膜片钳技术及应用ppt参考课件
合集下载
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
㎜，壁的厚度在0.2㎜以上。管壁越厚，拉 制出的电极尖端管壁也越厚，电极的跨壁 电容就越小，噪声也就越低。
2020/4/29
12
玻璃微电极及膜片的几何形状
2020/4/29
13
电极拉制仪
2020/4/29
14
拉制方法：两步拉制法。
第一步：使玻璃软化，并拉开一个距离，形 成一个细管，即拉制电极的颈部；
2020/4/29
19
建立高阻封接
在显微镜下找到微电极，移动三维操纵仪， 使电极尖端接触细胞，形成高阻封接。
2020/4/29
20
建立高阻封接
高阻封接形成是进行膜片钳实验的关键 一步。微电极尖端与细胞膜形成封接的过程， 可以采用软件发出1mV脉冲电压作用于微电极， 造成膜两侧电位差发生变化，产生电极电流， 再通过显示屏，观察电极电流幅度的变化来 确定封接程度。在电极未入溶液之前，在显 示器上可见一直线。
2020/4/29
27
基本原理
膜片钳能获得膜上钙离子通道的离子电 流，但不能对离子的移动进行实时定位， 不 能定量分析离子浓度。激光扫描共聚焦显微 镜可以对钙离子的移动进行实时定位, 但无法 对单个离子通道的离子移动信号( 如单通道电 流)进行分析。
第二步：使用较低的热度，拉断细管部，成 为两个基本相同的玻璃微电极，此步控制 电极的尖端。一般拉制出的玻璃微电极尖 端直径为1~5μm。
2020/4/29
15
涂胶和抛光
对玻璃微电极进行涂胶和抛光。 涂胶（疏水性涂料，如硅酮树脂）主要
是为了减小电极的跨壁电容。
2020/4/29
16
抛光仪
抛光是指将玻璃微 电极靠近加热的铂丝， 从而使电极尖端变光滑 的过程。抛光主要目的 是。防止电极尖端刺破 细胞，利于高阻封接。
2020/4/29
23
全细胞记录法(Whole-cell recording)
在高阻抗封接做好后，再给一个很小的 负压，将电极覆盖的膜吸破，使电极内与整 个细胞内相通，用这个方法可记录进出整个 细胞的电流。
2020/4/29
24
内面向外膜片(inside-out patch)
高阻封接形成后，在将微管电极轻轻提 起，使其与细胞分离，电极端形成密封小泡， 在空气中短暂暴露几秒钟后，小泡破裂再回 到溶液中就得到“内面向外”膜片。
膜片钳技术
2020/4/29
1
膜片钳技术
向细胞内注射恒定或变化的电流刺激， 纪录由此引起的膜电位的变化，这叫做电流 钳技术。在具体实验中，可通过给予细胞一 系列电流脉冲刺激，诱发细胞产生动作电位。
2020/4/29
2
电压钳技术是通过向细胞内注射一定的
电流，抵消离子通道开放时所产生的离子流， 从而将细胞膜电位固定在某一数值。由于注 射电流的大小与离子流的大小相等、方向相 反。因此它可以反映离子流的大小和方向。
2020/4/29
3
膜片钳技术
膜片钳技术与电流钳、电压钳技术在 命名上并不完全一致，后两者是从电学概 念的角度命名的，而“膜片钳”主要是从 机械物理学的角度命名的。
2020/4/29
4
膜片钳技术
从字面上理解，膜片钳技术钳制的是“膜 片”，是指采用尖端经处理的微电极与细胞 膜发生紧密接触，使尖端下的这片细胞膜在 电学上与其他细胞膜分离，这大大降低了背 景噪声，使单通道微弱的电流得以分辨出来。
2020/4/29
5
膜片钳技术
所以，膜片钳技术是一种通过微电极 与细胞膜之间形成紧密接触的方法，采用 电压钳或电流钳技术对生物膜上的离子通 道的电活动进行记录的微电极技术。膜片 钳技术是一种特殊的电压钳/电流钳技术。
2020/4/29
6
膜片钳技术
用特制的玻璃微吸管吸附于细胞表面，使 之形成10～100GΩ的密封，被孤立的小膜片 面积为μm2量级，内中仅有少数离子通道。然 后对该膜片实行电压钳位，可测量单个离子 通道开放产生的pA量级的电流，这种通道开 放是一种随机过程。通过观测单个通道开放
2020/4/29
17
电极液的充灌
