帕比司他在制备治疗急性淋巴细胞白血病的药物中的应用[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011210729.3
(22)申请日 2020.11.03
(71)申请人 上海交通大学医学院附属瑞金医院
地址 200025 上海市黄浦区瑞金二路197号
(72)发明人 蒙国宇　
(74)专利代理机构 广州科粤专利商标代理有限
公司 44001
代理人 朱双　莫瑶江
(51)Int.Cl.
A61K 31/4045(2006.01)
A61P 35/02(2006.01)
(54)发明名称
帕比司他在制备治疗急性淋巴细胞白血病
的药物中的应用
(57)摘要
本发明公开了帕比司他在制备治疗急性淋
巴细胞白血病的药物中的应用。

本发明发现帕比
司他(panobinostat)能够在细胞水平上、动物水
平上有效地治疗MEF2D ‑fusion型急性淋巴细胞
白血病，这对患有该类型急性淋巴细胞白血病的
患者带来了新的治疗曙光。

权利要求书1页 说明书4页 附图3页CN 112294804 A 2021.02.02
C N 112294804
A
1.帕比司他在制备治疗急性淋巴细胞白血病的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的治疗急性淋巴细胞白血病的药物是治疗MEF2D -fusion型急性淋巴细胞白血病的药物。

3.一种治疗急性淋巴细胞白血病的药物，其特征在于，含有有效量的作为活性成分的帕比司他和药学上可接受的载体。

4.根据权利要求1所述的药物，其特征在于，所述的治疗急性淋巴细胞白血病的药物是治疗MEF2D -fusion型急性淋巴细胞白血病的药物。

权　利　要　求　书1/1页CN 112294804 A
帕比司他在制备治疗急性淋巴细胞白血病的药物中的应用
技术领域
[0001]本发明属于生物医药技术领域，具体涉及帕比司他在制备治疗急性淋巴细胞白血病的药物中的应用。

背景技术
[0002]急性淋巴细胞白血病(Acute Lymphoblastic Leukemia,ALL)是由造血和淋巴组织，特别是骨髓，脾和淋巴结中淋巴母细胞的无限增殖引起的进行性血液恶性肿瘤。

它是儿童中最常见的白血病类型1。

尽管现有的治疗使80％以上的儿童得以治愈，但ALL的复发仍然是导致儿童死亡的主要原因。

成人ALL患者的发病率低于儿童，占急性白血病成人的15％～25％。

然而，成人ALL患者生物学特征多样，临床异质性大，治疗效果差。

随着年龄的增长，与结局良好相关的基因变异下降与结局不良相关的变异如BCR-ABL1越来越普遍。

[0003]随着遗传学及分子生物学的发展，2008世界卫生组织将ALL归入前体淋巴细胞肿瘤并且进行了新的以分子生物学及遗传学为基础的分类。

60％以上的急性淋巴细胞白血病存在遗传学异常，更多的患者具有能够检测的分子生物学及分子遗传学异常。

这些异常对患者疾病的发病，治疗及预后均具有一定意义。

近年来，随着高通量分子检测技术的应用，基因组学研究已在儿童ALL中广泛开展，在成年人ALL中也日益受到重视，主要包括全基因/外显子/转录组测序分析、基于基因芯片技术的基因组多态性分析以及表观遗传学研究等。

[0004]随着高通量分子测序技术的应用，基因组学研究已在ALL中广泛开展。

近两年，上海血研所课题组2及国外其他工作组3-5通过RNA-seq的方法，在B-ALL中发现了新的重现性融合基因MEF2D融合基因(图1)。

几组研究人员已经证明MEF2D融合是预后不良的独立指标，其生存率与费城染色体(Ph)阳性患者相似。

到目前为止，已经报道了MEF2D的八个融合伙伴，包括BCL9,HNRNPUL1,DAZAP1,CSF1R,FOXJ2,STAT6,SS186和HNRNPH17。

在上海血研所分析的患者中，MEF2D融合基因发生频率为成人6.8％，儿童3.5％。

通过对RNA-seq数据的分析，这类患者有独特的表达谱特征，使其明显区别于其他遗传亚类。

然而这类融合基因在B-ALL 的发生中所起的致病作用及机制仍然不明确。

[0005]MEF2D是肌细胞特异增强子2(MEF2)转录因子家族的成员。

此家族基因参与调控肌肉和神经细胞的分化和发育，可以被二类组蛋白去乙酰化转移酶调控8。

MEF2家族的另一位成员MEF2C在正常B细胞发育中是必不可少的9。

文献报道，MEF2C和MEF2D同时敲除的模式小鼠，B细胞分化阻滞在大pro-B向小pre-B的转换中10。

这些研究都提示MEF2D融合能影响B细胞分化。

上海血研所已发表的结果中，通过体外诱导淋系祖细胞向B细胞分化和逆转录介导的骨髓移植小鼠模型，发现MEF2D-BCL9和MEF2D-HNRNPUL1明显影响B细胞的发育。

