天目山柳杉瘿瘤病感染情况研究与致病菌鉴定

天目山地处浙江省临安市境内，面积4284公顷，主峰仙人顶海拔1506米，经度范围：119°24′11″E——119°28 ′21″E，纬度范围：30°18′30″N——30°24′55″N，海拔范围300m——1556m，具有典型的中亚热带的森林生态系统和森林景观。

天目山处于中亚热带北缘至北亚热带的过渡带中，受海洋暖湿气候的影响较大。

气候温暖湿润，年降水量为1390—1870 mm，年平均气温为15.8～8.9摄氏度(从山麓到山顶)。

天然植被分布，1100m 以下为常绿落叶林，1100～1400 m为落叶常绿阔叶林和针叶混交林。

1400 m以上为灌木林。

世界罕见的大柳杉群落集中分布在海拔1100 m以下区域(2)。

1.2瘿瘤病感染情况调查
由于考察时间有限及条件限制，我们采用线路踏查法，选取大树王（海拔1050m），三里亭（海拔640m）和禅源寺（海拔300m）这三个柳杉分布及发病具有集中代表性的区域，将这三个区域设置为标准地，对这个区域内的柳杉进行观察统计记录，研究瘿瘤病害的发生与树龄、海拔、土壤酸碱度等因子的关系，并计算发病率和感病指数。

在调查时，柳杉瘿瘤病分为5个等级：健康无症状为0级，瘤少见带瘤枝条占整株枝条的1／4以下为I级，占整株枝条的1／2以下为Ⅱ级，占整株枝条的1／2以上为Ⅲ级，大部分枝条带瘤至枯死或全株枯死为Ⅳ级。

各级代表值依次为0.0，1.0，2.0，3.0，4.0(3)
感病指数=（∑（病级株数×代表数值））／株数总和；发病率=(∑发病株数／株数总和)*100%。

1.3土壤样品采集与分析
分别对大树王，三里亭和禅源寺附近的土壤进行采样，去除土壤表面的腐殖质层后带回实验室后进行pH值的测定。

测定时先制备土壤与水1:2.5悬浮液:将20克烘干的土壤样品置于200毫升烧杯中, 加入50mL蒸馏水, 搅动悬浮液后静置然后再搅动悬浮液,每次间隔约1小时, 3小时后停止搅拌并立即浸入pH试纸测定pH值。

得到土壤的pH近似值。

1.4 瘿瘤病病原菌的培养与鉴定
采集具有典型瘿瘤症状的柳杉枝条，直接切取瘿瘤表层的子实体组织小块(约0.5cm*0.5cm*0.5cm大小)，用3%的次氯酸钠水消毒7～8 min，再用无菌水漂洗4—5次。

用马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)配制成培养基(4)。

一部分培养基中加入消毒过后再经研磨得到的柳杉汁，另一部分中不加柳杉汁作对照培养。

分别将组织块放入加有柳杉汁和不加柳杉汁的培养基平板中，常温下培养数天后观察。

2 实验结果
2.1瘿瘤病感染情况
从形态学上观察柳杉瘿瘤（图1.）
图1. 柳杉瘿瘤实体照片
在大树王附近调查了30株柳杉，瘿瘤病的发病率为90.00%，感病指数为2.37。

在三里
37 1
38 2
39 2
40 1
发病率感病指数发病率感病指
数发病率感病指
数
90.00% 2.37 86.67% 1.67 70% 0.975
合计发病率感病指
数
100 81% 1.6
2.2土壤的pH值测定结果
通过土壤浸出液测定从三个区域采集到的土壤的pH值，天目山地区的土壤呈酸性，pH 都在4-5左右。

在禅源寺附近的土壤pH值约为4.9.三里亭附近的土壤pH值约为4.6.而大树王附近的土壤pH值约为4.2.并且随着海拔的上升，土壤的pH值逐渐降低。

2.3瘿瘤病原菌的培养与鉴定
我们从7月17日开始培养，4天后观察。

在培养基上得到的菌落干燥，大而致密，整体呈灰白色，边缘整齐，中间稍有隆起。

气生菌丝生长旺盛，呈绒毛状。

菌落背面呈放射状，部分为黄绿色，其余灰白色（图2.）。

培养11天后再次观察，菌落呈褐色，中部颜色较深，边缘较浅，并出现绿色的菌落。

这些外形特征符合陈善铭等人在中国农作物病虫害中关于苹果Maluspumila牛眼烂果病中拟隐孢壳属Cryptosporiopsis真菌的形态学特征。

因此从形态学角度上可以将此病原菌鉴定为拟隐孢壳属Cryptosporiopsis真菌。

（图3.）
图2. 直接放入瘤状物培养四天菌落图图3. 分选真菌转接新培养基2天后菌落图
3.分析与讨论
3.1柳杉瘿瘤病与海拔高度的关系
由2.1的实验结论可以看到，天目山地区柳杉瘿瘤病的发病率已经达到了一个相当高的水平，并且发病率随着柳杉所处地理位置海拔高度的上升而上升，感病指数也随着海拔的上升而上升。

可见柳杉瘿瘤病的发病情况与海拔高度之间存在正相关(图4.)。

图4 海报高度与柳杉瘿瘤病发病率与染病之树的相关性分析
3.2土壤pH值与海拔高度的关系
由2.2的实验结果可以看到，天目山地区土壤普遍呈较强的酸性，并且土壤的pH值由着海拔高度的上升而降低。