对于尖端较细的玻璃微电极，膜片钳实 验中常用的方法是：在微电极尾部施加负压 使尖端充灌电极内液，然后用注射器在微电 极尾部充灌电极内液，最后轻弹微电极杆步 使其内的气泡排出。
充灌长度为电极的1/3。
2020/4/29
18
制备细胞标本
从理论上来讲，膜片钳实验用的细胞标 本可来自体内各种组织细胞，只要细胞表面 光滑，能与微电极尖端形成高阻封接即可。 但在标本制备上，不同组织细胞间联接牢固 程度不同，采用的分离方法也不完全相同。 大体上包括冲洗、酶解消化或机械分离以及 清洗等步骤。
和关闭的电流变化，可直接得到各种离子通
道开放的电流幅值分布，并分析膜电位与离 子浓度等之间的关系。
2020/4/29
7
膜片钳实验系统虽然可因研究目的不同 而有所区别，但其基本组成是相同的，包括 膜片钳放大器和接口，显微镜和视频监视器 以及防震台和屏蔽罩等。
2020/4/29
8
倒置显微镜、防震台、屏蔽罩、三 维操纵仪
2020/4/29
25
外面向外膜片（Outside-out patch ）
在全胞记录式的基础上，拉开电极使之 与胞体脱离，这是附在电极尖端的膜片又可 自动地将电极尖端口封住。此膜片的外侧面 向外其是在全细胞记录的基础上改进而成。
2020/4/29
26
膜片钳技术的应用
2008年，第二军医大学基础部生物物理研究 所的研究人员采用膜片钳和激光扫描共聚焦 显微镜，同步实时系统观察心肌细胞钙离子 的释放。
2020/4/29
21
高阻封接形成的电流图
2020/4/29
22
膜片钳技术四种基本记录模式
细胞吸附膜片(cell-attached patch) 将两次拉制后经加热抛光的微管电极置于
清洁的细胞膜表面上，形成高阻封接，在细 胞膜表面隔离出一小片膜，既而通过微管电 极对膜片进行电压钳制，高分辨测量膜电流， 称为细胞贴附膜片。由于不破坏细胞的完整 性，
2020/4/29
倒 置 显 微 镜
三维操纵仪
9
膜片钳放大器
2020/4/29
10
膜片钳实验流程
膜片钳实验方法包括： 制备玻璃微电极； 制备细胞标本； 建立高阻封接； 电流记录。
2020/4/29
11
制备玻璃微电极
拉制微电极 材料：硼硅酸盐毛细玻璃管。 要求：玻璃毛胚外径1.3~1.7㎜，内径1.0~1.2
2020/4/29
12
玻璃微电极及膜片的几何形状
2020/4/29
13
电极拉制仪
2020/4/29
14
拉制方法：两步拉制法。
第一步：使玻璃软化，并拉开一个距离，形 成一个细管，即拉制电极的颈部；
2020/4/29
19
建立高阻封接
在显微镜下找到微电极，移动三维操纵仪， 使电极尖端接触细胞，形成高阻封接。
2020/4/29
20
建立高阻封接
高阻封接形成是进行膜片钳实验的关键 一步。微电极尖端与细胞膜形成封接的过程， 可以采用软件发出1mV脉冲电压作用于微电极， 造成膜两侧电位差发生变化，产生电极电流， 再通过显示屏，观察电极电流幅度的变化来 确定封接程度。在电极未入溶液之前，在显 示器上可见一直线。
2020/4/29
27
基本原理
膜片钳能获得膜上钙离子通道的离子电 流，但不能对离子的移动进行实时定位， 不 能定量分析离子浓度。激光扫描共聚焦显微 镜可以对钙离子的移动进行实时定位, 但无法 对单个离子通道的离子移动信号( 如单通道电 流)进行分析。
第二步：使用较低的热度，拉断细管部，成 为两个基本相同的玻璃微电极，此步控制 电极的尖端。一般拉制出的玻璃微电极尖 端直径为1~5μm。
2020/4/29
15
涂胶和抛光
对玻璃微电极进行涂胶和抛光。 涂胶（疏水性涂料，如硅酮树脂）主要
是为了减小电极的跨壁电容。
2020/4/29
16
抛光仪
抛光是指将玻璃微 电极靠近加热的铂丝， 从而使电极尖端变光滑 的过程。抛光主要目的 是。防止电极尖端刺破 细胞，利于高阻封接。
2020/4/29
23
全细胞记录法(Whole-cell recording)
在高阻抗封接做好后，再给一个很小的 负压，将电极覆盖的膜吸破，使电极内与整 个细胞内相通，用这个方法可记录进出整个 细胞的电流。
2020/4/29
24
内面向外膜片(inside-out patch)