同时MEF2D融合基因能上调已知被MEF2家族基因调节的组蛋白去乙酰化转移酶HDAC910,11，下调免疫球蛋白VDJ重组酶基因RAG-1。

日本东京大学工作组的研究表明3，MEF2D融合在费城染色体阴性ALL中占7％，预后较差，无病生存率与Ph-like组患者类似(图1)。

并通过实验证明MEF2D融合基因具有转化NIH3T3细胞的能力，细胞形态发生明显变化。

在小鼠骨髓移植模型中，含有MEF2D-BCL9的pro-B在体内并没有增殖优势，但是阻滞了B细胞的分化，使其阻滞在
pro-B阶段。

美国St.Jude儿童医院工作组研究表明4，MEF2D重排导致MEF2D转录活性增强，淋巴细胞转化，HDAC9表达激活以及对组蛋白脱乙酰酶抑制剂处理更加敏感。

然而针对这样一类新发现的高危组B-ALL融合基因(图2)，其致病机制尚不明确，且尚无有效的治疗药物，亟待进一步深入研究。

[0006]目前针对一些分型的ALL存在相对应的治疗方案。

例如对于治疗加重、持续和复发或用两种全身性药物治疗后无效的皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL，一种非霍奇金淋巴瘤)，伏立诺他(Vorinostat)是可用的一种靶向药物，它是一组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂，能通过诱导细胞分化、阻断细胞周期、诱导细胞调控而发挥作用。

而VP(长春新碱和强的松)方案作为急性淋巴细胞白血病(ALL)诱导治疗的基本方案，对儿童ALL诱导治疗的完全缓解(CR)率达90％以上，但对成人ALL的CR率不足50％。

VP(长春新碱和强的松)方案联合蒽环类药物及门冬酰胺酶是目前成人急性淋巴细胞自血病(ALL)诱导缓解的常用方案。

近年来，随着化疗方案的不断改进、新药的研发以及支持治疗的加强已经使成人ALL的完全缓解率不断提高(78％-93％)，但远期疗效并不满意，长期生存率仅为30％～40％。

虽然造血干细胞移植可使部分成人ALL患者受益，但受患者自身状况、供者来源及经济条件限制，无法普及。

联合化疗仍是成人ALL治疗的基本手段。

目前常用的就是VDCLP的联合化疗方案：①长春新碱(VCR)或长春地辛②蒽环/蒽醌类药物(如柔红霉素(DNR)、去甲氧柔红霉素(IDA)、阿霉素、米托蒽醌等)③糖皮质激素(如泼尼松、地塞米松等)④环磷酰胺(CTX)⑤左旋门冬酰胺酶(L-Asp)或培门冬酶。

但是，目前这些治疗方案都不能对MEF2D-fusion型的ALL达到很好的缓解效率，并且预后极差。

[0007]帕比司他(panobinostat)是首个治疗多发性骨髓瘤的组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂，由瑞士制药巨头诺华公司(Novartis)研发，2015年2月通过FDA加速审批程序获得美国FDA批准上市，商品名为Farydak。

Farydak联合硼替佐米(bortezomib)和地塞米松(dexamethasone)用于既往接受过至少2种治疗方案失败的多发性骨髓瘤患者。

Farydak是一种新型、广谱的HDAC抑制剂，以一种全新的作用机制通过阻断HDAC发挥作用，该药能够对癌细胞施以严重的应激效果直至其死亡，而健康细胞不受影响。

[0008]参考文献
[0009]1 Pui,C.-H.,Robison,L.L.&Look,A.T.Acute lymphoblastic leukaemia.The Lancet 371,1030-1043,doi:10.1016/s0140-6736(08)60457-2(2008).
[0010]2 Liu,Y.F.et al.Genomic Profiling of Adult and Pediatric B-cell Acute Lymphoblastic Leukemia.EBioMedicine 8,173-183,doi:10.1016/j.ebiom.2016.04.038 (2016).
[0011]3 Yasuda,T.et al.Recurrent DUX4 fusions in B cell acute lymphoblastic leukemia of adolescents and young adults.Nat Genet 48,569-574,doi:10.1038/ ng.3535(2016).
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[0018]10 Herglotz,J.et al.Essential control of early B-cell development by Mef2 transcription factors.Blood 127,572-581,doi:10.1182/blood-2015-04-643270 (2015).
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发明内容
[0020]本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供帕比司他在制备治疗急性淋巴细胞白血病药物中的应用。

