利用彗星试验研究菲对蚕豆DNA的损伤

利用彗星试验研究菲对蚕豆DNA的损伤
高曦;盛月慧;高彦征;陈则友;胡小婕
【摘要】以蚕豆(Vicia faba)为对象、以菲为多环芳烃(PAHs)代表物开展彗星试验,用Komet Version 6.0软件进行彗星图像分析,并选择评价参数研究PAHs污染的DNA损伤效应.以Olive尾动量(OTM)作为DNA损伤的评价参数,细胞彗星试验中蚕豆根尖DNA的损伤程度随菲质量浓度(0～0.6 mg· L-1)升高而显著增大.最高浓度组(0.6 mg·L-1)OTM值比阴性对照增加132.63％,存在剂量依赖性,表明菲能诱导蚕豆根尖DNA损伤.在培养液中菲质量浓度为0.1 mg·L-1条件下培养蚕豆,0～12h时DNA损伤程度随时间延长而增大,12 h时OTM值为38.82±4.48;12～24 h时DNA损伤程度则随时间延长而趋小.为确定菲污染导致DNA损伤的途径,进行非细胞彗星试验,结果表明,0.05 mg·L-1菲即可造成显著DNA损伤(OTM值为22.27±0.42),且DNA损伤程度随菲浓度提高而增大.菲对蚕豆根尖细胞可能存在直接的DNA损伤效应.
【期刊名称】《生态与农村环境学报》
【年(卷),期】2014(030)004
【总页数】6页(P515-520)
【关键词】菲;DNA损伤;彗星试验;蚕豆
【作者】高曦;盛月慧;高彦征;陈则友;胡小婕
【作者单位】南京农业大学土壤有机污染控制与修复研究所,江苏南京210095;南京农业大学土壤有机污染控制与修复研究所,江苏南京210095;南京农业大学土壤有机污染控制与修复研究所,江苏南京210095;南京农业大学土壤有机污染控制与
修复研究所,江苏南京210095;南京农业大学土壤有机污染控制与修复研究所,江苏南京210095
【正文语种】中文
【中图分类】X53
多环芳烃（PAHs）是一类广泛存在于环境中的有机污染物，具有慢性毒性、致癌、致畸和致突变性［1］。

由于性质较稳定，PAHs在自然环境中难降解，易持留。

PAHs对人体健康的损伤一直是国内外环境领域的研究热点之一，尽管其致癌机制尚不明确，但诱导有机体染色体畸变和DNA损伤被公认为是PAHs致癌的关键环节［2］。

近年来，有关PAHs遗传毒性的研究备受关注［2］。

CEBULSKA⁃WASILEWSKA等［3］研究了警察由于职业原因暴露于致癌多环芳烃（c⁃PAHs）环境中的淋巴细胞DNA损伤，发现c⁃PAHs暴露能显著影响细胞的
修复过程，并可危害人体健康。

PERERA等［4］研究了PAHs暴露对新生儿和母体DNA损伤的影响，发现新生儿体内PAH⁃DNA加合物水平较母体显著增高。

AOUADENE等［5］用中国仓鼠卵巢细胞进行彗星试验，分析了工业区和城市中
被PAHs污染河流沉积物的DNA损伤效应。

彗星试验（comet assay）又叫单细胞凝胶电泳试验（single cell gel electrophoresis，SCGE），是一种灵敏性高的遗传毒性研究方法，常被用作检测诸如DNA单链和双链断裂、碱性位点、不完全修复位点和DNA交联等多种类型的DNA损伤［6］。

1996年KOPPEN等［7］首次报道了利用植物材料开展彗
星试验，观察到甲基磺酸甲酯（MMS）、甲基磺酸乙酯（EMS）、丝裂霉素C （MMC）、氯化镉（CdCl2）、重铬酸钾（K2Cr2O7）和三氯化铬（CrCl3）等
都能引起显著的DNA损伤。

