水稻WRKY转录因子基因OsWRKY21在培育植物抗病品种中的应用[发明专利]

(10)申请公布号 (43)申请公布日 2013.12.18C N 103451225 A (21)申请号 201210183789.X
(22)申请日 2012.06.05
C12N 15/82(2006.01)
C12N 15/84(2006.01)
A01H 5/00(2006.01)
(71)申请人中山大学
地址510275 广东省广州市海珠区新港西路
135号
(72)发明人许新萍 杨宝发 金寿恒
(74)专利代理机构广州市华学知识产权代理有
限公司 44245
代理人苏运贞
裘晖
(54)发明名称
水稻WRKY 转录因子基因OsWRKY21在培育植
物抗病品种中的应用
(57)摘要
本发明属于农业生物技术领域，公开了水稻
WRKY 转录因子基因OsWRKY21在培育植物抗病品
种中的应用。

本发明采用反向遗传学方法研究
如SEQ ID NO.1所示的水稻WRKY 转录因子基因
OsWRKY21的功能，发现OsWRKY21基因在水稻抗稻
瘟病的防御反应中起正调控作用。

将OsWRKY21基
因克隆入合适的植物表达载体，转化水稻，获得的
转基因水稻对稻瘟病的抗性显著增强。

因此，可以
利用OsWRKY21基因改良水稻及其它作物的抗病
性状，培育出抗稻瘟病转基因植物新品种。

(51)Int.Cl.
权利要求书1页 说明书6页
序列表3页 附图5页
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书1页 说明书6页序列表3页 附图5页(10)申请公布号CN 103451225 A
*CN103451225A*
1/1页
1.水稻WRKY 转录因子基因OsWRKY21在培育植物抗病品种中的应用，其中，所述的水稻WRKY 转录因子基因OsWRKY21的编码核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.根据权利要求1所述的水稻WRKY 转录因子基因OsWRKY21在培育植物抗病品种中的应用，其特征在于：所述的植物为水稻。

3.根据权利要求1所述的水稻WRKY 转录因子基因OsWRKY21在培育抗病植物品种中的应用，其特征在于步骤如下：应用农业生物技术方法，将水稻WRKY 转录因子基因OsWRKY21转化入植物细胞，得到表达OsWRKY21蛋白的植物品种。

权 利 要 求 书CN 103451225 A
水稻WRKY转录因子基因OsWRKY21在培育植物抗病品种中
的应用
技术领域
[0001] 本发明属于农业生物技术领域，特别涉及水稻WRKY转录因子基因OsWRKY21在培育植物抗病品种中的应用。

背景技术
[0002] 水稻病害是导致水稻产量下降和品质劣化的主要因素之一，培育并推广抗病品种是防治水稻病害最为安全有效的方法。

但是，传统的抗病育种不仅受可利用抗性遗传资源少的限制，而且选育周期过长，难以抗衡快速变异的病原微生物。

而利用单个功能基因来对水稻抗病性进行改良的基因工程策略也没有达到理想的抗病效果。

近年来，随着对植物与病原微生物相互识别机制和信号转导途径了解的深入，人们认识到主开关基因（master-switch genes）如转录因子等在植物抗病基因工程中有着广阔的应用前景（Gurr and Rushton,2005）。

[0003] 研究表明，植物在应对外界病原微生物的长期进化过程中发展了一系列积极的防御机制来保护自身。

当与毒力病原物发生相互作用时，植物利用模式识别受体（PRRs）识别病原物相关的分子模式（PAMPs），诱导PAMP触发性免疫应答（PTI），以阻抑病原物生长。

另一类防御反应是由植物抗性（R）基因产物（R蛋白）直接或间接地识别生理小种特异的病原物效应子（无毒蛋白）而导致效应子触发性免疫应答（ETI），以阻截入侵病原物。

而且，局部的PTI和ETI通常又激活周围甚至远端植物组织中的防御机制，导致系统获得抗性（SAR）的发展，抵抗潜在的再次入侵（An and Mou,2011;Bernoux et al.,2011）。

[0004] 病原菌侵染引发的植物防御反应与大量植物宿主基因的转录激活有关。

这些病原菌诱导的基因编码具有抗菌活性的病程相关（PR）蛋白、参与抗菌化合物（植物抗毒素）生物合成的酶、降解毒性物质的酶以及与植物防御应答信号转导有关的调控蛋白等（van Loon et al.,2006）。

