猪鼻支原体抗血清的制备与鉴定

猪鼻支原体抗血清的制备与鉴定
李新苹;贺笋;候凤;王钢;曹剑;李延涛
【摘要】猪鼻支原体(Mycoplasma hyrhinis,Mhr)是猪鼻腔的常在菌.将猪鼻支原体与弗氏佐剂共乳化,免疫新西兰大白兔,获得猪鼻支原体兔抗血清.Western blotting检测其特异性;建立间接ELISA方法检测其抗体效价;将获得的猪鼻支原体兔抗血清分别加入猪鼻支原体和猪肺炎支原体培养物中,进行生长抑制试验.结果显示,制备的猪鼻支原体兔抗血清与猪鼻支原体具有反应原性;抗体效价达1∶160 000以上;猪鼻支原体兔抗血清可以显著抑制猪鼻支原体的生长,而对猪肺炎支原体的生长影响较小.本试验结果为鉴定和检测猪鼻支原体提供了方法,也为猪肺炎支原体的分离提供了参考.
【期刊名称】《中国畜牧兽医》
【年(卷),期】2015(042)009
【总页数】5页(P2319-2323)
【关键词】猪鼻支原体;抗血清;间接ELISA;抗体滴度;生长抑制
【作者】李新苹;贺笋;候凤;王钢;曹剑;李延涛
【作者单位】新疆天康畜牧生物技术股份有限公司,乌鲁木齐830011;新疆天康畜牧生物技术股份有限公司,乌鲁木齐830011;新疆天康畜牧生物技术股份有限公司,乌鲁木齐830011;新疆天康畜牧生物技术股份有限公司,乌鲁木齐830011;新疆天康畜牧生物技术股份有限公司,乌鲁木齐830011;新疆天康畜牧生物技术股份有限公司,乌鲁木齐830011
【正文语种】中文
【中图分类】S852.4
猪鼻支原体(Mycoplasma hyrhinis，Mhr)是猪鼻腔的常在菌，可引起猪的肺炎[1]、浆膜炎和关节炎[2]，也是实验室多种细胞常见的感染源之一[3]。

同时，猪鼻支原体在胃癌、食管癌、大肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌等恶性肿瘤组织中检出率高达50%以上[4]，表明猪鼻支原体可在人体组织中存在并与恶性肿瘤的发生存在一定的相关性[5]。

胡元生等[6]研究结果表明血清学检测是支原体病原体诊断的有
效手段。

刘星等[7]用猪鼻支原体的单克隆抗体建立了双抗体夹心ELISA的检测方法，表明血清学检测具有较好的特异性和敏感性，为猪鼻支原体的流行病学研究提供了便利的手段。

但单克隆抗体检测抗原单一，使用具有局限性，且制备及筛选过程复杂[8]，因此本研究制备了猪鼻支原体的多克隆抗体，可与猪鼻支原体具有免
疫原性的多种主要蛋白结合。

此外，猪肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，Mhp)是引起猪支原体肺炎的
主要病原，其分离过程常因猪鼻支原体的繁殖过快而被抑制[9]，因此猪鼻支原体
抗血清可用于猪肺炎支原体分离时抑制猪鼻支原体生长，为猪肺炎支原体的研究奠定基础。

1.1 材料
1.1.1 菌株及蛋白猪鼻支原体(CVCC 354)购自中国兽医药品监察所菌种保藏中心；猪肺炎支原体J株购自ATCC，其蛋白由新疆天康畜牧生物技术股份有限公司实验室制备；改良Friis培养基由新疆天康畜牧生物技术股份有限公司实验室配制。

1.1.2 试剂与耗材 BCA试剂盒购自Pierce公司；山羊抗兔IgG-HRP购自北京中
杉金桥生物技术有限公司；弗氏佐剂、四甲基联苯胺(TMB)、二氨基联苯胺(DAB)均购自Sigma公司；牛血清白蛋白(BSA)购自军事医学科学院；96孔酶标板购自
康宁公司；其他化学试剂均为国产分析纯试剂。

1.1.3 试验动物 2只生长状况相同的健康雄性新西兰大白兔，体重2～3 kg，购自新疆疾病预防与控制中心。

1.2 方法
1.2.1 猪鼻支原体的培养及灭活复苏冻存的猪鼻支原体，接种于改良Friis培养基中，于37 ℃培养至培养物颜色变黄后传代，加入甲醛灭活。

灭活前测定猪鼻支原体的颜色变色单位(CCU)，即取1.8 mL改良Friis培养基至12支无菌试管中，用吸管吸取0.2 mL灭活前的猪鼻支原体至第1支装有1.8 mL改良Friis培养基的试管，并按照此方法依次进行10倍稀释，稀释到第12管(10-1至10-12)，记录颜色变化的管数。

