原生质体融合技术在食用菌育种上的应用研究进展

文章编号:1001-4829(2001)增刊-0120-04
收稿日期:2001-01-18 基金项目:四川省重点科研项目
作者简介:谭　伟(1964-),男,四川武胜人,副研究员,专业从事食用菌育种与栽培工作,已发表论文30余篇。

原生质体融合技术在食用菌育种上的应用研究进展
谭　伟,郑林用,彭卫红,肖在勤
(四川省农科院土壤肥料研究所,四川成都610066)
摘　要:本文报道食用菌原生质体融合技术在育种上的特点,国内研究动态、进展及发展趋势,
分析了原生质体融合菌株难以形成子实体的问题。

四川省农科院攻克了融合菌株难以形成子实体的世界性难题,选育出科间融合新品种“金凤2-1”在生产上应用,并产生显著社会经济效益,处于世界先进研究水平。

原生质体融合育种研究理论上将向融合子菌株形成子实体的遗传机制、基因调控机理纵深方向探讨;技术上将广泛应用现代分子生物学技术鉴别融合子;育种将向目间、纲间等远缘融合方向迈进。

关键词:原生质体;融合技术;育种;应用中图分类号:S33414 文献标识码:A
Advances in research on application of protoplast f usion technique
in mushroom breeding
TAN Wei ,ZHEN G Lin 2yong ,PEN G Wei 2hong ,XIAO Zai 2qin
(Soil and Fertilizer Institute ,Sichuan Academy of Agricultural Sciences ,Chengdu 610066,China )
Abstract :Protoplast fusion technique in mushroom breeding had obvious feature ,compared with mutation breeding ,cross breeding and natural breeding.It could get new variety through overcoming the obstacle of sex factor and make distance hybrid into reality.In the past 20years ,the protoplast fusion between varieties ,species and genus were completed ,but there was only one report about the family fu 2sion in mushroom in Japan ,and no fruiting 2body was developed from the fusant.Sichuan academy of agricultural sciences led in the world for solving the problem of no fruiting body development from the fusant ,and got the first family fusion variety Jinfeng 221.The genetic mechanism ,fruiting body development and gene regulation will be the first work in the protoplast fusion research field in the following years.Modern biotechnology will be widely used in fusant distinguish.K ey w ords :mushroom ;protoplast fusion ;mushroom breeding ;application
食用菌原生质体融合育种与常规的自然选育、诱变育种、杂交育种相比,具有显著特点:即它能有效地克服生物间性因子的障碍,实现远缘杂交,从而可获得有突出优良性状的新类型。

国内外菌物学者经20多年研究,实现了种内、种间、属间融合成功;仅一例是日本报道科间融合成功,但未见形成子实体的报道。

四川省农科院攻克了融合菌株难以形成子实体的世界性难题,选育出科间融合新
品种“金凤2-1”并在生产上应用,产生显著社会经济效益,处于世界先进研究水平。

原生质体融合育种研究理论上将向融合子菌株形成子实体的遗传机制、基因调控机理纵深方向探讨;技术上将广泛应用现代分子生物学技术鉴别融合子;育种将向目间、纲间等远缘融合方向迈进。

原生质体技术是近年来迅速发展起来的细胞工程技术的内容,在食用菌上的应用最早从70年代Devriers (1972)等人对裂褶菌原生质的分离研究成功开始,随着人们对原生质体研究的不断深入,到80年代中后期原生质体融合技术应用到了食用菌的菌株改良或者品种选育上。

近年来,国内外学者经过艰苦努力,取得了可喜进展:先后获得了食
021西　南　农　业　学　报
Southwest China Journal of Agricultural Sciences
2001年14卷增刊
Vol 114 Suppl.
用菌种内、种间、属间[1～6],甚至科间原生质体融合子;并且从科间原生质体融合菌株中选育出优良品种[7～8],并在生产上广泛应用,产生良好的社会经济效益。

