杂交石竹雄性不育株离体快繁技术研究

杂交石竹雄性不育株离体快繁技术研究
宋利娜;许超;辛海波;赵正楠;李俊;张华丽
【摘要】以杂交石竹单株自交后代中出现的雄性不育株为材料,茎段为外植体,研究不定芽诱导、不定芽增殖及不定根生成最佳培养条件.结果表明:最佳不定芽诱导培养基为MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L,8d后可诱导出不定芽;最适于不定芽增殖的培养基为MS+6-BA 0.6 mg/L+NAA 0.1 mg/L,增殖倍数可达到10.2倍;最佳生根培养基为MS+NAA 0.3 mg/L.将根长6～8 cm试管苗移移植到温室炼苗、移栽,成活率达95％以上.
【期刊名称】《北京农学院学报》
【年(卷),期】2015(030)003
【总页数】4页(P92-95)
【关键词】杂交石竹;雄性不育株;离体快繁
【作者】宋利娜;许超;辛海波;赵正楠;李俊;张华丽
【作者单位】绿化植物育种北京市重点实验室/北京市园林科学研究院,北京100102;绿化植物育种北京市重点实验室/北京市园林科学研究院,北京100102;绿化植物育种北京市重点实验室/北京市园林科学研究院,北京100102;绿化植物育种北京市重点实验室/北京市园林科学研究院,北京100102;绿化植物育种北京市重点实验室/北京市园林科学研究院,北京100102;绿化植物育种北京市重点实验室/北京市园林科学研究院,北京100102
【正文语种】中文
【中图分类】Q813.1
杂交石竹（Dianthus hybridus）为石竹科石竹属多年生草本植物，由中国石竹与美国石竹杂交而成，花大似中国石竹，叶宽似美国石竹。

杂交石竹花色丰富、花朵艳丽、花型奇特，用途广泛，是布置花坛、花镜的常用材料；也可以盆栽和大面积地栽，还可作为切花生产，具有重要的园林应用价值［1－3］。

目前，中国生产栽培的杂交石竹品种大多为国外各大育种公司培育，种子芽率高，株型整齐，园林表现良好，故用量较多。

而中国在杂交石竹的品种选育方面起步较晚，研究相对落后，与国外相比有很大差距。

雄性不育系指在雌雄同株植物中，雄蕊发育不正常，不能产生有功能的花粉，但雌蕊发育正常，能接受正常花粉而受精结实。

利用雄性不育系进行农作物育种和制种工作，可充分发挥杂种优势、节省大量人力物力、降低成本、提高杂交效率、保证种子纯度［4］。

在石竹的杂交育种过程中，雄性不育系材料同样不可或缺。

离体快繁是保存不育株的有效方法之一，关于杂交石竹离体快繁的报道并不多，但同属康乃馨的研究较多，且茎尖、花梗、茎段、叶片、花器官等均可作为外植体诱导出不定芽［5－6］。

为了迅速获得大量杂交石竹不育材料，加快育种进程，本试验以发现的少量雄性不育株为材料，对其离体扩繁技术进行研究。

1 材料和方法
1.1 试验材料
试验材料为杂交石竹优良单株连续自交5代中出现的雄性不育植株，雄蕊退化，于2011年取自北京市园林科学研究院花卉与地被育种基地。

1.2 试验方法
1.2.1 外植体消毒 2011年6月，选取石竹雄性不育株幼嫩枝条，去掉叶片。

在流水下冲洗0.5～1 h，然后置于超净工作台，首先用75%酒精消毒30 s，无菌水冲
洗后，再用0.1%升汞浸泡6min左右，无菌水冲洗4～6次，取出置于消毒滤纸
上备用。

1.2.2 不定芽的诱导切取2cm左右带节茎段，接种于不定芽诱导培养基，每瓶接
种外植体数3个。

不定芽诱导基本培养基类型为MS，激素组合为6－BA和NAA，6－BA 浓度分别为1.0、1.5、2.0mg／L；NAA浓度分别为0.5、1.0mg／L，共
设6个处理（见表1），从中筛选出最佳不定芽诱导培养基。

