GST-pulldown分离CA-CaRop1和DN-CaRop1的互作蛋白,及亲和差异性的分析

GST-pulldown分离CA-CaRop1和DN-CaRop1的互作蛋白,及亲和差异性的分析
实验设计：GST-Pulldown分离CA-CaRop1和DN-CaRop1的互作蛋白，及亲和差异性的分析
一、重组诱饵蛋白的获得（DN-GST, CA-GST）
1、融合蛋白的诱导表达
一扩，挑取克隆到试管中摇荡培养7h，
二扩，一扩转移500μl菌液到20ml LB培养基中摇荡培养约为1h，至OD值约为0.5~1.0为佳，同时扩上5瓶，保证足够的融合蛋白以备后续实验。

诱导，加入200μl的IPTG,至终浓度为1mM，28℃摇荡诱导培养7h。

取出1ml诱导菌液以及未诱导菌液进行SDS-PAGE表达验证。

剩余菌液5000*g离心5min，去除培养基，加入5ml裂解缓冲液，混匀后5000*g离心5min,收集菌体，-80℃保存备用。

2、缓冲液的配制以及细胞的破碎
裂解缓冲液配方：50mmol/L Tris-Hcl pH 7.5,
150mmol/L NaCl,
1mmol/L EDTA
用时加入 0.3mmol/L DTT,
0.1% NP-40
蛋白酶抑制剂。

细胞裂解之前最好先加入裂解缓冲液（1:10，v/v）,冰浴30min.
冰上超声波细胞破碎程序：
5s, 9s, 4min
离心15min,收集上清液，冰上备用。

二、融合诱饵蛋白的亲和挂柱
1、Glutathione Sepharose4B 珠子的准备：
取出一个干净的层析柱，用剪了头的移液器吸取1ml摇匀了的Glutathione Sepharose4B珠子于柱子中，加入4ml的裂解缓冲液，温和平衡珠子,4℃，1300*g离心30s，去除裂解缓冲液，重复至少5次。

因为珠子的平衡程度与蛋白的亲和程度有着直接的关系。

2、诱饵蛋白与珠子的亲和结合：
将准备好的带GST标签的融合蛋白细胞裂解液加入到准备好的珠子中，冰上温和缓慢摇滚孵育1h，4℃，重力自然过柱，直至所有的细胞裂解液全部过柱。

（控制在3h之内）
3、洗脱
4℃，1300*g 离心30s去除裂解液，再加入4ml裂解缓冲液温和摇滚数次，4℃，1300*g离心去除缓冲液，重复不少于5次，确保杂蛋白去除干净。

三、辣椒总蛋白的提取及定量分析
植物总蛋白提取缓冲液的配制：
50mM Tris-Cl pH 7.6
50mM NaCl
5mM MgCl
5mM EDTA
1mM DTT
0.1NP-40
0.5% Triton X-100
植物蛋白酶抑制剂
植物总蛋白的提取方法：从-80℃中取出辣椒叶片（青枯病处理与未
处理，高温处理与未处理），用液氮迅速研磨碎辣椒材料，加入适量的PVPP及1ml提取缓冲液，研磨混匀并转移至10ml离心管中，再加入1ml提取缓冲液，把研钵中的剩余材料转移到离心管中，冰上备用。

在每个离心管中加入一定量的蛋白酶抑制剂。

4℃,6000*g离心30min,收集上清液，去除组织残渣。

4℃，最大转速离心30min,收集上清液，冰上备用。

四、诱饵蛋白与靶蛋白的亲和结合
1、取出第二步获得的挂着诱饵蛋白的柱子，加入上一步所获得的
植物总蛋白溶液，温和翻滚1h，重力自然过柱，直至所有的溶
液全部过柱。

总的结合反应不要超过5h。

2、4℃，1300*g 离心30s去除植物总蛋白溶液，再加入4ml植物
总蛋白提取缓冲液，温和摇滚数次，4℃，1300*g离心去除缓
冲液，重复不少于5次，确保杂蛋白去除干净。

五、靶蛋白的洗脱
洗脱缓冲液：50 mM Tris/HCl, pH 7.6
10 mM EDTA
1 mM DTT
5 mM MgCl2
500 mM NaCl
在柱子中加入1ml的洗脱缓冲液，温和摇滚数次，4℃，1300*g 离心收集缓冲液，冰上备用，重复3次，将收集到的缓冲液集中在一个离心管中冰上备用。