因此，植物宿主基因的转录调节是植物防御反应的中心部分，而转录调控基因表达在多数情况下是由反式作用的转录因子特异地识别并结合顺式作用的启动子元件来实现的。

一个或少数几个转录因子可以调控一系列下游抗病防御反应基因的表达，有可能通过导入或改良转录因子的基因工程方法来综合改良植物抗病性状。

因此，探寻在水稻抗病防御反应中具有正调控作用的转录因子基因对培育抗病转基因水稻新品种有着非常重要的意义。

发明内容
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种水稻WRKY转录因子基因OsWRKY21在培育抗稻瘟病植物品种中的应用。

[0006] 本发明的目的通过下述技术方案实现：水稻WRKY转录因子基因OsWRKY21在培育抗稻瘟病植物品种中的应用；
[0007] 所述的水稻WRKY转录因子基因OsWRKY21的编码核苷酸序列如下所示：
[0008] ATGGCGATGCTGGGGAGCTCGTCGGCGGTGGTGCTGGAGCTGATGACGAT
[0009] GGGGTACCAGTCGGCGGCGTACCTCGGCGAGCTGCTCCGGGCGGCGTCCC
[0010] CGGCGCAGGCAGGGGATGAGCAGCAGGAGCTCGCCGCGGAGATCCTCCG
[0011] CTGCTGCGACCGCGTCATCGCCGAGCTGAACCGGGGAGGAGCCACTGGTG
[0012] CTACTACCGGCAAGAAGCGGAAGGCGGCGGAGTCCGCCGCCGCCGCCGC
[0013] CGTGACCTCCCCTTCTCTCCCCGTCACGCCGACCAAAAGAAGGGCGCGTG
[0014] GCGCGGAGGCGGTGAGGGAGGTGAGGAGCGGCACGACGACGGACGGGT
[0015] TCATCTGGAGGAAGTACGGGCAGAAGGAGATCAATGGCTGCAAGCACCCG
[0016] AGGCTCTACTACCGCTGCGCGTTCAGGGGCCAGGGCTGCCTCGCCACGCG
[0017] GCGGGTGCAGCAGTCGCAGTCGCAGGACGACCCGGCCGCGGCGTTCGTG
[0018] ATCGCCTACTACGGCGAGCACACCTGCGGAGGCGACGCCGCCGCCGCCGC
[0019] CGCGTGCCGGGACGGGGAACTAATGCCACCTGCCGTCATCAACTCCGGCG
[0020] CGTCGAGCTTCGCCGCCGCTTGGAACATGGCCTCGCGTGAGCCGGCGTCG
[0021] TCGCTCGCCGTCGAGCGGAGGAGCTGCGACGGCGACGCTCCCAGCGAGA
[0022] CGTCGCAGGGGTGGTCTCCCTCCTTCTCGTCGGAGGTGGAGCTGGACGTG
[0023] GTGGGATTCGACCTCGCCGGAGCCGACTCGTCGGCGTCGCCGGTGTGGGA
[0024] GTTCTTGAATGGCAGCTTCGACTGGGAATTCGTCATCAACTCCCTCTGA；
[0025] 所述的植物指的是对稻瘟病菌敏感的禾本科植物，优选为水稻；
[0026] 所述的水稻WRKY转录因子基因OsWRKY21在培育抗稻瘟病植物品种中的应用的步骤如下：应用农业生物技术方法，将水稻WRKY转录因子基因OsWRKY21转化入植物细胞，得到表达OsWRKY21蛋白的植物品种。

[0027] 其中，使用PCR技术，从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的OsWRKY21基因部分以及全长DNA或与其同源的一段DNA。

将上述分离到包含OsWRKY21基因的序列与合适的植物表达载体连接，转化植物，获得表达OsWRKY21基因的抗病转基因植物。

[0028] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：与传统的抗病育种技术相比，植物抗病基因工程技术可以突破物种间的生殖隔离和远缘杂交不亲合性，在较短的时间内实现目标性状的定向改良，给作物提供更为全面而持续、广谱且特异的保护。