借助彗星试验，植物可被用作监测PAHs污染的生物感应器［8］。

然而，迄今国内外有关利用彗星试验来研究PAHs对植物DNA损
伤的资料却很少［8］。

蚕豆（Vicia faba）易于栽培，并被广泛用于杀虫剂等有毒化学物质的致突变试验［7］。

以菲为PAHs代表物，用蚕豆根尖细胞进行彗星试验，旨在探讨菲对蚕豆DNA的损伤效应，揭示暴露时间对菲引起的DNA损伤的影响及DNA损伤途径，试图为PAHs的早期监测和预警、PAHs污染生态毒理指标的完善等提供理论依据。

1.1 主要试剂
菲购自Fluka，w＞97%；低熔点琼脂糖（LMP）购自Solarbio，生物技术级；EMS购自Sigma，w＞99%。

1.2 供试植物
供试植物为大白皮蚕豆。

挑选大小一致、饱满无虫的蚕豆种子，用φ为5%的次氯酸钠浸泡10 min进行表面消毒。

用自来水冲洗干净，再以去离子水充分清洗。

然后在室温下用去离子水浸泡24 h，期间换水2～3次。

将浸泡后的种子放在底部
铺有湿润滤纸的培养皿上，在温度为（22±1）℃、湿度为70%条件下培养3 d，每天光照14 h，［光］照度4 000 lx。

然后用半强度霍格兰营养液保持滤纸湿润，在相同条件下再培养3 d，此时蚕豆根长为3～5 cm。

1.3 细胞核分离
细胞核的分离参照GICHNER［9］的方法，并根据试验室条件微调。

种子染毒处
理后用刀片切下1 cm长的蚕豆根尖并用去离子水清洗。

将根尖放入直径7 cm、
在冰上预冷过的培养皿中，加入500 μL冷PBS缓冲液，使根尖伸展开。

用新刀
片将根尖轻轻切成薄片。

将培养皿在冰上保持倾斜，使分离的细胞核容易进入缓冲液。

1.4 彗星试验
彗星试验采用最常用的3层凝胶结构，具体步骤参照GICHNER［9］的方法。

3
层凝胶制备好后，将载玻片放置在4℃冰箱中（不少于5 min）。

移去盖玻片，将
载玻片放在盛有新配制的4℃电泳缓冲液（1 mmol·L-1Na2EDTA和300 mmol·L-1NaOH，pH值＞13）的水平电泳槽中。

细胞核先在缓冲液中裂解5 min，使DNA解旋。

之后在26 V、300 mA条件下电泳15 min（溶液温度保持在4℃）［10］。

电泳结束后，载玻片用冷的400 mmol·L-1三羟甲基氨基甲烷（Tris）（pH值 7.5）浸泡 5 min，用80 μL 20 μg·mL-1溴化乙锭（EB）染色5 min。

然后浸入冰水中，去除过量EB，盖上盖玻片。

染色后尽快用荧光显微镜（ZEISS Axion Imager A1）观察彗星图像。

荧光显微镜的激发波长选用546／12 nm，发射波长为575～640 nm。

对每个载玻片，在200倍荧光显微镜下随机选取50个清晰细胞核图像进行观察并用电荷耦合器件（CCD）摄像机拍摄。

用Komet Version 6.0软件分析彗星图像，选用以下常用参数评价DNA损伤程度：彗星拖尾长度、彗星尾部DNA相对含量、尾动量和 Olive尾动量（Olive tail moment，OTM）。

试验中每处理设3个平行，每个平行观察1个载玻片，每个载玻片取50个细胞核数据的中位数作为其数值。

对于每个处理，取3个平行的平均数并计算标准差［11］。

1.5 细胞彗星试验分析（cellular comet assay）
用去离子水配制1、2、4、6和8 mmol·L-1EMS溶液。

配制菲的甲醇溶解母液，然后用去离子水分别稀释母液至0.05、0.1、0.2、0.4和0.6 mg·L-1，控制溶液中w（甲醇）＜0.1%。

选取10粒根长（约为4 cm）一致的蚕豆种子，将根浸于300 mL上述系列溶液中，于20～22℃黑暗条件下染毒2 h［7］。

同时设不添加菲（含等量甲醇）的阴性对照（NC），以及含4 mmol·L-1（0.496 g·L-1）EMS 的阳性对照（PC）。

在研究暴露时间对DNA损伤影响的试验中，将蚕豆根尖浸入0.1 mg·L-1菲溶液中分别染毒处理0、2、4、8、12、16和24 h，同时设不添加菲（含等量甲醇）的阴性对照（NC）。