高阻封接形成后，在将微管电极轻轻提 起，使其与细胞分离，电极端形成密封小泡， 在空气中短暂暴露几秒钟后，小泡破裂再回 到溶液中就得到“内面向外”膜片。
膜片钳技术
2020/4/29
1
膜片钳技术
向细胞内注射恒定或变化的电流刺激， 纪录由此引起的膜电位的变化，这叫做电流 钳技术。在具体实验中，可通过给予细胞一 系列电流脉冲刺激，诱发细胞产生动作电位。
2020/4/29
2
电压钳技术是通过向细胞内注射一定的
电流，抵消离子通道开放时所产生的离子流， 从而将细胞膜电位固定在某一数值。由于注 射电流的大小与离子流的大小相等、方向相 反。因此它可以反映离子流的大小和方向。
2020/4/29
3
膜片钳技术
膜片钳技术与电流钳、电压钳技术在 命名上并不完全一致，后两者是从电学概 念的角度命名的，而“膜片钳”主要是从 机械物理学的角度命名的。
2020/4/29
4
膜片钳技术
从字面上理解，膜片钳技术钳制的是“膜 片”，是指采用尖端经处理的微电极与细胞 膜发生紧密接触，使尖端下的这片细胞膜在 电学上与其他细胞膜分离，这大大降低了背 景噪声，使单通道微弱的电流得以分辨出来。
2020/4/29
5
膜片钳技术
所以，膜片钳技术是一种通过微电极 与细胞膜之间形成紧密接触的方法，采用 电压钳或电流钳技术对生物膜上的离子通 道的电活动进行记录的微电极技术。膜片 钳技术是一种特殊的电压钳/电流钳技术。
2020/4/29
6
膜片钳技术
用特制的玻璃微吸管吸附于细胞表面，使 之形成10～100GΩ的密封，被孤立的小膜片 面积为μm2量级，内中仅有少数离子通道。然 后对该膜片实行电压钳位，可测量单个离子 通道开放产生的pA量级的电流，这种通道开 放是一种随机过程。通过观测单个通道开放
2020/4/29
17
电极液的充灌
对于尖端较细的玻璃微电极，膜片钳实 验中常用的方法是：在微电极尾部施加负压 使尖端充灌电极内液，然后用注射器在微电 极尾部充灌电极内液，最后轻弹微电极杆步 使其内的气泡排出。
充灌长度为电极的1/3。
2020/4/29
18
制备细胞标本
从理论上来讲，膜片钳实验用的细胞标 本可来自体内各种组织细胞，只要细胞表面 光滑，能与微电极尖端形成高阻封接即可。 但在标本制备上，不同组织细胞间联接牢固 程度不同，采用的分离方法也不完全相同。 大体上包括冲洗、酶解消化或机械分离以及 清洗等步骤。
和关闭的电流变化，可直接得到各种离子通
道开放的电流幅值分布，并分析膜电位与离 子浓度等之间的关系。
2020/4/29
7
膜片钳实验系统虽然可因研究目的不同 而有所区别，但其基本组成是相同的，包括 膜片钳放大器和接口，显微镜和视频监视器 以及防震台和屏蔽罩等。
2020/4/29
8
倒置显微镜、防震台、屏蔽罩、三 维操纵仪
2020/4/29
25
外面向外膜片（Outside-out patch ）
在全胞记录式的基础上，拉开电极使之 与胞体脱离，这是附在电极尖端的膜片又可 自动地将电极尖端口封住。此膜片的外侧面 向外其是在全细胞记录的基础上改进而成。
2020/4/29
26
膜片钳技术的应用
2008年，第二军医大学基础部生物物理研究 所的研究人员采用膜片钳和激光扫描共聚焦 显微镜，同步实时系统观察心肌细胞钙离子 的释放。
2020/4/29
21
高阻封接形成的电流图
2020/4/29
22
膜片钳技术四种基本记录模式
细胞吸附膜片(cell-attached patch) 将两次拉制后经加热抛光的微管电极置于
清洁的细胞膜表面上，形成高阻封接，在细 胞膜表面隔离出一小片膜，既而通过微管电 极对膜片进行电压钳制，高分辨测量膜电流， 称为细胞贴附膜片。由于不破坏细胞的完整 性，
2020/4/29
倒 置 显 微 镜
三维操纵仪
9
膜片钳放大器
2020/4/29
10
膜片钳实验流程
膜片钳实验方法包括： 制备玻璃微电极； 制备细胞标本； 建立高阻封接； 电流记录。
2020/4/29
11
制备玻璃微电极
拉制微电极 材料：硼硅酸盐毛细玻璃管。 要求：玻璃毛胚外径1.3~1.7㎜，内径1.0~1.2