迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FliC原核表达及免疫试验

收 稿 日 期 ：２０１７０７１１ 基金项目：国家重点研发计划项目（２０１７ＹＦＤ０５０１０００）；中国博士后科学基金（２０１７Ｍ６１１９３５）；河北省科技厅奖励 性 后 补
助项目（１５９２６６２０Ｈ）；秦皇岛市科 技 局 科 技 支 撑 计 划 （２０１４０１Ａ０６７，２０１４０２Ｂ０４３）；河 北 科 技 师 范 学 院 博 士 启 动 基 金 （２０１５ＹＢ００２） 作 者 简 介 ：张 志 强 （１９８７－ ），男 ，河 北 抚 宁 人 ，讲 师 ，博 士 ，主 要 从 事 动 物 病 原 细 菌 学 研 究 。 通 讯 作 者
试验评估该重研 制 迟 缓 爱 德 华 菌 亚 单 位 疫 苗 和
核酸疫苗靶点的选择奠定基础。
１ 材 料 与 方 法
１．１ 材 料 １．１．１ 菌株、质粒与实验动物 致病性 迟缓爱德 华 菌 ＥＴ１３分离株由东南 大 学 高 大 庆 教 授 惠 赠；迟 缓 爱德华菌阳性血清、原核表达 载体 ｐＥＴ３２ａ、禽 呼 肠 病毒ｓｉｇｍａＣ 蛋白，由河北科技师范学院动物传染病 研究室保存；６周 龄 ～８ 周 龄 清 洁 级 昆 明 小 鼠，购 自 中国医学科学 院 实 验 动 物 研 究 所，试 验 前 自 由 采 食
鞭毛蛋白是 细 菌 鞭 毛 的 主 要 结 构 蛋 白 之 一，在 细菌运动、黏附和侵染宿主 过 程 中 发 挥 重 要 作 用［４］， 是细菌的 重 要 毒 力 因 子 。 ［５］ 研 究 发 现，细 菌 鞭 毛 蛋 白能够活化宿主免疫反应，起到疫 苗佐 剂 的作用，进 一步研究发现，鞭 毛 蛋 白 可 以 通 过 ＴＬＲ５ 通 路 诱 导 炎症反应发生 并 促 使 树 突 状 细 胞 成 熟，该 蛋 白 无 论 是与抗原混合 还 是 融 合 表 达，均 表 现 出 良 好 的 免 疫 效果 。 ［６７］ 除此之外，鞭毛蛋白 本 身 具 有 较 强 的 免 疫 原性，具有一 定 的 免 疫 保 护 力［５］。ＦｌｉＣ 是 构 成 鞭 毛 丝的主要蛋白成分，是目前鞭毛研 究的 焦 点蛋白，其 生物学功能得到一定程度 解 析 。 ［８］ 本 研 究 以 迟 缓 爱 德华菌鞭毛蛋白 ＦｌｉＣ 作 为 研 究 对 象，用 原 核 表 达 方 法获得大量纯化的 ＦｌｉＣ 重 组 蛋 白，并 进 一 步 用 动 物
１ 周 ，以 适 应 环 境 。 １．１．２ 酶 及 其 他 试 剂 ＬＡ 犜犪狇 ＤＮＡ 聚 合 酶，宝 生物工程（大连）有限公司产品；限制性内 切酶及 Ｔ４ 连接 酶，Ｔｈｅｒｍｏ 公 司 产 品；Ｈｉｓ 标 签 单 克 隆 抗 体 （ＨｉｓＭＡｂ）、ＨＲＰ 标记山羊抗小鼠ＩｇＧ 抗体（ＨＲＰ ＩｇＧ）、ＩＰＴＧ 及 Ｎｉ＋ ａｒｇｏｓｅ 填 料，康 维 世 纪 公 司 产 品；弗 氏 完 全 佐 剂、弗 氏 不 完 全 佐 剂，Ｓｉｇｍａ 公 司 产 品；大肠 埃希菌 ＤＨ５α、ＢＬ２１ 感 受态细 胞，全 式 金 公 司产 品；基 因 组 提 取 试 剂 盒、质 粒 小 提 试 剂 盒，Ｏ ＭＥＧＡ 公司产品。 １．２ 方 法 １．２．１ ｆｌｉＣ 基因 克 隆 根 据 ＧｅｎＢａｎｋ 上 公 布 的 迟