灭活后，取2 mL猪鼻支原体加入改良Friis培养基中，培养3～5 d，观察是否灭活完全。

1.2.2 动物免疫将灭活完全的猪鼻支原体与弗氏佐剂乳化。

1只新西兰大白兔颈背部皮下注射乳化完全的猪鼻支原体，初次免疫用弗氏完全佐剂乳化，第2次及以后用弗氏不完全佐剂乳化。

另取1只作为对照，注射生理盐水。

免疫剂量为2 mL/只，免疫间隔为两周，共免疫3次。

每次免疫前及最后一次免疫后两周，分别进行兔耳缘静脉采血，分离血清，即为猪鼻支原体兔抗血清，用于后续检测。

1.2.3 猪鼻支原体抗原的制备及定量取猪鼻支原体培养物，4 ℃、3 000 r/min离心20 min，弃沉淀[10]。

上清以4 ℃、10 000 r/min离心30 min，收集沉淀，用PBS洗涤3次，于-70 ℃以下反复冻融8次后，超声破碎至透亮澄清。

10 000 r/min离心10 min，收集上清即得到猪鼻支原体蛋白。

BCA试剂盒测定猪鼻支原体蛋白的浓度。

1.2.4 猪鼻支原体兔抗血清的Western blotting检测将制备的猪鼻支原体蛋白经SDS-PAGE分离，再电转移至PVDF膜上，以3% BSA孵育过夜。

然后依次与猪鼻支原体兔抗血清(37 ℃孵育1 h，PBS洗涤3次)及山羊抗兔IgG-HRP(37 ℃孵
育1 h，PBS洗涤3次)共孵育，最后加底物DAB显色并拍照[11]。

1.2.5 间接ELISA法检测猪鼻支原体兔抗血清中特异性抗体水平以猪鼻支原体蛋白作为抗原，间接ELISA法检测猪鼻支原体兔抗血清中猪鼻支原体蛋白的特异性抗体水平。

96孔酶标板用抗原包被，4 ℃过夜；弃去包被液，PBST洗板3次，用封闭液在37 ℃封闭；洗板后分别加入稀释的免疫前和最后一次加强免疫两周后的猪鼻支原体兔抗血清，37 ℃孵育；洗板后加入稀释的山羊抗兔IgG-HRP，100 μL/孔，37 ℃孵育；弃去抗体稀释液后洗板，加入100 μL/孔TMB显色液，室温避光显色；终止液终止反应，用酶标仪测定D450 nm值。

按照棋盘滴定法设计试验[12-13]，分别探索猪鼻支原体蛋白包被的浓度、封闭液的类别和浓度、二抗的稀释度、各个反应的时间等间接ELISA方法的条件。

按照确定的条件，检测猪鼻支原体兔抗血清中特异性抗体水平，D检测值/D阴性(免疫前血清)对照值(Positive/Negative)>2.1判定为阳性，即达到相应的抗体滴度。

1.2.6 猪鼻支原体兔抗血清与猪肺炎支原体蛋白的交叉反应分别将猪鼻支原体和猪肺炎支原体进行SDS-PAGE分离，同时电转移至PVDF膜上，以3% BSA孵育过夜。

然后依次与猪鼻支原体兔抗血清(室温反应1 h，PBS洗3次)及山羊抗兔IgG-HRP(室温反应1 h，PBS洗涤3次)共孵育，最后加底物DAB显色并拍照。

1.2.7 生长抑制试验参照代谢抑制试验方法，分别向接种了猪肺炎支原体和猪鼻支原体的培养物中加入20%猪鼻支原体兔抗血清，37 ℃共培养2～3 d[14-15]，观察其生长情况。

2.1 猪鼻支原体的培养及灭活
猪鼻支原体在改良的Friis培养基中生长状况良好，每次灭活前测定其抗原含量，结果显示抗原含量均不低于109 CCU/mL；灭活检验结果表明其灭活完全。