之后按1.3节所述方法分离细胞核，按1.4节所述方法进行彗星试验。

1.6 非细胞彗星试验分析（acellular comet assay）
制备包埋有未染毒处理的根尖细胞细胞核的彗星试验载玻片。

将载玻片浸入含上述不同浓度菲的400 mmol·L-1Tris溶液（20℃，pH值7.5）中2 h［9］。

阴性对照为将载玻片浸入不添加菲的Tris溶液中，阳性对照为将载玻片浸入含2 mmol·L-1EMS的Tris溶液中。

处理后，将载玻片浸入冷的去离子水中冲洗3次，每次5 min。

然后按照彗星试验方法进行解旋、电泳、染色、观察拍摄和软件分析。

1.7 数据分析
采用SPSS 13.0软件对试验数据进行统计分析。

对不同处理与阴性对照间的测定
指标进行单因素方差分析（one⁃way ANOVA）和 Tukey多重比较。

2.1 DNA损伤评价参数的选择
采用商业化的彗星图像分析软件Komet Version 6.0，选择OTM、彗星尾部
DNA相对含量、尾动量和彗星拖尾长度这4个常用参数分析EMS对蚕豆根尖细
胞DNA的损伤程度，结果见表1。

由表1可知，尾动量与彗星拖尾长度的标准差较大，标准差与平均值之比最大分别为22.73%和18.04%，表明这2个参数数据的离散程度较大，不适合作为评价DNA损伤的参数。

ρ（EMS）为2、4、6和8 mmol· L-1处理组OTM值和彗星尾部DNA相对含量与对照差异极显著（P＜
0.01）；ρ（EMS）为1 mmol·L-1处理组OTM值与对照差异极显著（P＜
0.01），彗星尾部DNA相对含量则与对照无显著差异。

因此，选用OTM作为评价DNA损伤的参数。

2.2 利用细胞彗星试验分析菲对蚕豆根尖细胞DNA的损伤
图1为菲染毒2 h对蚕豆根尖细胞DNA损伤的彗星图像。

阳性对照为相同条件下用4 mmol·L-1EMS处理蚕豆根尖细胞。

EMS引发的DNA损伤为32.49±1.65（OTM值），与阴性对照差异极显著（P＜0.01）。

阴性对照彗星图像的拖尾长
度明显小于0.6 mg·L-1菲处理组，其对应的OTM值分别为16.21±1.71和
37.71±3.01。

与阴性对照相比，0.6 mg·L-1菲处理组OTM值增加132.63%。

彗星图像（图1）和彗星试验OTM数据（图2）均表明，随着菲质量浓度提高（0～0.6 mg·L-1），DNA损伤增大，存在剂量依赖性，表明菲具有诱导DNA损伤的效应。

2.3 暴露时间对菲引起的DNA损伤的影响
利用细胞彗星试验评估0.1 mg·L-1菲引发的DNA损伤与暴露时间的关系，结果
见图3。

图3显示，试验0～12 h时，DNA损伤随时间延长而极显著增加（P＜0.01），2 h时DNA损伤的OTM值较对照增加59.4%，且差异达极显著水平
（P＜0.01）。

最大的DNA损伤效应出现在暴露12 h时（OTM值为
38.82±4.48）。

试验12～24 h时，DNA损伤趋小，24 h时DNA损伤的OTM
值为30.16±2.58，低于暴露8 h时（33.78±3.42）。

2.4 利用非细胞彗星试验分析DNA损伤
为确定菲引发DNA损伤的途径，进行非细胞彗星试验。

经过2 h处理，4 mmol·L-1EMS诱发了42.63±2.43（OTM值）的DNA损伤，与阴性对照差异极显著（P＜0.01）。

图4显示，随着菲质量浓度升高（0～0.6 mg·L-1），DNA损伤极显著增大（P＜0.01），OTM值从阴性对照的17.39±0.44增至0.6 mg·L-1
菲处理组的42.19±1.98。