（图5.）
图5 海拔高度与柳杉所在地土壤pH的相关性分析
进而分析得出土壤pH与柳杉瘿瘤病发病率呈负相关（图6.）。

图 6 柳杉瘿瘤病发病率与土壤pH的相关性分析
3.3可能影响柳杉瘿瘤病发病的因素
瘿瘤病的发病与海拔高度之间存在正相关性。

但海拔高度只是一个综合性的外部因素，事实上真正影响瘿瘤病发病的内在因素应该有以下几点:
3.31 pH值
天目山土壤的pH值随海拔升高而降低，在海拔1050m处最低，这是因为海拔1050m 的大树王区域刚好位于天目山的云雾带，降水丰富，进而导致酸性物质的沉降严重。

土壤pH值的海拔分布格局与天目山柳杉瘿瘤病的感染情况的格局相符，高海拔的大树王区域柳杉的发病率最高；而在较低海拔处，柳杉的发病率相对较低。

我们查阅了2006年与1995年土壤pH值的变化情况，进一步证实了酸沉降与近年来天目山柳杉种群的衰退、死亡有较强的相关性。

1995年天目山地区不同海拔土壤pH值为5.0-5.6，低海拔350m处最低，但是随着海拔的上升pH值的变化不大(5)；而在2006年后的研究发现天目山土壤各层pH值已经普遍低于5.0，尤其是中高海拔处，pH值降低最严重。

通过成对样本的t检验，表明2006年天目山地区土壤的pH值显著低于1995年和1986年的pH值(6)，显示出天目山地区的土壤在10年间呈现明显的酸化。

随着近20多年来的改革开放与经济发展，我国南方地区就开始出现普遍的酸沉降，而南方地区亚热带山地土壤的酸化现象更是愈发严重(7)，对衡山的一项土壤pH值研究也表明衡山2001年土壤的pH值明显低于1983年的数值，而其原因正是由于酸沉降的加速(8)。

天目山土壤pH值随海拔的上升而降低。

柳杉瘿瘤病的发病情况与土壤的pH值之间也存在对应关系。

在柳杉瘿瘤病的发病原因中既有侵染性病原的因素又有非侵染性的因素。

非侵染性因素会成为侵染性病害的诱因，而侵染性病原所导致的瘿瘤病又可以降低柳杉对非侵染性因素的抵抗能力。

天目山的土壤酸化与酸雨问题正是导致柳杉瘿瘤病的非侵染因素之一(9)。

有资料显示，在1997年以前，天目山地区的柳杉瘿瘤病就开始发生，然而瘿瘤病起初对柳杉的危害并不严重，但随着各种外界因素的影响如酸雨、柳杉生境被破坏等，柳杉瘿瘤病开始威胁到古柳杉的生长。

有研究表明，酸雨会侵害柳杉的表皮，使得柳杉抵御外来侵害的能力下降。

对酸雨的研究表明，酸雨普遍能够对植物的角质层产生伤害，造成伤口，使得各种病原更容易侵入(10)(11)。

此外，酸雨会导致土壤酸度增加，土壤中的营养成分难以被树木吸收，引起柳杉生长势的衰退。

在培养引发瘿瘤病的病原菌的实验中发现，对10株经过
图7
3.5结论
随着天目山地区海拔高度的升高，气温、空气湿度、气压（我们没有对这些影响因素进行调查）、降水(酸雨)以及土壤特征等都会随之发生改变。

环境因素复杂且呈现时空异质性，因此，目前还不能够完全地确定柳杉瘿瘤病的发生、蔓延的机制。

但是天目山的柳杉种群依然在无时不刻地遭受着瘿瘤病的侵袭，古柳杉种群的存亡正岌岌可危。

对于目前已经了解的导致柳杉瘿瘤病的影响因素，我们应当立即采取相应的措施，例如减少硫氧化物氮氧化物的排放，解决酸雨问题，改善天目山地区土壤酸化的现状，而鉴定出柳杉瘿瘤病的病原菌种类也能方便我们寻找更好的方法，对症下药，以控制瘿瘤病在柳杉种群中的蔓延扩散，保护好天目山这世上罕见的大型柳杉群落。

致谢：感谢曹钰、张文驹老师在实习考察期间对于我们小课题展开过程中提供的悉心指导。

感谢王英明老师为我们提供了部分实验工具。

感谢李黎明同学对我们的小论文提出了一些建设性意见。

参考文献
1.张昕,张立钦,王记祥等. 天目山柳杉瘿瘤病病原菌观察.浙江林业科技.2008,28(2):1001-3776.
2.尤建林,韦新良,李东等.天目山国家级自然保护区森林游憩价值评估[J].浙江林学院学报,2009,26(4):575—580．
3.崎润二,桑原康成.日林九支研输文集,2001,54:95—98.
4.龚小峰,朱云峰,刘亮,杨淑贞,葛晓峰,甘其兴,叶建仁,蒋平柳杉瘿瘤病病原菌鉴定.浙江农林大学学报2011,28(2):339—342.
5.徐秋芳, 郑小平, 余文忠. 西天目山森林土壤酶活性的分析[J].浙江林学院学报, 1997, 14: 142-14
6.
6.叶仲节, 何黎明, 蒋秋怡, 姜培坤. 西天目山自然保护区森林土壤发生学特性的研究[J]. 浙江林学院
学报, 1990, 7: 215-220.。