2.2 猪鼻支原体蛋白的制备及定量
由图1可知，将离心除杂、反复冻融并超声后获得的猪鼻支原体蛋白用BCA法进
行定量，得到D570 nm值代入标准曲线方程y=0.0013x+0.0783(R2=0.9966)，测得猪鼻支原体蛋白的浓度为1 095 μg/mL。

2.3 猪鼻支原体兔抗血清特异性鉴定
以制备的猪鼻支原体蛋白作为抗原，猪鼻支原体兔抗血清作为一抗，进行Western blotting检测，结果显示在55、40 ku等处出现了蛋白与血清结合的条带(图2)，表明免疫的猪鼻支原体兔抗血清中产生了针对猪鼻支原体的抗体。

2.4 间接ELISA方法检测猪鼻支原体兔抗血清的抗体滴度结果
按照棋盘滴定法设计试验，最终确定猪鼻支原体间接ELISA方法的条件：猪鼻支
原体蛋白的包被浓度为2.5 μg/μL，37 ℃孵育1 h后4 ℃包被过夜；封闭液选择3% BSA，37 ℃孵育2 h；二抗的稀释度为1∶10 000；室温避光显色15 min后终止反应，测定D450 nm值。

将猪鼻支原体免疫的最后一次血清分别按1∶10 000、1∶20 000、1∶40 000、1∶80 000、1∶160 000、1∶320 000、1∶640 000稀释，用建立的间接ELISA 方法进行检测，测定D450 nm值，以免疫后阳性血清与免疫前的阴性血清的比值作为纵坐标建立抗体滴度曲线，结果见图3。

由图3可知，猪鼻支原体免疫后的兔抗血清抗体滴度达到1∶160 000以上。

2.5 猪鼻支原体与猪肺炎支原体的交叉反应
分别将制备的猪鼻支原体和猪肺炎支原体蛋白调整浓度至1 μg/μL，作为抗原，以制备的猪鼻支原体兔抗血清作为一抗，进行Western blotting检测，结果见图4。

由图4可知，猪鼻支原体大部分蛋白质条带均可与猪鼻支原体抗血清反应，而猪
肺炎支原体的P70、P54蛋白可与猪鼻支原体兔抗血清结合。

2.6 生长抑制试验
由图5可知，猪肺炎支原体和猪鼻支原体分别与猪鼻支原体兔抗血清共孵育后，
猪肺炎支原体由于其生长产酸后培养基颜色变黄(1#)，加入猪鼻支原体兔抗血清后
其生长稍受抑制，但影响不大(2#)，表明猪肺炎支原体中与猪鼻支原体抗血清反应的蛋白质条带可能不是其主要免疫原性蛋白。

而猪鼻支原体的生长明显受到抑制(4#)，生长缓慢，与Western blotting结果一致。

猪鼻支原体不仅可以感染猪和人体组织，也是细胞培养的常见污染物。

常用的猪鼻支原体诊断技术和方法主要有培养法、PCR法和ELISA技术[16]，但猪鼻支原体培养周期较长，故很少用于猪鼻支原体的诊断。

而ELISA技术需要相应的抗体作为检测试剂，且目前市场上尚无商品化的猪鼻支原体检测试剂盒，故制备猪鼻支原体抗血清对于建立猪鼻支原体检测技术十分必要。

制备抗血清鉴别和检测病原时，血清的效价影响着检测的灵敏度和特异性。

本试验将灭活的猪鼻支原体蛋白与弗氏佐剂乳化后免疫新西兰大白兔，制备得到了猪鼻支原体兔抗血清，抗体效价不低于1∶160 000。

建立的检测其抗体水平的间接ELISA方法为猪鼻支原体血清或黏膜抗体间接检测方法的建立奠定了基础。

猪肺炎支原体和猪鼻支原体常引起猪肺脏的尖叶、心叶、中间叶和膈叶前缘呈“肉样”或“虾肉样”实变，使其易继发其他致病菌(如多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌等)的感染[17]，使猪死亡率升高。

同时，猪肺炎支原体和猪鼻支原体具有一定的同源性，王涛等[18]用ELISA法检测抗体时，结果发现猪肺炎支原体和猪鼻支原体存在严重的交叉反应，但并未给出具体结果。

由Western blotting结果可知，P97、P46、P36等猪肺炎支原体主要的免疫原性蛋白[19]不能与猪鼻支原体抗血清结合，所以猪鼻支原体抗血清不能抑制猪肺炎支原体的生长，与后续的生长抑制试验的结果相符。

