本课题现有工作基础：

本课题现有工作基础：
在本课题组前期的新型Aurora 激酶的小分子抑制剂的发现阶段，我们分别以AT-9283、VX-680和ZM447439为先导化合物，运用药物设计的基本原理，分别设计合成了吡唑-苯并咪唑类、4-苯胺基嘧啶类和4-芳香胺基喹唑啉类共50个目标化合物，均未见文献报道。

所有化合物的结构均经1H-NMR 、13C-NMR 、IR 、MS 和EA 确证。

我们对这些化合物进行了初步的体内外的药效及安全性评价，最终得到化合物AM-004可作为候选药物做进一步临床前研究，下面简述AM-004的发现过程。

AM-004是以A T-9283为先导化合物，在分析其构效关系的基础上，运用药物设计的基本原理改造而得到。

AT-9283是Astex Therapeutics 公司基于分子片段药物发现方法研发的Aurora 激酶小分子抑制剂，现已处于临床Ⅱ期阶段。

AT-9283是一个抑制苏氨酸/苏氨酸激酶(包括Aurora A 和B 、JAK-2和3，Tyk2、RSK2)多靶点抑制剂，其IC 50均低于10 nM ，同时A T-9283对表达野生型BCR-ABL 或突变型BCR-ABL 或其突变体的人类细胞株有显著的抑制细胞增殖活性。

该化合物临床Ⅰ/Ⅱ用于治疗实体瘤和白血病。

临床Ⅰ期用于治疗难愈白血病的结果在2008 ASCO 大会上公开，在用药患者中发现，AT-9283能够诱导组蛋白H3的磷酸化(抑制Aurora B)，至今在A T-9283的临床研究中，没有发现严重的不良反应。

N
O
N
N H HN N
NH
AT-9283
NH O
目标分子的设计：
以A T-9283为先导化合物进行药物设计，运用连接变化法，环合原理和生物电子等排原理等药物设计的基本方法，酰胺或脲基团通过环合，得到五元或六元杂环，杂环起到“拟酰胺”或“拟脲”的构像限制的作用（如图1所示）。

N
N H
HN N
NH
R 1O
R 2
N
N H
HN N
HN
R 2
O
N
N H
HN N
HN
R 2
N X R 1
N
N H
HN N
NH
NH O
R 2
R 1N
N H
HN
N
NH
R 2
N O
图1 目标化合物的设计
基于以上设计思想拟设计吡唑-苯并咪唑母核类目标化合物，共计15个(见表2)。

表2 吡唑-苯并咪唑母核类目标化合物
目标化合物初步体内外生物活性测试：
(1) 对目标化合物筛选出具有Aurora激酶抑制活性的小分子抑制剂
Aurora激酶在有丝分裂过程中起重要作用，尤其是Aurora B调控胞质分裂过程，抑制Aurora B激酶，将导致该过程不能顺利进行，将形成多倍体细胞。

依据此特点，将化合物与肿瘤细胞共培养48小时后，观察肿瘤细胞的多倍体形成情况，筛选出活性较好的化合物。

如表3所示，AM-004（结构见表2）具有较强的诱导多倍体形成的能力，推断其可能具有Aurora激酶抑制活性的小分子化合物。

为确证AM-004为Aurora激酶抑制剂，利用均相时间分辨荧光法检测体外的激酶抑制活性，结果显示，AM-004是高效的Aurora激酶抑制剂，对Aurora A/B/C的IC50分别为35.91、68.46、73.01 nM 。

表 3 化合物（部分）诱导HCT116和HT29细胞形成多倍体
化合物编号分子量HCT116形成多倍体时
化合物浓度（nM）
HT29形成多倍体时
化合物浓度（nM）
AM-001 424 250-200 >250 AM-002 456 >250 >250 AM-003 601 >250 >250 AM-004 545.15 100-75 150-100 AM-005 454 250-200 250-200 AM-006 599 >250 >250 AM-007 339 >250 >250 AM-008 371 >250 >250 AM-009 516 >250 >250 AM-011 442.15 250-200 >250 AM-012 587.2 >250 >250 AN-001 444 >250 >250 AN-002 359 >250 >250
（2）AM-004的抗肿瘤效果初步评价
首先在细胞内评价AM-004的药效，选用不同组织部位的肿瘤细胞与AM-004共培养，在72 h后检测细胞活力，计算IC50。