应该说这是生物技术的重大突破。

1　原生质体融合技术在食用菌育种上的特点
在食用菌育种中常用的有三种技术:自然选育、诱变育种和杂交育种。

自然选育是利用自然变异,选取所需的有益变异,这虽然是古老的方法,但在食用菌野生资源未充分开发和利用时,自然选育有着重大潜力,因此,自然选育是目前应用广泛的一种有效方法。

“香9”、“香7”、“香5”就是广东微生物所利用自然选育法选育出的优良菌株。

诱变育种是人们采用物理、化学诱变剂来直接或间接地作用于菌株的DNA,使个别碱基发生突变,从而使遗传性状发生变化,选取有用变异,获得新菌株的过程。

无孢糙皮侧耳就是利用诱变选得的。

杂交育种是通过两个亲本染色体片断的交换和重组而获得新性状。

如“杂17”为平菇杂交菌株。

尽管利用这三种技术都可培育出新品种,但是存在着相当的局限性和缺点:自然选育的效果是相对的,有条件的,从本质上将不能改变个体的基因型,而只是积累并利用其自然条件下发生的有益变异;诱变育种在高等担子菌中的应用起步较晚,成功的例子不多,有待进一步完善和改进;杂交育种手段复杂,亲本间要有亲和性,进程缓慢。

实践证明,常规育种不易获得有突出性状的优良品种。

然而,新近发展起来的一种细胞工程技术———原生质体融合技术,是将两种不同遗传类型的原生质体,彼此经过细胞核、细胞质、细胞器的融合,进行遗传重组,再生为新类型。

它是利用酶法剥除细胞壁,在凝聚融合诱导剂和聚乙二醇(PEG)诱导下,裸露原生质融合,使两者基因相互接触、交换、重组,从而获得重组子。

由于除去了细胞壁,解除了相互间的物理上、生理上的主要障碍,这样可以提高融合率,而且使遗传差距较大的远缘杂交成为可能。

原生质体融合技术是近代生物工程的主要内容,也是近代生物技术的重大突破,其最显著的特点是不依赖生物本身的性功能,即能有效地克服性因子的障碍,用物理、化学方法使细胞融合,从而获得新种细胞,这尤其对于那些不能进行有性杂交的生物来说提供了一条新的育种途径,为实现远缘杂交,获得有突出优良性状的新类型开辟了新途径。

2　国内外食用菌原生质体融合育种研究动态及进展
由于细胞原生质体融合技术能有效地克服远缘杂交不亲和性因子障碍,使遗传差距较大的远缘种间、属间,甚至科间以上等杂交成为可能,因而该项技术较易突破常规有性或准性生殖而实现远缘杂交。

因此,这项技术已引起国内外菌物学工作者的高度重视,从1972年Devriers等人对裂褶菌原生质的发育研究成功开始,将原生质体融合技术运用到食用菌研究领域,到八十年代中后期达到高潮。

国内外有关文献资料表明,日本、荷兰、美国、菲律宾、韩国等国家,国内武汉、上海、北京、香港、福建、黑龙江等省的大专院校及科研单位的很多人在从事这方面的研究工作。

日本的柳圆江(1985,1986)认为食用菌细胞融合成功仅限于担子菌种内、至于异种间、异属间能否成功还要看今后的努力;Tankao K inguchi (1985)制备出了香菇原生质体;大政正武(1986, 1987)获得糙皮侧耳种内原生质体融合菌株,但认为种间很困难。

韩国的Park1S(1990)和Y oung Bok Y oo等(1987)对田头菇原生质体的分离和复原、侧耳种间原生质体融合及性别作了初步研究,未见融合株子实体形成的报道。

菲律宾的Santia2 go,C1M1J r(1989)对双孢蘑菇进行了种间原生质体融合,但未见获得融合菌株。

英国的Jom, F. Padendy等(1990)介绍了食用菌种内菌株间杂交取得融合菌株一些成功例子,但认为种间杂交仍很难。

美国的Janick,J等(1990)先后概述了食用菌细胞融合育种技术,只是展望前景,未见具体内容。

1987年,国内著名菌物学家杨新美认为原生质体融合技术在食用菌育种中的应用,在当时一般的研究深度尚在原生质体制备、再生阶段,正向亲本组合和融合子的获得、检出与分析阶段迈进。