然而，目前在植物抗病基因工程中，大多数是通过转入或改良个别功能基因的方法来提高作物的抗病性，抗病效果往往不太稳定或不够彻底。

本发明的发明人通过基因功能研究，发现OsWRKY21基因在水稻抗稻瘟病的防御反应中起正调控作用，即OsWRKY21基因能够提高水稻抗稻瘟病的能力。

OsWRKY21基因是转录因子基因，其在植物体内过量表达时，可以转录激活一系列下游抗病功能基因的表达，赋予转基因植物良好的抗病效果，从而克服转入个别功能基因的不足之处。

附图说明
[0029] 图1是用105/ml稻瘟病菌00-193a孢子悬浮液喷施处理三周龄水稻苗后的OsWRKY21基因的表达谱分析图。

[0030] 图2是用2mM SA喷施处理三周龄水稻苗后的OsWRKY21基因的表达谱分析图。

[0031] 图3是用100μM JA喷施处理三周龄水稻苗后的OsWRKY21基因的表达谱分析图。

[0032] 图4是0.5mM BTH喷施处理三周龄水稻苗后的OsWRKY21基因的表达谱分析图。

[0033] 图5是载体pFGC1008的结构示意图。

[0034] 图6是T3代OsWRKY21过量表达纯合植株（株系6、10）的分子检测图；上面一行是内参基因UBC（AK059694）的RT-PCR结果，中间一行是OsWRKY21基因的RT-PCR结果，下面一行是OsWRKY21基因的PCR结果；由于上游检测引物与载体序列配对，因此野生型植株PCR结果为阴性。

[0035] 图7是OsWRKY21过量表达增强水稻对稻瘟病菌抗性的检测图；其中，
[0036] A：T3代OsWRKY21过量表达纯合植株（株系6、10）和野生型植株生长至3周龄时，人工喷雾法接种稻瘟病菌00-193a孢子悬浮液，7天后每株水稻剪取第4片叶中间10cm长部分拍照；
[0037] B：各个株系20片叶的10cm长叶片感性病斑数目的平均值和误差分析。

感性病斑数目的测量使用软件image J完成，差异显著性分析使用SPSS 13.0完成，**表示P值<0.01。

[0038] 图8是T3代OsWRKY21 RNAi纯合植株（株系2、9）的分子检测图；上面一行是内参基因UBC（AK059694）的RT-PCR结果，中间一行是OsWRKY21基因的RT-PCR结果，0.5mM BTH处理后12小时取样，同时设置一组未处理的野生型植株作对照，下面一行是OsWRKY21基因的PCR结果；由于上游检测引物与载体序列配对，因此野生型植株PCR结果为阴性。

[0039] 图9是OsWRKY21基因沉默使水稻对稻瘟病菌侵染更敏感的检测图；其中，[0040] A：T3代OsWRKY21 RNAi纯合植株（株系2、9）和野生型植株生长至3周龄时，0.5mM BTH预处理2天后，人工喷雾法接种稻瘟病菌00-193a孢子悬浮液，7天后每株水稻剪取第4片叶中间10cm长部分拍照；
[0041] B：各个株系20片叶的10cm长叶片感性病斑数目的平均值和误差分析。

感性病斑数目的测量使用软件image J完成，差异显著性分析使用SPSS 13.0完成，**表示P值<0.01。

具体实施方式
[0042] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

[0043] 首先，对于实施例的内容进行简要概述：本发明前期对水稻受稻瘟病菌侵染24小时后的全基因组表达谱芯片进行了分析，发现水稻WRKY转录因子基因OsWRKY21的表达能被稻瘟病菌侵染所诱导，由于OsWRKY21基因的生物学功能尚未见报道，因此本发明对OsWRKY21基因在植物抗病中的功能和应用开展了研究。

本发明的发明人从稻瘟病菌诱导的水稻叶片cDNA文库中分离克隆出包含OsWRKY21基因全长编码框（SEQ ID NO.1）的DNA 片段。

采用荧光定量PCR技术分析OsWRKY21基因在多种因子刺激下的表达谱，结果表明OsWRKY21基因的表达能被SA、BTH和JA处理及稻瘟病菌侵染诱导而剧烈上调（图1～4）。