从表4可以看出，AM-004对结肠癌HCT116细胞和肝癌SMMC-7721细胞的抑制作用最强，IC50值分别是66.8和104.8 nM。

随后通过细胞计数（图1a）和克隆形成实验（图2b）进一步检测抑制肿瘤细胞的增值效果，与细胞活力实验相符。

裸鼠移植瘤实验（图2c）显示，AM-004对HCT116和HT29的抑制作用显著，腹腔给药剂量为2.5, 5和7.5mg/kg，18天后，7.5mg/kg剂量组对HCT116和HT29肿瘤生长抑制率分别为69%和63%。

给药期间体重减少在10%以内。

表4 AM-004对肿瘤细胞生长的抑制作用
Cell line Tissue origin p53 status IC50 (nM) a
HCT116 Colon wild-type 66.8±15.3
HT29 Colon mutant 358.8±103.4 SMMC-7721 Liver wild-type 104.8±18.6
HepG2 Liver wild-type 425.2±84.3
K562 Leukemia negative 100.3±32.1
HL60 Leukemia negative 288.3±58.3
AGS Stomach wild-type 365.0±118.1
BGC-823 Stomach mutant 301.3±99.7
A549 Lung wild-type 407.5±46.8
A431 Epidermis mutant 313.1±107.9
SK-OV3 Ovary mutant 497.7±214.9
图2 AM-004对HCT116和HT29细胞增殖（a）、克隆形成（b）以及裸鼠移植瘤（c）生长的抑制
（3）AM-004在细胞内可抑制Aurora激酶活性，影响纺锤体与染色体形态Aurora B在细胞内主要催化组蛋白ser-10残基并使其磷酸化，图3（a，b）结果表明在AM-004处理的细胞中，Aurora激酶的表达水平不受药物影响，但是Aurora激酶的催化活性明显受到抑制，荧光强度减弱。

当AM-004作用细胞时，药物对肿瘤细胞的纺锤体（图3c）形成产生影响，使之发生异常，如单极纺锤体和环状纺锤体形成。

同时，染色体的排列也产生了影响，如单极染色体落后、双极染色体落后和大量染色体不能聚集，分散在细胞核内。

这些现象与文献报道的Aurora A 抑制现象吻合。

图3d显示的是多倍体细
胞，这是Aurora B激酶抑制的结果。

图3 AM-004细胞内抑制Aurora激酶活性（a，b）以及对纺锤体与染色体形
态的影响（c，d）
（4）AM-004影响细胞周期、促进细胞凋亡与衰老
图4为AM-004对HCT116和HT29细胞周期的影响，从中可以看出，随着时间或浓度的增加二倍体细胞逐渐减少，四倍体和八倍体细胞递增，说明细胞出现多倍体，无法分裂。

图4 AM-004对HCT116和HT29细胞周期的影响为更进一步了解AM-004对周期的影响，图5b所示，在各个时间点有丝分裂指数的变化，有丝分裂指数是细胞中有丝分裂细胞所占的百分比。

与a图结果相对应，细胞在6h后进入有丝分裂，11h后退出有丝分裂。

对照组和AM-004组的曲线非常吻合，说明虽然AM-004阻止细胞分裂成两个子细胞，但是细胞进
入和退出有丝分裂不受影响。

即AM-004只阻止细胞的胞质分裂的过程。

图5 细胞同步化后分析AM-004对细胞进程的影响AM-004可诱导细胞凋亡（图6a），但是在实验过程中发现很多AM-004处理后的细胞长时间维持贴壁状态，不发生凋亡，推测AM-004可能导致细胞衰老，通过半乳糖苷酶染色可见,在AM-004处理3天后，细胞半乳糖苷酶表达升高，
衰老阳性细胞增多，同时溶酶体也增大（图6b），这都是细胞衰老的现象。