[0021]现有针对ALL的治疗方案都不能对MEF2D-fusion型的ALL达到很好的缓解效率，并且预后极差、复发率高。

而发明人发现帕比司他(panobinostat)能够有效地治疗MEF2D-fusion型的ALL，使得受阻的B细胞分化恢复正常，并能够有效地使得经过治疗的发病小鼠的脾脏恢复正常，表明帕比司他在这两个水平上能够治愈MEF2D-fusion型ALL。

帕比司他(panobinostat)在之前则应用于多发性骨髓瘤的治疗，在MEF2D-fusion型ALL上的治疗应用并未报道过。

[0022]因此，本发明的第一个目的是提供帕比司他在制备治疗急性淋巴细胞白血病的药物中的应用。

[0023]优选，所述的治疗急性淋巴细胞白血病的药物是治疗MEF2D-fusion型急性淋巴细胞白血病的药物。

[0024]本发明的第二个目的是提供一种治疗急性淋巴细胞白血病的药物，其含有有效量的作为活性成分的帕比司他和药学上可接受的载体。

[0025]优选，所述的治疗急性淋巴细胞白血病的药物是治疗MEF2D-fusion型急性淋巴细
胞白血病的药物。

[0026]本发明发现和证明了帕比司他(panobinostat)能够在细胞水平上、动物水平上有效地治疗MEF2D-fusion型ALL，这对患有该类型ALL的患者带来了新的治疗曙光。

附图说明
[0027]图1是MEF2D融合在B-ALL的发生中起着非常重要的作用；(A)日本东京大学工作组的研究表明MEF2D融合在费城染色体阴性ALL中占7％；(B)MEF2D融合基因预后较差，无病生存率与Ph-like组患者类似(Takahiko et al,2016)；(C)上海血液学研究所通过RNA-seq数据分析发现MEF2D与白血病的发生密切相关(Liu et al,2016)。

[0028]图2是MEF2D以及融合基因的结构域模式图；融合基因均保留了野生型MEF2D的N端DNA结合结构域，提示其在融合基因引起白血病发生发展的过程中起着至关重要的作用。

[0029]图3是帕比司他治疗MEF2D-fusion型ALL的效果；(A)WT和MH-Vav小鼠的脾细胞在12个月(n＝3)对Panobinostat(帕比司他)的体外反应；(B)4个周期后野生型小鼠和MH-vav 小鼠(作为对照组)脾脏大小比较；(C)野生型小鼠(对照组)(n＝2)和Panobinostat(n＝2)与MH-vav小鼠(对照组)(n＝3)和Panobinostat(n＝2)脾脏重量的比较；(D)用溶剂(对照)或panobinostat处理野生型和MH-Vav小鼠的体重监测。

具体实施方式
[0030]以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

[0031]实施例1
[0032] 1.发病小鼠模型建立
[0033]小鼠的产生和繁殖MEF2D-HNRNPUL1(MH)条件敲除小鼠来自南京大学南京生物医学研究所，是采用CRISPR/Cas9技术将人源HNRNPUL1基因(GeneID:11100)外显子12-15、小鼠Mef2d基因外显子9插入小鼠Mef2d基因外显子8中，用以模拟人类带有融合基因的发病型；利用针对敲入等位基因的引物进行PCR验证人类HNRNPUL1片段的插入。

将vav-cre小鼠与MH敲入小鼠杂交，产生MH-vav株。

在MH-vav小鼠中，使用MH特异性引物和MEF2D抗体(ab 93257)，通过PCR和western blot检测MH的表达。

本研究小鼠以C57BL/6为背景，在上海交通大学医学院附属瑞金医院实验医学研究中心无病原体环境下饲养。

所有动物实验均遵循《动物护理机构伦理指南》，并获得上海交通大学医学院动物护理与使用委员会的批准。

[0034] 2.帕比司他(panobinostat)治疗MEF2D-fusion型ALL
[0035]从12个月大的MH-Vav小鼠脾脏中获得的细胞加入各种HDAC抑制剂，包括帕比司他(panobinostat)、伏立诺他(Vorinostat)和西达本胺(Chidamide)。

体外的细胞实验结果为阳性，但是提示MH白血病细胞对Panobinostat更敏感(IC50 4.5nM)。

为了进一步验证这一点，我们在体内监测了Panobinostat的疗效。

对早期造血功能障碍(5个月)的MH-Vav小鼠给予2.5mg/kg Panobinostat或溶剂(作为对照)处理。

Panobinostat经腹腔给药，周期4次，每周期5天注射/2天休息。

结果如图3所示，与对照组相比，经过Panobinostat治疗的MH小鼠，其白血病发病的典型症状如脾肿大、B细胞分化受阻等显著降低。

图1
图2
图3。