HPLC法测定杨梅中两种黄酮的含量研究

HPLC法测定杨梅中两种黄酮的含量研究
吴飞; 李雅丽; 顾田甜; 马旗联; 郝丽莉; 刘江云
【期刊名称】《《中国民族民间医药》》
【年(卷),期】2017(026)020
【总页数】3页(P24-26)
【关键词】杨梅; HPLC; 矢车菊素-3-葡萄糖苷; 杨梅苷
【作者】吴飞; 李雅丽; 顾田甜; 马旗联; 郝丽莉; 刘江云
【作者单位】苏州大学医学部药学院江苏苏州215123; 新疆医科大学第一附属医院新疆乌鲁木齐830011
【正文语种】中文
【中图分类】R285
杨梅(Myrica rubra Sieb.et Zucc.)是我国的特产水果之一，主要种植在长江流域以南的浙江、江苏、云南、广西等地区。

杨梅具有消食、除湿、解暑、生津止咳、助消化、御寒、止泻、利尿、防治霍乱等多种功效，有“果中玛瑙”之誉[1]。

《本草纲目》记载杨梅有“止渴、和五脏、涤肠胃等功能”。

研究表明，杨梅中含有花色素、杨梅素等黄酮类物质，以及丰富的有机酸、糖类、维生素、蛋白质等活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗菌、增强机体免疫力、降血糖、降血脂等多种药理作用[1]。

杨梅中的红色素(杨梅红)是一种花色苷类天然色素，其中主要成分为矢车菊素-3-葡萄糖苷(1)，已于2015年获批为食用添加剂[2]。

市售品杨梅提取物可从树皮、叶、果中提取，杨梅苷(2)是其中主要有效成分之一。

杨梅果实成熟期集中在高温多雨的6、7月份梅雨季节，不耐贮运，有“一日味变，二日色变，三日质变”的说法，采摘、运输过程中稍稍挤压和碰撞极易变质，常温货架期仅2～3天，这极大限制了新鲜杨梅的产销和深加工[3]。

本文对杨梅鲜果中两种主要成分1和2的含量同时测定方法进行研究，为杨梅的质量分析和深入开
发应用提供科学参考。

1.1 仪器 Agilent 1260高效液相色谱系统(包括1260 Infinity VL 型四元泵，1260 DAD VL 检测器，LC-Solution色谱工作站，美国Agilent 公司)；ODS色谱柱
(5C18- PAQ，4.6mm×250mm，日本Cosmosil公司)；MP2002电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；ME215S型电子天平(德国Starorious公司)；SB-5200DTDN超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 材料杨梅果实(MR161001；冻存)购自常熟虞山宝岩，经苏州大学药学院陆叶博士鉴定为杨梅科植物杨梅(Myrica rubra)的果实。

矢车菊素-3-葡萄糖苷对照品
为本实验室自制(按液相相对峰面积计，HPLC纯度为93.2%)；杨梅苷对照品(HPLC纯度大于98%，南京森贝伽生物科技有限公司)。

乙腈(色谱纯，瑞士Oceanpak公司)；纯净水(杭州娃哈哈公司)；冰乙酸、乙醇、甲醇等其他试剂均
为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。

2.1 对照品溶液的制备精密称取矢车菊素-3-葡萄糖苷对照品10.04mg置10mL
棕色容量瓶中，加50%甲醇超声溶解，定容，作为对照品1储备液
(1.004mg/mL)；分别精密量取对照品1储备液0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL 于10mL棕色容量瓶中，用50%甲醇定容，制成系列矢车菊素-3-葡萄糖苷对照品溶液。

另精密称取杨梅苷对照品9.96mg 置10mL棕色容量瓶中，同法制成对照品2储
备液(0.996mg/mL)；分别精密量取对照品2储备液0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL于50mL容量瓶中，用50%甲醇定容，制成系列杨梅苷对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备取供试品10枚，解冻至常温，去核，称重为55.04g。

杨
梅果肉样品捣碎，超声破碎，取约5.0g，精密称定，置50mL棕色容量瓶中，加50%甲醇适量，超声(功率250W，频率40kHz)提取30min，室温下定容，经
0.45μm滤膜滤过，即得。