表1 不同培养基对不定芽的诱导情况Tab.1 Effects of different culture mediums on adventitious bud induction注：诱导率＝诱导数／接种总数
×100%Note：Induction rate＝induction number／total number of inoculation×100%处理编号Culture medium不定芽生长情况Adventitious bud induction 11.00.573.3±5.8bB 6－BA浓度／（mg L－1）6－BA concentration／（mg L－1）NAA浓度／（mg L－1）NAA concentration／（mg L－1）诱导率／%Induction rate／%长势较弱生长势较弱
21.50.593.3±6.55aA 数量多，生长势强32.00.586.7±3.5aA 生长较健壮
41.01.046.7±6.25cC 生长势弱51.51.091.3±4.82aA 数量少，生长势强
62.01.080.0±4.16bB 数量多，
1.2.3 不定芽的增殖当不定芽长至1.5cm左右时，转接到不定芽增殖培养基上，
每瓶接入3个不定芽，25d后统计不定芽增殖情况。

不定芽增殖基本培养基类型
为在MS，激素组合为6－BA和NAA，6－BA浓度分别为0.2、0.6、1.0mg／L；NAA 浓度为0.1、0.2mg／L，共设6个处理（表2），筛选出最佳不定芽增殖培养基。

1.2.4 生根培养不定芽长至4～5cm时，转接于NAA浓度分别0.1、0.3、0.5mg ／L的 MS培养基（表3），20d后记录不同处理间生根情况。

本试验中，所有培养基中琼脂用量为5g／L，蔗糖浓度为3.0%，pH值5.8～6.2。

每个处理15瓶，培养基均以121℃高压灭菌20min，在（25±2）℃、光强2000lx、16h光照／8h黑暗的条件下培养。

2 结果与分析
2.1 不同培养基对不定芽诱导效果的影响
外植体接种于不同培养基上，8d左右可在节处诱导出不定芽（图1），20d后不定芽的长势明显不同。

表1所示：从诱导率来看，2、3和5号处理极显著高于其他处理。

相比之下，2号处理生长的不定芽数量多于5号处理。

2号处理与6号处理的不定芽产生数量都高于其他处理，但2号处理的诱导率明显高于6号。

这6个处理中，杂交石竹雄性不育株最适不定芽诱导培养基为2号处理MS＋1.5 mg ／L 6－BA＋0.5mg／L NAA。

图1 不定芽诱导Fig.1 Adventitious bud induction
2.2 不同培养基对不定芽增殖效果的影响
外植体接种25d，不定芽长至约1.5cm时，剪取不定芽接种到不定芽增殖培养基上。

30d左右观察不定芽增殖倍数与生长情况。

结果表明（表2），处理3和6增殖倍数均显著高于其他处理；2号处理芽增殖倍数略低，但芽的生长状况明显优于3和6号处理（图2）。

将石竹最佳不定芽增殖培养基确定为MS＋6－BA 0.6mg／L＋NAA 0.1mg／L。

表2 不同培养基对不定芽增殖效果的影响Tab.2 Effects of different culture mediums on adventitious bud multiplication处理编号Culture medium生长情况Growth 10.20.16.7±0.53bAB 正常，6－BA浓度／（mg L－1）6－BA concentration／（mg L－1）NAA浓度／（mg L－1）NAA concentration／（mg L－1）增殖倍数Multiplication times有少许根20.60.110.2±0.61abAB 正常，芽饱满31.00.113.1±0.87aA 不定芽偏小，长势慢40.20.23.4±0.79cB 不定芽少，根多50.60.25.6±1.04bcAB 正常，芽饱满61.00.212.8±0.44aAB 不定
芽偏小，长势慢
图2 不定芽增殖Fig.2 Adventitious bud multiplication
2.3 不同培养基对生根效果的影响
将长至5～6cm的不定芽从增殖培养基转至添加不同浓度NAA的生根培养中，
10d左右有不定根生成，25d后比较各处理生根效果。

结果表明（表3），4个处理中，均有不定根生成，处理3不定根长度显著长于其他3个处理。

综合根的数
量与长势比较，3号处理较为理想，生根数量较多且长势粗壮（图3）。

2.4 试管苗训化移栽
根长至6～8cm左右时，将试管苗置于温室炼苗，3d后去掉封口膜，敞口继续放置2d后，取出小苗用自来水洗净根部培养基，栽于不同混合基质中，基质用50%多菌灵500倍稀释消毒。

其中草炭∶珍珠岩∶蛭石∶园土为2∶1∶1∶1的混合基
质中，幼苗成活率可达95%。

移栽45d后，组培苗株高可达8cm（图4）。

表3 不同培养基对不定根诱导的影响Tab.3 Effects of different culture mediums on adventitious root induction处理编号Culture medium otential 10.143.3±0.89b NAA浓度／（mg L－1）NAA concentration／（mg L－1）
不定根条数Adventitious root number不定根根长／cm Adventitious root length／cm不定根长势Adventitious root p细弱20.274.7±0.45ab 长势慢30.395.5±0.52a 粗壮，长势强40.4115.0±0.36ab 较粗壮
图3 不定根的诱导Fig.3 Adventitious root induction
图4 组培苗移栽成活Fig.4 The transplanted plantlets
2.5 不育性的保持与不育系的建成
移栽90d后，第一朵花开放，花药退化，雌蕊正常，仍为雄性不育株（图5）。