图6 AM-004诱导细胞凋亡（a）和衰老（b，c）
综上所述，经过多倍体实验的初筛，课题组从前期目标化合物中筛选出为AM-004，其具有抑制Aurora激酶的活性，且对Aurora A、B、C的IC50值都在100 nM以下，是高效的Aurora激酶抑制剂。

AM-004可抑制多种肿瘤细胞的生长，并在细胞内也能抑制Aurora激酶的催化活性，但是对Aurora激酶的表达没有影响。

通过对Aurora激酶的抑制，细胞纺锤体组装出现缺陷，染色体分离受影响，并形成多倍体细胞。

经过细胞周期的分析发现，AM-004对细胞有丝分裂的进入和退出不产生影响，但是抑制了胞质分裂的过程，使细胞无法分裂成子细胞。

另外我们发现AM-004可诱导细胞凋亡和衰老，可能与Aurora激酶参与线粒体分裂过程有关。

本课题组对AM-004进行了初步的合成工艺研究、质量控制、主要药效学研究、药理学研究、药代动力学以及急毒、特殊毒性和生殖毒性的实验研究，为申请AM-004的临床批件打下了坚实的基础。

实验研究结果概述如下：
1、AM-004的合成工艺研究
(1) 对于AM-004进行了结构确证；
(2) 完成了AM-004的合成工艺路线改革和工艺优化；
(3) 确定了各步合成中间体的理化常数，完成了各步中间体的质量控制方法研究；
(4) 进行了AM-004的理化性质、纯度检查方法、HPLC检测方法和质量控制方法研究，并进行了初步稳定性考察；
(5) 合成了2000克合格的药品供药理试验使用(其中用于药效学、药理学和初步毒性实验已用去1500g)。

2、AM-004的主要药效学研究（见前面AM-004体内外生物活性测试部分，仅供参考）
3、AM-004的一般药理学研究
对大鼠及毕格犬的运动系统功能、感觉系统功能及自主神经系统均无明显影响。

4、AM-004的急毒预试
AM-004小鼠急性毒性预试验，一次给药（ip）剂量达500mg/kg未见死亡，估计急性毒性致死剂量>1000mg/kg ip。

5、AM-004的特殊毒性（致突变作用）研究
(1) 微核试验
AM-004在50mg/kg剂量腹腔给药时无致突变作用，对骨髓细胞无毒性作用。

(2)染色体畸变
AM-004在50mg/kg时无染色体畸变现象。

6、AM-004的生殖毒性
AM-004口服给药在所选用的剂量及实验条件下未见致畸效应。

7、AM-004的药代动力学研究
对小鼠进行了初步的药代动力学研究，分别通过静脉注射和口服给药二种途径。

对于口服给药，本实验用丙二醇与水1：1将AM-004溶解，结果显示半衰期以及平均滞留时间数据较为理想，平均口服生物利用度达到33％，初步判定AM-004具有较好的药代动力学参数，适合下一步深入的药效学研究。

综上所述，我们对AM-004进行了基本规范的临床前药效学、药理学、初步药动学以及毒理学研究，取得了可喜的结果。

AM-004具有较好的靶向抑制Aurora激酶活性，从初步的毒理学及药代动力学实验研究可以判定其具有较高的安全性及较好的体内药动学性质。

同时，AM-004为一全新未知的结构，我们对其拥有完全的自主知识产权，已经申请了中国发明专利。

因此我们相信，按照相关法规及技术要求，对AM-004进行完全规范化的药学、药效学、药代动力学及安全性评价等临床前研究工作，AM-004可以作为一个新颖性、成药性高的新药进入临床研究，并最终有可能成为一个具有自主知识产权、疗效突出、安全性较高的新一代治疗肿瘤疾病的新药。