在水稻中过量表达OsWRKY21基因，转基因植株对稻瘟病的抗性得到极大提高（图6和7）。

而采用RNA干扰技术抑制OsWRKY21基因的表达，BTH诱导的水稻对稻瘟病的耐受性在OsWRKY21基因沉默植株中也被抑制（图8和9）。

上述结果表明OsWRKY21基因在水稻抗稻瘟病的防御反应中起正调控作用，可以利用该基因改良水稻及其它作物的抗病性状，培育出抗病转基
因植物新品种。

[0044] 实施例1 OsWRKY21基因的分离克隆
[0045] 以水稻品种日本晴（罗林广等.水稻雄性不育系珍汕97A抽穗期的基因型分析.遗传学报,2001,28(11)）为材料，对正常土培的三周龄野生型水稻苗喷施以广东省致病性较强、致病频率较高的稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）菌株00-193a（欧阳冬梅等，Basmatic370突变体BTX抗稻瘟病遗传分析及基因标记定位.分子植物育种,2009,7(1)）的孢子悬浮液（105个/mL），24小时后用Trizol试剂（购自Invitrogen）提取成功接种的水稻叶片总RNA（提取方法参见Trizol说明书），运用逆转录酶M-MLV（购自Invitrogen）将总RNA逆转录合成cDNA第一链（方法参见逆转录酶说明书），反应条件为：25℃ 5min；37℃60min；70℃ 10min。

以cDNA为模板，利用OsWRKY21基因特异性引物F1（5’-AGTTGGCGCGCC AGAGTGAGGAGCATGG-3’，下划线序列为AscI酶切位点）和R1（5’-CAGGATCCATCGAAAATTCAGAG GG-3’，下划线序列为BamHI酶切位点）进行PCR，扩增出含有OsWRKY21基因全长编码框的DNA片段，反应条件为：94℃预变性2min；96℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 2min，30个循环；72℃延伸2min。

将获得的PCR产物连入pGEM-T载体（购自Promega），转化大肠杆菌DH5α感受态细胞（购自TaKaRa），筛选测序为正确的阳性克隆并命名为pGEM-OsWRKY21，扩增得到的序列如下：
[0046] GGCGCGCCAGAGTGAGGAGCATGGCGATGCTGGGGAGCTCGTCGGCGGT
[0047] GGTGCTGGAGCTGATGACGATGGGGTACCAGTCGGCGGCGTACCTCGGCG
[0048] AGCTGCTCCGGGCGGCGTCCCCGGCGCAGGCAGGGGATGAGCAGCAGGA
[0049] GCTCGCCGCGGAGATCCTCCGCTGCTGCGACCGCGTCATCGCCGAGCTGA
[0050] ACCGGGGAGGAGCCACTGGTGCTACTACCGGCAAGAAGCGGAAGGCGGC
[0051] GGAGTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTGACCTCCCCTTCTCTCCCCGTCACGCC
[0052] GACCAAAAGAAGGGCGCGTGGCGCGGAGGCGGTGAGGGAGGTGAGGAG
[0053] CGGCACGACGACGGACGGGTTCATCTGGAGGAAGTACGGGCAGAAGGAG
[0054] ATCAATGGCTGCAAGCACCCGAGGCTCTACTACCGCTGCGCGTTCAGGGG
[0055] CCAGGGCTGCCTCGCCACGCGGCGGGTGCAGCAGTCGCAGTCGCAGGAC
[0056] GACCCGGCCGCGGCGTTCGTGATCGCCTACTACGGCGAGCACACCTGCGG
[0057] AGGCGACGCCGCCGCCGCCGCCGCGTGCCGGGACGGGGAACTAATGCCA
[0058] CCTGCCGTCATCAACTCCGGCGCGTCGAGCTTCGCCGCCGCTTGGAACATG
[0059] GCCTCGCGTGAGCCGGCGTCGTCGCTCGCCGTCGAGCGGAGGAGCTGCGA
[0060] CGGCGACGCTCCCAGCGAGACGTCGCAGGGGTGGTCTCCCTCCTTCTCGT
[0061] CGGAGGTGGAGCTGGACGTGGTGGGATTCGACCTCGCCGGAGCCGACTCG
[0062] TCGGCGTCGCCGGTGTGGGAGTTCTTGAATGGCAGCTTCGACTGGGAATT
[0063] CGTCATCAACTCCCTCTGAATTTTCGATGGATCC。