移栽105d后，移栽的植株均可开花，且花药全部退化，均为雄性不育株（图6）。

图5 移栽后雄性不育株单花Fig.5 Single flower of male sterile plant
图6 栽后开花植株Fig.6 Male sterile plants during flowering stage
3 讨论
石竹的组织培养研究起步很早，但研究结论不尽相同［7－11］。

从本试验所得到的数据分析表明，石竹不育株离体培养最佳不定芽诱导培养基与不定芽增殖培养基分别为 MS＋6－BA 1.5mg／L＋NAA 0.5mg／L 与 MS＋6－BA 0.2mg／L＋NAA 0.1 mg／L。

这一结论与费永俊等所报道的石竹不定芽诱导与不定芽增殖培
养基分别为 MS＋6－BA 1.0 mg／L＋NAA 0.3mg／L与 MS＋6－BA 0.3mg／L ＋NAA 0.1mg／L的结论略有不符。

究其原因可能为所选外植体品种不同，费永
俊等所选用材料为中国石竹，本试验所采用材料为国外杂交石竹F1代植株。

由此可见，不同石竹材料离体培养所需条件不同，本试验结果只适用于杂交石竹。

本试验中选取茎段为外植体，不定芽诱导率较高，但以茎段为外植体，取材有限，影响扩繁效率。

如果能采用其他材料为外植体，如叶片等也能获得较高的再生效果，将会极大提高扩繁效率，刘彩霞等选取香石竹叶片为外植体，成功获得植株再生体系［12］。

建立杂交石竹叶片不定芽诱导体系对提高扩繁效率很有意义。

关于石竹雄性不育的研究国内外报道较少，仅见傅小鹏对石竹雄性不育系小孢子形成过程进行细胞学观察［13］。

本研究中经过离体快繁获得的石竹不育株生长健壮，可正常开花，雄蕊依然退化，仍为雄性不育株。

可见，通过组培扩繁可以保持石竹雄性不育性状，为石竹不育系的获得奠定基础。

本研究为石竹雄性不育类型及遗传机制的进一步研究奠定了良好基础。

参考文献：
［1］费永俊，汤隆，刘雅丽.6－BA对中国石竹雄性不育植株离体保存的影响［J］.现代农业科技，2011（2）：221－222，224
［2］陈利萍，王艳菊，葛亚明，等.石竹科植物组织培养与细胞工程［J］.细胞生物学杂志，2005（27）：545－548
［3］包满珠.园林植物育种学［M］.北京：中国农业出版，2004
［4］傅小鹏.石竹自交系遗传多样性评价及杂种优势的研究［D］.武汉：华中农
业大学，2008
［5］徐茜，徐燕，余鸿燕.红色香石竹花梗诱导植株再生技术［J］.江苏农业科学，2012，40（6）：49－50
［6］张晓宁，陈晓玲，卢新雄，等.香石竹种质离体保存研究进展［J］.植物遗传资源学报，2012，13（2）：288－292，298
［7］李欣，张彦妮，陈立新，等.须苞石竹组织培养和快速繁殖［J］.东北林业大学学报，2009，37（3）：12－13，52
［8］樊金萍，柴志坚，初雪清，等.尖叶石竹组织培养及快繁技术［J］.东北农业大学学报，2008，39（1）：39－42
［9］兰伟，蔡健，冯守平.常夏石竹的组培与快速繁殖［J］.林业科技开发，2006，20（2）：55－57
［10］王晶，王永忠，王合心.常夏石竹在草坪中的应用及其品种选育与组培快繁［J］.蒙古农业科技，2009（1）：36－37
［11］金万梅，尹淑萍，鲁万强，等.地被石竹组织培养再生体系的研究［J］.河
北林果研究，2006，21（2）：124－126
［12］刘彩霞，孙振元，刘军，等.利用二次回归正交设计优化香石竹叶片再生体系中6－BA和NAA的浓度组合［J］.核农学报，2008，22（1）：45－48 ［13］傅小鹏，胡尽义，胡惠蓉，等.石竹雄性不育系小孢子形成过程的细胞学观察［J］.中国农业科学，2008，41（7）：2085－2091。