水平转移中扮演了非常重要的角色。

菌株的PFGE图谱显示，临床分离株只出现了小范围的克隆播散情况。

临床分离大肠埃希菌通常携带了多样性非常强的可接合性质粒，可以通过接合作用很方便地在菌株间转移，甚至还可以在不同菌种间交流，大大加快了耐药性在菌株之间的传播速度。

通过S1酶切再进行PFGE的方法可以较为准确地判读出质粒分子量大小，大肠埃希菌所携带的质粒大小变化范围非常大，从40～330kb不等，即使是克隆型相近的菌株，所携带质粒的大小也明显不同，说明接合性耐药质粒很容易在传播过程中发生插入和重组事件，通过基因的水平转移获得外界耐药基因，再一次加快了耐药性的传播。

通过接合菌耐药基因PCR筛查结果，发现临床多重耐药大肠埃希菌大多产ESBLs，其可接合性质粒常编码CTX-M型和TEM型β-内酰胺酶，可以造成青霉素类和头孢菌素类耐药。

喹诺酮类药物的高耐药性主要由于细菌染色体上编码的靶蛋白突变造成，以qnr为代表的质粒介导喹诺酮耐药基因所表现出的耐药性不强，但在接
合菌中筛选到7株qnr阳性菌株。

相对β-内酰胺类药物，氨基糖苷类、喹诺酮类
和四环素类等药物也表现出相当高的耐药率，临床治疗难以选择。

含抑制剂的头孢菌素和碳青霉烯类药物依然是多重耐药大肠埃希菌的重要选择，同时加强院感控制、防止耐药菌的大规模流行传播也已经成为当务之急。

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