而且，0～0.1 mg·L-1菲处理组DNA损伤随菲浓度提
高而增加较快，0.2～0.6 mg·L-1菲处理组DNA损伤随菲浓度提高的增幅相对平缓。

上述结果表明，菲可能对蚕豆根尖细胞DNA有直接的损伤效应。

彗星试验中常用OTM、彗星尾部DNA相对含量、尾动量和彗星拖尾长度这4个
参数来评价DNA损伤的程度，选择不同的参数会对试验结果产生较大影响。

EMS 是已知的基因毒性试剂，对烟草等植物细胞DNA的损伤存在剂量-效应关系［9］。

通过检测EMS对蚕豆根尖细胞的DNA损伤，优选OTM作为评价DNA损伤的
参数。

OTM可同时反映彗尾中DNA含量和彗尾形状特征，是定量化DNA损伤
程度的常用指标［12］。

PAHs对动物等DNA损伤的彗星试验已有报道。

崔昕毅［13］用彗星试验研究了芘对蚯蚓的DNA损伤，发现50、100和200 μg·kg-1芘可诱导极显著的DNA
损伤（P＜0.01），但暴露浓度150 μg·kg-1时的DNA损伤小于50 μg·kg-1时，没有得到污染剂量依赖关系，这可能是由于代谢芘时产生的迟滞效应，也可能是因为DNA在受损的同时也会被修复。

笔者尝试采用彗星试验来评价PAHs对蚕豆DNA的损伤，得出蚕豆根尖暴露于0.1 mg·L-1菲溶液2 h即可造成显著的DNA 损伤，且损伤程度与菲浓度间存在剂量依赖关系，但其内在机制仍待探讨。

一般认为PAHs毒性效应主要来源于代谢过程［14］，PAHs在代谢过程中产生许多中
间产物，参与机体内氧化还原并产生大量活性氧（ROS）［2，15］。

为抵御和清除ROS，植物体合成并激活一系列抗氧化酶［16］。

陆志强等［17］发现，在
10 mg·L-1芘和萘胁迫下，秋茄幼苗叶片、根尖的过氧化物酶（POD）和超氧化
物歧化酶（SOD）活性与对照组相比均有显著提高。

卢晓丹等［18］得出，0～1.8 mg·L-1菲处理144 h后，黑麦草根和茎叶中POD活性均随菲浓度增加而先
升高后降低，即低菲污染可激发供试植物酶活性，而高菲污染则对酶活性有抑制作用。

PAHs诱导产生的ROS如果不能及时清除，有可能直接或者间接作用于DNA 或者DNA修复系统，从而引起DNA损伤。

ARYA等［19］研究表明，过量的ROS可诱导蛋白质分解以及膜的脂质过氧化，并引起DNA损伤。

笔者研究观察
到的蚕豆DNA损伤可能是由PAHs代谢产生的过量ROS所致，其具体原因有待
进一步研究。

时间效应揭示了指标响应随暴露时间的变化特征，有助于正确评价PAHs的DNA 损伤效应［20］。

为研究暴露时间对菲引起的DNA损伤的影响，将蚕豆根尖置于0.1 mg·L-1菲溶液中染毒0～24 h，得出染毒12 h的蚕豆细胞DNA损伤最大（图3）。

这一结果也被其他研究所佐证。

刘泓等［21］发现菲胁迫12 h后，拟南芥叶片SOD和POD活性明显高于对照，说明清除超氧阴离子自由基及过量
H2O2的机制已启动。

POURRUT等［11］在铅对蚕豆DNA损伤效应的彗星试
验中发现，染毒0～12 h时DNA损伤随时间延长而增大，12 h后可观察到DNA 损伤减弱，并推测该现象与植物中快速有效的铅解毒系统有关。

植物彗星试验表明，遗传毒性物质和ROS因子造成的双重损伤压力会使细胞发生DNA损伤反应（DNA⁃damage responses），导致细胞在进行有丝分裂前可以通过光复活（photoreactivation）、核苷酸切除修复（nucleotide excision repair）和碱基切除修复（base excision repair）等修复机制使DNA损伤得到修复，从而维持
基因组和物种的稳定性［22-23］。