肖在勤(1988,1989),潘迎捷(1989,1992),刘振岳和刘国振(1990,1994,1995,1996)、王泽生(1991)、林芳灿(1993)、曾荣(1995)等人先后对食用菌的原生质体制备、融合进行研究和介绍。

马爱民等(1998)对双孢蘑菇原生质体同核体及杂交异核体进行了RAPD分析[10];谭琦等(1999)用栽培香菇与野生香菇作为亲本,进行单核原生质体杂交育成香菇(种内)新菌株申香8号[11]。

何志勇等(2000)进行了香菇原生质体融合菌株培养条件的优化研究[12]。

研究进展最好的是刘振岳等
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增刊 谭　伟等:原生质体融合技术在食用菌育种上的应用研究进展
(河北大学,1994)获得了平菇与香菇(属间)融合子[6～7];曾荣等(1995)获得了虎皮香菇(L enti nus tigri nus)和金针菇(属间)融合子,其杂种子实体表型似虎皮香菇;但未见形成品种。

综上所述,日本研究成果最多,然而大多局限于种内、种间融合成功,有两例获得属间融合成功。

仅一例是日本报道的科间融合成功(Eguchi2 F,1993,糙皮侧耳与柱状田头菇),获得融合菌株[9],但未见形成子实体的报道,更谈不上选育出优良新品种来应用于生产实践。

1998年,肖在勤、谭伟等人报道以金针菇和凤尾菇(科间)为材料,获得融合子菌株[7],并从中选育出食用菌科间细胞融合新品种金凤221,在原生质体融合育种领域取得了突破性进展,引起食用菌界强烈反响。

同行专家鉴定认为:“该项成果在世界上首次研究成功了食用菌科间细胞融合技术,特别是突破了融合核分裂技术,获得了科间融合子菌株五个,在国内外同类研究中处于领先水平,具有重大的科学价值和实用价值。

”从融合菌株中选育的新品种金凤221具有“品质优良、生物有效转化率高,抗杂菌力强、出菇温度范围广、适用性强、易栽培等优良性状”。

并研究出一套高产栽培技术,对发展食用菌生产具有重要指导意义。

到目前,该品种已在全国30个省、市、自治区大面积推广应用,累计栽培超过10亿袋,新增产值达6亿元以上。

四川省作物品种审定委员会食用菌专业委员会的评委们认为“该品种的综合农艺性状特别在产量、适应性、抗杂菌力等方面显著优于同类推广品种,性状稳定,符合新品种要求;已产生显著社会经济效益。

”获省作物品种审定委员会颁发的“品种审定合格证书”。

金凤221为我省首例被通过的食用菌审定品种,结束了长期以来我省没有自己选育的食用菌品种的历史。

标志着我们在食用菌育种研究领域已进入全国、乃至全世界(科间远缘细胞融合新品种)的先进行列。

该项研究发明了融合核分裂技术,解决了长期以来远缘融合异核体遗传不稳定、核配菌株难以形成子实体的世界性难题,完善了食用菌细胞融合育种技术;并选育出了具有突出优良性状品种在生产上广泛应用。

所以该成果荣获1998年四川省科学技术进步一等奖。

该项技术荣获1999年国家技术发明二等奖,属当年国家技术发明的最高奖项(该年度无特等、一等技术发明奖),同时也是建国以来食用菌领域最高等级的国家技术发明奖。

3　食用菌原生质体融合菌株难以形成子实体问题的分析
自70年代初,原生质体融合技术开始进入食用菌育种领域,并显现出较大的优越性,在种内、种间甚至属间得到了融合子,有的甚至得到了能形成子实体的融合子菌株并应用于生产,但是,核配菌株不能形成子实体一直是个悬而未决的难题。

80年代中后期研究达到高潮后,由于未能找到解决远缘核配菌株形成子实体的办法,而使该类研究大多仅局限于获得种内、种间、属间融合子(除日本一例科间外,但未见形成子实体的报道)的基础性研究阶段,研究进展缓慢。