即本研究制备的猪鼻支原体兔抗血清可显著抑制猪鼻支原体的生长，而对猪肺炎支原体的生长影响较小。

故推测制备的猪鼻支原体兔抗血清可用于猪肺炎支原体的分离，解决分离时常因猪鼻支原体生长过快而被掩盖的难题，为猪支原体肺炎的分离提供方法。

本研究制备了高效价的猪鼻支原体兔抗血清，建立了检测猪鼻支原体抗体的间接
ELISA方法，为鉴定和检测猪鼻支原体提供了试剂和方法。

同时进行了猪鼻支原体兔抗血清与猪肺炎支原体的交叉反应及生长抑制试验，为猪肺炎支原体的分离提供了思路。

*通信作者：贺笋(1980-)，男，河南南阳人，兽医师，研究方向：猪传染性疾病
的预防与防治，Tel：************；E-mail:****************
【相关文献】
[1] Razin S，Yogev D，Naot Y.Molecular biology and pathogenicity of
Mycoplasmas[J].Microbiol Mol Biol Rev，1998，62(4):1094-1156.
[2] 曹玉璞，叶元康.支原体与支原体病[M].北京:人民卫生出版社，2000.
[3] Elkind E，Rechnitzer H，Vaisid T，et al.Mycoplasma hyorhinis upregulates calpastatin and inhibits calpain-dependent proteolysis in SH-SY5Y neuroblastoma cells[J].FEMS Microbiol Lett，2010，304(1):62-68.
[4] 马华崇，马泓，张艳丽，等.胃癌组织中猪鼻支原体的分离培养与鉴定[J].中国人畜共患病杂志，2003，19(2):31-33.
[5] Namiki K，Goodison S，Porvasnik S，et al.Persistent exposure to Mycoplasma induces malignant transformation of human prostate cells[J].PLoS One，2009，4(9):e6872.
[6] 胡元生，温和，周银娣，等.三种肺炎支原体检测方法的比较[J].临床输血与检验，2008，1:9-11.
[7] 刘星，张丽芳，杨玉萍，等.抗猪鼻支原体单克隆抗体的研制及双抗体夹心ELISA检测法的建
立[J].中国比较医学杂志，2008，18(3):55-58.
[8] 张艳丽，孟麟，李燕，等.抗猪鼻支原体单克隆抗体的制备与鉴定[J].宁夏医学院学报，2003，1:6-8.
[9] Lin J H，Chen S P，Yeh K H，et al.Mycoplasma hyorhinis in Taiwan：Diagnosis and isolation of swine pneumonia pathogen[J].Veterinary Microbiology，2006，115(1-3):111-116.
[10] 刘茂军，靳岷，杜改梅，等.检测猪肺炎支原体抗体间接ELISA方法的建立[J].江苏农业学报，2007，23(5):437-441.
[11] 熊焰，孙霞，苟琳.猪肺炎支原体MY-99株膜蛋白SDS-PAGE分析及免疫原性研究[J].畜牧
兽医学报，2004，1:74-78.
[12] 张桂荣.牛结核病特异抗体间接ELISA检测方法的建立及初步应用[D].武汉：华中农业大学，2006.
[13] 丁志勇.猪肺炎支原体血清抗体间接ELISA检测方法的建立及初步应用[D].南京：南京农业大学，2010.
[14] 刘茂军，邵国青，周勇岐，等.一株猪肺炎支原体强毒株的分离和鉴定[J].江苏农业学报，2009，2:308-310.
[15] 吴移谋，叶元康.支原体学[M].第2版.北京：人民卫生出版社，2008.
[16] Liu W，Fang L R，Li S，et plete genome sequence of Mycoplasma hyorhinis strain HUB-l[J].Journal of Bacteriology，2010，192(21):5844-5845.
[17] Li B，Du L，Xu X，et al.Transcription analysis on response of porcine alveolar macrophages to co-infection of the highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus and Mycoplasma hyopneumoniae[J]. Virus Res，2015，
196:60-69.
[18] 王涛，赵满丽，孙卫东.猪鼻支原体间接血凝及ELISA检测方法的初步建立[J].中国畜禽种业，2012，11：31-33.
[19] Bouh K C，Shareck F，Dea S.Monoclonal antibodies to Escherichia coli-expressed
P46 and P65 membranous proteins for specific immumodetection of Mycoplasma hyopneumoniae in lungs of infected pigs[J].Clin Diagn Lab Immunol，2003，10(3):459-468.。