蚕豆可能存在类似的ROS清除机制以及PAHs解毒和DNA修复系统，而且这些清除、解毒和修复机制在暴露于菲中12 h 后显现效果，导致笔者试验中12 h后DNA损伤降低。

基因毒性试剂引发的DNA损伤依赖于它们跨越细胞膜或核膜，使细胞内的酶激活或失活，改变自由基去除剂水平和目标细胞群的修复能力，为测试这些细胞过程对诱导DNA损伤的影响，发展了非细胞彗星试验［9］。

笔者研究中，为确定有关
菲引发DNA损伤的途径，利用非细胞彗星试验评估了菲对DNA的直接效应，发现培养2 h后菲可引起DNA损伤。

阳性对照的试剂EMS是一种直接作用的单官
能团烷化剂，有强烈的DNA损伤效应［9］。

该试验也观察到EMS能直接诱导DNA损伤。

POURRUT等［11］为研究铅是否有直接的蚕豆根细胞DNA损伤效应，同样进行了非细胞彗星试验，发现铅不能直接诱导蚕豆根细胞DNA损伤。

GICHNER［9］用前诱变物（promutagen）邻苯二胺（O⁃PDA）处理分离的烟
草根细胞核，进行非细胞彗星试验，同样没有检测到DNA损伤。

一般认为，人体中PAHs发挥其生物学毒性主要是通过在细胞内代谢活化成有毒中间代谢产物，
然后对细胞中大分子物质如DNA、蛋白质和脂质等造成不可逆的损伤来完成［2］。

非细胞彗星试验破坏了细胞结构，分离出细胞核，菲无法被代谢活化。

根据人体中PAHs造成DNA损伤的可能机制，菲不能直接引发DNA损伤。

但细胞
核直接暴露于菲，亲脂性有机污染物菲容易分配到核膜或进入细胞核。

非细胞彗星试验中观察到的菲对DNA的损伤可能是由于菲进入到细胞核并形成活性物质，从而引起DNA损伤。

国内外鲜见应用非细胞彗星试验研究PAHs直接引发植物细胞DNA损伤的报道。

PAHs是否能够直接引发植物细胞DNA的损伤有待进一步研究。

彗星试验中OTM适合用作评价菲诱导蚕豆根尖细胞DNA损伤的参数。

0～0.6 mg·L-1菲污染胁迫下，菲对蚕豆根尖细胞具有DNA损伤效应，且DNA损伤程度随菲浓度升高而增大。

试验0～12 h时，菲（0.1 mg·L-1）对蚕豆根尖细胞DNA的损伤程度随暴露时间延长而增大；试验12～24 h时，DNA的损伤程度则随时间延长而减弱。

非细胞彗星试验结果表明，从蚕豆根尖细胞中分离的细胞核直接暴露于菲溶液（0～0.6 mg·L-1）中能够造成其DNA损伤，且DNA损伤程度随菲浓度提高而增大，菲可能有直接的DNA损伤效应。