（１．河北省预防兽医学重点实验室／河北科技师范学院，河北秦皇岛 ０６６００４； ２．秦皇岛第二医院，河北昌黎 ０６６６００；３．吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春 １３０１１８）
摘 要：为了解迟缓 爱 德 华 菌 鞭 毛 蛋 白 ＦｌｉＣ 的 免 疫 特 性，从 迟 缓 爱 德 华 菌 基 因 组 中 克 隆 出 鞭 毛 基 因 ｆｌｉＣ，并将其构建到原核表达载体上，用原核表达的方法获 得大 量重组 蛋白，将蛋 白纯化后，通 过 动 物 模 型 确 定该蛋白的免疫特性。结果表明，迟缓爱德华菌 鞭 毛 蛋 白 ＦｌｉＣ 具 有 较 强 的 免 疫 原 性，对 免 疫 动 物 应 对 强 毒 株感染具有一定保护 效 果。 将 ＦｌｉＣ 与 牛 血 清 白 蛋 白 （ＢＳＡ）混 合 免 疫 小 鼠 能 够 刺 激 机 体 产 生 较 高 水 平 抗 ＢＳＡ 抗体，说明其佐剂特性。研究表明，迟缓爱德华菌鞭毛蛋白 ＦｌｉＣ 具有优良的免疫原性和佐剂特性，是迟 缓 爱 德 华 菌 的 保 护 性 抗 原 ，具 有 潜 在 的 应 用 价 值 。 关 键 词 ：迟 缓 爱 德 华 菌 ；鞭 毛 蛋 白 ；ＦｌｉＣ；佐 剂 ；免 疫 保 护 力
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动 物 医 学 进 展 ２０１８ 年 第 ３９ 卷 第 ７ 期 （总 第 ３０１ 期 ）
中 图 分 类 号 ：Ｓ８５２．６１２
文 献 标 识 码 ：Ａ
文 章 编 号 ：１００７５０３８（２０１８）０７００２３０５
迟缓爱 德 华 菌 （犈犱狑犪狉犱狊犻犲犾犾犪狋犪狉犱犪）在 水 产 养 殖上危害严重，鱼 类 感 染 该 菌 后 病 死 率 高、易 反 复、 免疫力低下，传统抗生素和化学药 物疗 效 不确切，急 需开发新 型、高 效、安 全 的 防 治 方 法 。 ［１２］ 疫 苗 使 用 在畜禽生 产 上 的 巨 大 成 功 给 水 产 养 殖 提 供 诸 多 借 鉴，多种水产疫苗被开发应用，展现 良 好前景。遗 憾 的是，目前迟缓 爱 德 华 菌 疫 苗 的 研 制 还 远 未 满 足 生 产需求。除此之 外，迟 缓 爱 德 华 菌 可 以 引 起 人 的 多 种类型感染［１］，近 年 来 通 过 食 源 途 径 感 染 的 报 道 不 断增多，说明了本菌在公共卫生学方面的重要性 。 ［３］
动 物 医 学 进 展 ，２０１８，３９（７）：２３２７ ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＶｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
迟缓爱德华菌鞭毛蛋白 ＦｌｉＣ 原核表达及免疫试验
张 志 强１，杨 楠１，李 永 慧２，王 洪 彬１，吴 同 垒１，康 元 环３，莘 余１，史 秋 梅１，高 桂 生１，王 春 凤３