[0064] 实施例2 OsWRKY21基因的表达谱分析
[0065] 以水稻品种日本晴为材料，对正常土培的三周龄野生型水稻苗喷施以105/ml稻瘟病菌00-193a孢子悬浮液、2mM水杨酸（SA）、0.5mM苯并噻二唑（BTH）和100μM茉莉酸（JA），所有溶液都加入0.05%（v/v）的Tween20以增加叶片表面黏附性；模拟对照组（mock）分别喷施各种溶液中的溶剂成分。

稻瘟病菌诱导实验取样时间为0h，6h，12h，24h，48h，
72h。

SA和JA处理实验取样时间为0h，0.5h，1h，3h，6h，9h，12h，24h。

BTH处理实验取样时间为0h，0.5h，1h，3h，6h，9h，12h，24h，36h，48h。

用Trizol试剂（购自Invitrogen）提取各样品总RNA（提取方法参见Trizol说明书），运用DNaseI（RNase free，购自Promega）消化基因组DNA污染（方法参见DNaseI说明书），运用逆转录酶M-MLV（购自Invitrogen）将总RNA逆转录合成cDNA第一链（方法参见逆转录酶说明书），反应条件为：25℃ 5min；37℃60min；70℃10min。

以cDNA为模板，以UBC基因（登录号：AK059694）为内参基因（UBC基因扩增引物为：F3：5’-CCGTTTGTAGAGCCATAATTGCA-3’和R3：5’-AGGTTGCCTGAGTCACAGT TAAGTG-3’），利用OsWRKY21基因特异性引物F4（5’-CCGGTGTGGGAGTTCTTGAA-3’）和R4（5’-TCGATAGTTCCCGCGAAATT-3’）进行实时定量PCR，反应条件为：95℃预变性2min；95℃15sec，60℃ 35sec，40个循环。

在各种处理条件下对OsWRKY21基因表达量的检测结果表明（如图1～4所示），OsWRKY21基因能被稻瘟病菌侵染以及SA、BTH和JA处理不同程度地诱导而剧烈上调，是一个与植物抗病防御反应相关的转录因子基因。

[0066] 实施例3 OsWRKY21基因过量表达转基因水稻的产生和抗病鉴定
[0067] 以AscI、BamHI双酶切pGEM-OsWRKY21质粒并获得OsWRKY21的全长编码框序列，将获得的OsWRKY21基因全长编码框序列插入如图5所示的pFGC 1008载体（Kerschen et al.Effectiveness of RNA interference in transgenic plants.FEBS letters.2004,566(1)）的AscI和BamHI酶切位点之间，具体重组步骤参见TaKaRa公司限制性内切酶和T4连接酶说明书，将重组质粒转化大肠杆菌菌种DH5α，酶切鉴定为阳性的克隆即含有OsWRKY21基因过量表达载体。

[0068] 以日本晴胚性愈伤组织为转化受体，采用农杆菌介导法将OsWRKY21基因过量表达载体导入到受体材料中，经过与农杆菌LBA4404（Hiei etal.Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.The Plant Journal.1994,6(2)）共培养（Hiei et
代al.,1994）后，再进行潮霉素抗性愈伤组织的筛选、预再生、再生、生根等步骤产生T
转基因植株（许新萍等.用基因枪法转化水稻获得转基因植株.中山大学学报（自然科学版）.1997,36(6)）。

[0069] T0代转基因植株自交产生后代，选取两个独立的OsWRKY21过量表达转基因纯
代OsWRKY21过量表达转基因材料浸种催芽后穴播在合株系进行抗稻瘟病鉴定。

将T
3
30×20×5cm搪瓷盘里，每盘播24穴，每穴10粒种子，同时播种野生型材料、抗病对照品种（三黄占2号）（朱小源等.三黄占2号及其衍生品种抗稻瘟病特征研究.广东农业科学.2003,39(2)）和感病对照品种（CO39）（何月秋等.利用PCR标记对水稻稻瘟病菌适合度的测定.植物病理学报,1999,29(3)），每种材料均设2组重复。

秧苗长至1叶1心时施氮肥硫酸铵0.5g/盘，接种前共施3次。

用三周龄苗人工喷雾接种广东省致病性较强、致病频率较高的稻瘟病菌株00-193a，接种孢子浓度为105/ml，接种菌液量为20ml/盘，25℃暗房保湿24h，再移至25～28℃荫棚下迷雾保湿。