究其原因,我们认为是由于国内外均没有研究出融合核分裂技术,所以严格地讲,食用菌细胞融合技术还没有达到完善实用的程度。

原生质体融合技术使远缘杂交成为可能,但科间或科间以上的杂交仍不是件容易的工作,要克服物种间的不亲和性,在融合条件、培养条件等方面都要周到细致地分析,而核融合技术又是其中难点之一。

笔者采用了低PEG(聚乙二醇)的方法以降低对原生质体的毒性,又采用了适当转速的离心帮助原生质体间的联接,在高钙、p H和高温刺激以及物理学技术等方式下,得到了科间核融合菌株[8,13]。

在融合子的选择工作中,国内外多采用抗药性标记和营养缺陷型或单核亲本融合后产生锁状联合等方法,操作繁琐,工作量大且易损失亲本优良性状。

我们的研究是采用形态学和细胞学的方法,利用在选育过程中不同阶段锁状联合的有→无→有,细胞核的双→单→双作为依据选择融合子,简单、有效、易行。

国内外的相关研究得到核融合菌株的极少,而偶然得到的核融合菌株均被淘汰或忽视,但在远缘杂交中,为避免异核不稳定的现象,促使双亲细胞核融合是今后的发展方向之一。

我们研究中得到的融合菌株金凤2号至金凤7号都较稳定,没有逐步丢失某一亲本遗传物质的现象。

但难以形成子实体,多次试验后,认为使核融合菌株双核化是解决该难题的出路之一,双核化过程既是遗传物质重新组合过程,也是基因活化过程。

双核化后的核融合菌株均能形成子实体,在关键步骤中,筛选得到的核融合分裂剂B具有独特作用,它能够使核融合菌株的核分裂,而对单核菌株不起分裂作用,金凤2号菌株核分裂形成的后代金凤221、金凤225均有较为优良的农艺性状[8,13]。

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金凤221已推广应用8年,尚未见到不稳定和退化的现象,可以说明,采用这套以锁状联合和细胞核作为标记挑选核融合菌株,以融合核分裂剂处理得到衍生菌株,促使产生子实体的方法是切实有效的,从中可以选育得到稳定的远缘杂交后代。

从理论上讲,广泛存在担子菌中的不亲和性很复杂,并受基因控制,原生质体虽然去除了融合屏障,但不亲和性依然存在,即使融合得到了核配菌株,但剧烈的相互作用常导致杂交后代不能正常生长和繁殖。

但是可以推测,既然能实现人工方式下的核融合,那么也应该存在通过人工方式实现融合核分裂,并在这一过程中实现部分染色体重组的可能性,从而得到具有双亲遗传特性的优势后代。

基于这种指导思想,以肖在勤为首的研究人员研究出的融合核分裂技术,很好地实现了核配菌株的融合核分裂过程,从而解决了远缘融合异核体遗传不稳定、核配菌株难以形成的子实体的世界性难题,完善了食用菌细胞融合育种技术。

4　食用菌原生质体融合育种研究的发展趋势
411　原生质体融合育种理论
食用菌原生质体融合育种研究,在理论上将向融合子菌株形成子实体的遗传机制、基因调控机理等纵深方向深入探讨。

412　原生质体融合育种技术
食用菌原生质体融合育种在技术上:将探讨筛选融合子的新方法,除了目前已有的以双核菌丝形成锁状联合作为标记、抗药性标记、温度敏感性型标记、灭活原生质体、荧光染色等方法外,还将探讨更为简便可行的筛选融合子的方法;融合子的验证不再局限于菌丝生长速度、子实体形态、同工酶、氨基酸含量、出菇试验等常规技术,RAPD技术将广泛地应用于融合子的鉴定,随着研究水平的不断发展,现代分子生物学技术将在原生质体融合育种研究领域得到更加广泛的应用。

413　原生质体融合育种向科间以上远缘融合方向发展
由于细胞融合核分裂技术的出现,我们最近在食用菌目间融合成功,但还未得到在生产上应用的优良菌株。

随着研究的不断深入,进程不断加快,食用菌原生质体融合育种将从目前的科间融合向更远缘的目间、纲间融合方向发展。

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(责任编辑　谢成英)
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