【相关文献】
［1］ HARITASH A K，KAUSHIK C P.Biodegradation Aspects of Poly⁃cyclic Aromatic Hydrocarbons（PAHs）：A Review［J］.Journal of Hazardous Materials，2009，169（1／2／3）：1-15.
［2］王远萍.电子垃圾拆解区多环芳烃暴露与新生儿脐带血淋巴细胞DNA损伤及血清P53、P21蛋白表达的关系［D］.汕头：汕头大学，2011.
［3］ CEBULSKA⁃WASILEWSKA A，WIECHEC A，PANEK A，et al.In⁃fluence of Environmental Exposure to PAHs on the Susceptibility of Lymphocytes to DNA⁃Damage Induction and on Their Repair Ca⁃pacity［J］.Mutation Research，2005，588（2）：73-81. ［4］ PERERA F，TANG D，WHYATT R，et al.DNA Damage From Pol⁃ycyclic Aromatic Hydrocarbons Measured by Benzo［a］pyrene⁃DNA Adducts in Mothers and Newborns From Northern Manhattan，the World Trade Center Area，Poland，and China［J］. Cancer Epidemiology Biomarkers＆Prevention，2005，14（3）：709-714.
［5］ AOUADENE A，GIORGIO C D，SARRAZIN L，et al.Evaluation of the Genotoxicity of River Sediments From Industrialized and Unaf⁃fected Areas Using a Battery of Short⁃Term
Bioassays［J］.Environ⁃mental and Molecular Mutagenesis，2008，49（4）：283-299. ［6］ CENKCI S，YILDIZ M，CIGERCI I H，et al.Evaluation of 2，4-D and Dicamba Genotoxicity in Bean Seedlings Using Comet and RAPD Assays［J］.Ecotoxicology and Environmental Safety，2010，73（7）：1558-1564.
［7］ KOPPEN G，VERSCHAEVE L.The Alkaline Comet Test on Plant Cells：A New Genotoxicity Test for DNA Strand Breaks in Vicia faba Root Cells［J］.Mutation Research，1996，360（3）：193-200.
［8］ VENTURA L，GIOVANNINI A，SAVIO M，et al.Single Cell Gel E⁃lectrophoresis （Comet）Assay With Plants：Research on DNA Re⁃pair and Ecogenotoxicity Testing ［J］.Chemosphere，2013，92（1）：1-9.
［9］ GICHNER T.DNA Damage Induced by Indirect and Direct Acting Mutagens in Catalase⁃Deficient Transgenic Tobacco Cellular and Acellular Comet Assay［J］.Mutation Research，2003，535（2）：187-193.
［10］GICHNER T，PATKOVA Z，SZAKOVA J，et al.Toxicity and DNA Damage in Tobacco and Potato Plants Growing on Soil Polluted With Heavy Metals［J］.Ecotoxicology and Environmental Safety，2006，65（3）：420-426.
［11］POURRUT B，JEAN S，SILVESTRE J，et al.Lead⁃Induced DNA Damage in Vicia faba RootCells：PotentialInvolvementof Oxidative Stress［J］.Mutation Research，2011，726（2）：123-128.
［12］张琼，伍琴，高香玉，等.二溴联苯醚对纤细裸藻的生态遗传毒性效应［J］.中国环境科学，2010，30（6）：833-838.
［13］崔昕毅.黑碳对沉积物中疏水性有机物的生物富集、降解与基因毒性的作用机制［D］.杭州：浙江大学，2010.
［14］SCHOENY R，CODY T，WARSHAWSKY D，et al.Metabolism of Mutagenic Polycyclic Aromatic Hydrocarbons by Photosynthetic Al⁃gal Species［J］.Mutation Research，1988，197（2）：289-302.
［15］王欣心，金银龙.多环芳烃遗传毒性研究进展［J］.环境与健康杂志，2010，27（2）：
174-176.
［16］汪承润，王晓蓉，于红霞，等.运用蚕豆幼苗叶片生物标志物评价铅污染土壤［J］.环境科学，2008，29（11）：3246-3251.
［17］陆志强，郑文教，马丽.萘和芘胁迫对红树植物秋茄幼苗膜透性及抗氧化酶活性的影响［J］.厦门大学学报：自然科学版，2008，47（5）：757-760.
［18］卢晓丹，高彦征，凌婉婷，等.多环芳烃对黑麦草体内过氧化物酶和多酚氧化酶的影响［J］.农业环境科学学报，2008，27（5）：1969-1973.
［19］ARYA S K，BASU A，MUKHERJEE A.Lead Induced Genotoxicity and Cytotoxicity in Root Cells of Allium cepa and Vicia faba［J］. The Nucleus，2013，56（3）：183-189. ［20］邓欢，郭光霞，乔敏.多环芳烃污染土壤毒性评价指标的研究进展［J］.生态毒理学报，
2009，4（1）：1-13.
［21］刘泓，崔波，叶媛蓓，等.拟南芥对多环芳烃菲胁迫的早期响应［J］.中国生态农业学报，2009，17（5）：949-953.
［22］曹玉伟，马军，郭长虹，等.植物彗星试验及其在生态毒理监测中的应用［J］.生态毒理学报，2009，4（2）：183-189.
［23］TUTEJA N，AHMAD P，PANDA B B，et al.Genotoxic Stress in Plants：Shedding Light on DNA Damage，Repair and DNA Repair Helicases［J］.Mutation Research，2009，681（2／3）：134-149.。