六、靶蛋白的浓缩及定量分析
洗脱后蛋白的浓缩脱盐：将洗脱液分次加入到浓缩离心柱（3K）上,14,000*g离心10min，最后一次离心30min。

加入400ul低盐离子浓度缓冲液于柱子上，4℃，14,000*g离心10min, 重复3次。

最后收集浓缩靶蛋白溶液。

分析蛋白溶液的浓度，采用考马斯亮蓝法（Bradford法）详情参考
《HPR(羟基丙酮酸还原酶)酶活的测定以及DN-CaRop1和CA-CaRop1对HPR酶活的影响》。

七、 SDS-PAGE分析亲和差异
洗脱的靶蛋白浓缩溶液加入5*SDS上样缓冲液至终浓度为1-2*，混匀，沸水浴10min,离心上样。

上样量约为30ul，顺序为： M,GST+对照、CA-GST+对照、CA-GST+青枯病处理（12%凝胶） M,GST+对照、CA-GST+对照、CA-GST+青枯病处理（7.5%凝胶） * 注意制胶前，清洗干净玻璃板，梳子等，确保除干净干扰杂质；
所用的水及试剂，均需要用干净的双蒸水来制备，防止杂质污染，干扰染色的辨别；
实验全程均需佩戴手套操作。

染色（银染）：
方法1、
银染液1（1000ml）：甲醇50％, 乙酸12％,则甲醇 500ml 冰醋酸 120ml 。

银染液2（1000ml）：甲醇30％，乙酸钠0.4M，戊二醛0.5%，硫代硫酸钠0.1%，
则（含乙酸 1－2ml）甲醇300ml，乙酸钠54.4g，戊二醛10ml，硫代硫酸钠
1g ，乙酸1－2ml。

显色液(1000ml)：无水碳酸钠2.5%，甲醛 0.02%，则无水碳酸钠25g，甲醛
1.5ml
硝酸银（100ml）： 20%硝酸银（过滤后待用）
染色步骤：
1 银染液1 洗2次，每次5分钟
2 银染液2 洗1次，每次30分钟
3 超纯水洗2次，每次1分钟
4 0.5%硝酸银洗30分钟
5 超纯水洗5次，每次1分钟（关键步骤，共计5分钟）显色液显色
6 看到各条带，则倾去显色液, 1％乙酸中止。

方法2
固定液：甲醇 100ml，冰醋酸 25ml，加双蒸水至250ml，反应30min；
双蒸水冲洗3次；
敏化液：甲醇 75ml，戊二醛（25%w/v）1.25ml，硫代硫酸钠(5%w/v) 10ml，醋酸钠（17g），加双蒸水至250ml，反应30min；
双蒸水冲洗3次；
银反应：硝酸银溶液(2.5%w/v) 25ml，甲醛(37%w/v) 0.1ml，加双蒸水至250ml，反应20min；
双蒸水冲洗3次；
显色液：碳酸钠(6.25g)，甲醛(37%w/v) 0.05ml，加双蒸水至250ml
反应2-5min，此步为关键步骤；
终止液：EDTA-Na22H2O(3.65g)，加双蒸水至250ml，反应10min；
双蒸水冲洗3次。

*注意所有实验均需佩戴手套，谨防染色时的污染，妨碍差异辨别。

八、割胶回收差异蛋白片段及质谱分析
分析每一板胶中三个泳道中蛋白条带的差异，同时结合两种不同浓度（12%及7.5%）凝胶中蛋白条带的差异（最好先通过扫描，然后通过图片分析软件进行差异的分析）。

选择差异条带区域（最好找出更多的差异蛋白条带），用超干净的手术刀切下差异条带（或区域），将凝胶装于无酶的离心管中，备用。

送公司质谱分析，或者自己质谱分析。

将得到的蛋白进行生物信息学的分析，选择有意思的蛋白进行后续研究。

* 提取蛋白的质量以及纯度会很大影响实验的成功，故在努力改进实验方法的同时，也需要操作上的小心，谨防外源蛋白的污染以及使用纯度高的药品是实验成功所必须的条件。

本实验设计参考(Huang, Zhao et al. 2006; Nakashima, Chen et al. 2008) 略有改进。

Huang, J., L. Zhao, et al. (2006). "AhSSK1, a novel SKP1-like protein that interacts with the S-locus F-box protein SLF." Plant J 46(5): 780-793.
Nakashima, A., L. Chen, et al. (2008). "RACK1 functions in rice innate immunity by interacting with the Rac1 immune complex." Plant Cell 20(8): 2265-2279.。