2.3 色谱条件色谱柱：Cosmosil-5C18-PAQ色谱柱(4.6mm×250mm)；以0.1%乙酸溶液(A)- 乙腈(B)为流动相梯度洗脱(0～30min，5%B ～ 53%B)；流速
1.0mL/min；柱温40℃；检测波长：360、520nm。

进样量20μL。

在该色谱条
件下，绘制对照品及供试品色谱图,如图1所示。

图中对照品及供试品中的各色谱
峰分离良好，分离度均大于1.5。

2.4 线性关系考察分别取对照品1、2系列溶液，按“2.3”项下色谱条件进行测定。

以对照品浓度为横坐标，以峰面积值为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。

得到矢车菊素-3-葡萄糖苷的线性方程为Y=
3.8747X-3
4.419，R2=0.9996，线性范围20.08-200.8μg/mL；杨梅苷的线性方程为Y=19.513X-2.3965，R=0.9995，线性范围3.984～39.84μg/mL。

结果表明各成分在各自浓度范围内线性关系良好。

2.5 精密度考察精密吸取供试品溶液20μL，重复进样6次，以峰面积指标计算RSD(n=6)，考察方法的精密度。

结果测得成分1和2的RSD分别为1.94%和
0.77%，表明仪器的精密度符合分析要求。

2.6 重复性考察按“2.2”项下方法平行制备6份样品供试品溶液，按“2.3”项色谱条件测定2种成分的含量。

以含量为指标计算RSD，考察方法的重复性。

结果
测得成分1和2按鲜品计的含量依次为580.9、56.53mg/g，RSD依次为1.61%、
1.88%，表明本法重复性符合分析要求。

2.7 稳定性考察取供试品溶液分别于0、4、8、12、16和24 h进样分析，测定
2种成分峰面积，以峰面积值为指标计算RSD(n=6)。

结果测得成分1和2的RSD依次为2.15%、1.92%，表明本法供试品24h内稳定性良好。

2.8 加样回收实验精密称取已知含量的杨梅果肉样品2.5g，共称取6份，分别加
入精密对照品混合溶液(其中含对照品1和2依次为1.535、0.1594 mg/mL)1mL，按照“2.2”项下供试品溶液的制备方法制备。

成分1和2的平均回收率分别为97.5%、96.2%，详见表1。

2.9 样品测定按“2.2”项下制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进行测定，计算供试品溶液中2个成分的含量，按鲜品计为586.2、56.97 mg/g。

照《中国
药典》2015年版水分测定法第二法，检测供试品中水分含量为86.22%。

结果：
杨梅果肉中矢车菊素-3-葡萄糖苷和杨梅苷的含量按干燥品计，依次为4.254mg/g、0.4134mg/g。

杨梅果实中富含花色苷、有机酸、糖类、维生素、蛋白质等多种营养物质，相关成分分析报道较多[1]，但对其中的杨梅苷等黄酮的含量分析报道较少。

本文根据花
色苷(520nm)、黄酮苷(360nm)两类成分结构导致的紫外-可见光谱特征吸收波长
差异，参考相关研究[4-5]，采用双波长法同时定量分析花色苷和杨梅苷含量，研
究结果表明,该法灵敏度高、简便快捷，可为杨梅的质量分析方法提供参考。

此外，在供试品的制备过程中发现，杨梅及其中的花色苷、杨梅苷化学性质不太稳定，在室温25℃以下不宜久置超过24h。

【相关文献】
[1]黄海智. 杨梅酚类化合物抗氧化和抗癌功能及机理研究[D].杭州：浙江大学，2015.
[2]本社.GB 2760—2011食品安全国家标准食品添加剂使用标准[M].北京：中国质检出版社，2011.
[3]杨琴. 杨梅果实劣变机制及保鲜研究[D].杭州：浙江师范大学，2014.
[4]Shaohuan Zhou, Zhongxiang Fang, Yuan Lv, et al. Phenolics and antioxidant properties
of bayberry (Myrica rubra Sieb. et Zucc.) pomace [J]. Food Chemistry, 2009(112): 394-399. [5]齐洁,万竹青,李默影,等. HPLC法测定杨梅叶中杨梅苷的含量[J].中国野生植物资源, 2012 (1):
35-37.。