7d后进行病级调查，统计第4片叶中部10cm的感性病斑的数目，每种材料的统计样本数不少于20。

实验重复3次。

结果表明（如图6和7所示），OsWRKY21过量表达转基因水稻叶片上的感性病斑数目明显少于野生型对照植株（t检验P值均小于0.01），OsWRKY21过量表达能够极大地增强水稻对于稻瘟病的抗性。

[0070] 实施例4 OsWRKY21基因沉默表达转基因水稻的产生和抗病鉴定
[0071] 通过序列比对（/Blast.cgi）发现OsWRKY21基因非编码区的一段序列（如下所示）特异性较高，因此以这一序列为基础构建OsWRKY21基因沉默载体较为合适。

[0072] ATTTTCGATGCTTCGTGATCAGTAGCACACCAGCTGCCCCAAGAGTGC
[0073] AGTAGTCTTTGCAAAACGCACAAAATTTCGCGGGAACTATCGAATTTCCCG
[0074] CGTTTGCGCTTAAGTTAATAGCCTCAGTAGTTCGTCAGATAATCGCACGCA
[0075] CTATTTTAATTCAGGAAGGGATTTAGATTGACAAAGTATATTAGGTGAGAGT
[0076] TAATATGGGAGAATTCGTAATGAAGAGTTGAATGTGTTGACGTTGACGTAC
[0077] AGGGGAAAAACACATGCTAAGAAGAAAAATGGCAGGTGAAAGGGGCAAG
[0078] AAATGGCAAAGCTGAGCAACAGAGCAGGTAATAATAGAGAATTGCTACTC
[0079] CTACTACTTGCAAGCATATATGTCCAGAAGAGCAGCCAAAGAGAACACAA
[0080] GACCGTCAGCTTGACGCATAACTGACGCACTTCTGATGGTAACAAAAAAC
[0081] CGGCCACCATGTCCCATGTGAACGAATGGATTCATTAGTTGTAATAATGGTA
[0082] ATAGTAGTGACACTCAATTGCAATATCATGCTTGGTACAGGGTTAAGGATCA
[0083] GATGG；
[0084] OsWRKY21基因沉默载体的构建过程与上述过量表达载体构建过程类似：以同样的方法获得稻瘟病菌诱导的叶片cDNA文库，作为模板，以OsWRKY21基因特异性引物F2（5’-AACTAGTGGCGCGCCATTTTCGATGCTTCGTGATC-3’，下划线序列分别为SpeI、AscI酶切位点）和R2（5’-TTGGATCCATTTAAATCCATCTGATCCTTAACCCT-3’，下划线序列分别为Bam HI、SwaI 酶切位点）扩增出含有OsWRKY21基因特异性片段的DNA，PCR条件同上，扩增产物即为上述序列。

将获得的含有OsWRKY21基因特异性片段的DNA分别经过AscI和SwaI酶切并插入pFGC1008载体的相应酶切位点之间获得中间载体，再将含有OsWRKY21基因特异性片段的DNA分别经过Bam HI和SpeI酶切并插入中间载体的相应酶切位点之间，具体重组步骤参见TaKaRa公司限制性内切酶和T4连接酶说明书，将重组质粒转化大肠杆菌菌种DH5α，最终测序为正确的阳性克隆即含有OsWRKY21基因沉默载体。

[0085] 同样，通过农杆菌介导的转化法将OsWRKY21基因沉默载体导入日本晴受体材料，获得转基因植株（具体方法同上）。

[0086] 选取两个独立的OsWRKY21基因沉默转基因纯合株系进行抗稻瘟病鉴定，稻瘟病菌接种方法与实施例3类似，不同之处是在接种前2天用0.5mM BTH对OsWRKY21基因沉默植株和野生型植株进行喷施预处理，同时设一组未处理的野生型植株作为对照。

结果表明（如图8和9所示），与未处理的野生型植株相比，0.5mM BTH预处理的野生型植株对稻瘟病的侵染表现出很大的抗性，而0.5mM BTH预处理的OsWRKY21 RNAi转基因植株对稻瘟病菌的侵染仍然敏感。

因此，BTH诱导的水稻对稻瘟病的耐受性被OsWRKY21基因沉默所抑制，证实了OsWRKY21基因沉默使水稻对稻瘟病菌的侵染更加敏感。

[0087] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

[0001]
[0002]
[0003]
3/3页序 列 表CN 103451225 A
图1
图2
图3
图4
图5
图6
图7
图8
图9。