川麦冬药材中黄酮类成分的测定方法[发明专利]

(10)申请公布号 CN 102759582 A
(43)申请公布日 2012.10.31C N 102759582 A
*CN102759582A*
(21)申请号 201110109044.4
(22)申请日 2011.04.28
G01N 30/02(2006.01)
G01N 30/06(2006.01)
(71)申请人天津天士力之骄药业有限公司
地址300410 天津市北辰区普济河东道2号
天士力现代中药城
(72)发明人叶正良 贾诚 李德坤 周大铮
(74)专利代理机构北京华科联合专利事务所
11130
代理人
王为
(54)发明名称
川麦冬药材中黄酮类成分的测定方法
(57)摘要
本发明涉及一种川麦冬药材中黄酮类成分的
测定方法，该方法包括以下步骤：步骤1、对照品
溶液的制备，分别精密称取对照品甲基麦冬黄烷
酮A 、B 、6-醛基异麦冬黄烷酮A 适量，加甲醇溶解，
分别制成甲基麦冬黄烷酮A 、甲基麦冬黄烷酮B ，
6-醛基异麦冬黄烷酮A 三种对照品溶液；步骤2、
供试品溶液的制备，取川麦冬药材粉末用甲醇溶
解，过C18柱，甲醇洗脱得供试品溶液；步骤3、将
步骤1和步骤2注入HPLC 仪器中，得到色谱图；步
骤4、对图谱的相似性进行比较相似为含量合格。

(51)Int.Cl.
权利要求书2页 说明书6页 附图2页
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书 2 页 说明书 6 页 附图 2 页
1.一种川麦冬药材中黄酮类成分的测定方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
步骤1、对照品溶液的制备，分别精密称取对照品甲基麦冬黄烷酮A、B、6-醛基异麦冬黄烷酮A适量，加甲醇溶解，分别制成甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B，6-醛基异麦冬黄烷酮A三种对照品溶液；
步骤2、供试品溶液的制备，取川麦冬药材粉末用甲醇溶解，过C18柱，甲醇洗脱得供试品溶液；
步骤3、将步骤1和步骤2注入HPLC仪器中，得到色谱图；
步骤4、对图谱的相似性进行比较相似为含量合格。

本发明中所述指纹图谱是HPLC的色谱图。

2.根据权利要求1的测定方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
步骤1、对照品溶液的制备，分别精密称取对照品甲基麦冬黄烷酮A、B、6-醛基异麦冬黄烷酮A适量，加甲醇溶解，分别制成甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B，6-醛基异麦冬黄烷酮A三种对照品溶液。

步骤2、供试品溶液的制备，取川麦冬药材粉末约6.0g，精密称定，用甲醇超声提取3次，每次30min，每次加甲醇50mL，合并提取液，过滤，蒸干，加水50mL使溶解，上自制C18小柱富集(80～100目，内径1cm，柱高为2cm，单个柱体积约为6ml，上样前用0.5mol·L-1NaOH 溶液处理，再加水平衡)，首先上样(流速0.5ml·min-1)，用4倍柱体积50％甲醇除去杂质(流速0.5ml·min-1)，再用5倍柱体积甲醇洗脱目标物质(流速0.3ml·min-1)，将所得甲醇液蒸干，加甲醇溶解至5mL容量瓶，即得供试品溶液。

步骤3、将步骤1和步骤2的溶液分别注入HPLC仪器中，得到色谱图，对图谱的相似性进行比较。

步骤4、相似为含量合格。

3.一种川麦冬药材中黄酮类成分的测定方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(A)取合格的川麦冬药材粉末，按照上述方法建立川麦冬药材粉末标准指纹图谱；
(B)取待检川麦冬药材粉末，按照上述方法得到指纹图谱；
(C)将步骤(B)得到的指纹图谱和步骤(A)得到的标准指纹图谱进行比对，符合即为合格产品，不符合即为不合格产品。

4.根据权利要求1的测定方法，其特征在于，色谱条件如下：
色谱柱：Waters symeteryC18色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)；流动相：A(0.05％磷酸)-B(乙腈)，梯度洗脱(见表1)，柱温30℃，流速1.0mL·min-1，检测波长296nm，进样量10μL。

液相梯度洗脱条件
5.根据权利要求1的测定方法，其特征在于，该方法精密度较好。

6.根据权利要求1的测定方法，其特征在于，该方法重现性较好。

7.根据权利要求1的测定方法，其特征在于，该方法在24小时内稳定。

川麦冬药材中黄酮类成分的测定方法
技术领域：
[0001] 本发明涉及一种中药测定方法，特别涉及一种川麦冬药材中黄酮类成分的含量测定方法。

背景技术：
[0002] 川麦冬：主产于四川绵阳地区，以涪江冲积平原所产麦冬为佳品，又称涪江麦冬，含多种甾体皂甙：麦冬皂甙A、B、C、D，甙元均为假叶树皂甙元，另含麦冬皂甙B’、C’、D’，甙元均为薯蓣皂甙元；尚含多种黄酮类化合物：如麦冬甲基黄烷酮A、B，麦冬黄烷酮A、麦冬黄酮A、B，甲基麦冬黄酮A，B；另分得5个高异黄酮类化合物.
[0003] 麦冬具有养阴生津，润肺清心的功能。

用于肺燥干咳，虚痨咳嗽，津伤口渴，心烦失眠，内热消渴，肠燥便秘；咽白喉。

目前已有一些文献报道麦冬的指纹图谱分析方法，但尚缺少对麦冬药材中黄酮类成分指纹图谱的研究，因此本实验对麦冬药材中黄酮类成分进行了指纹图谱的研究，以期为全面控制麦冬药材的质量提供参考依据。

[0004] 川麦冬药材中黄酮类成分的含量测定目前主要使用滴定法，该法操作复杂，精密度差，目前尚无更精确的测定方法，本发明采用HPLC法，获得了川麦冬药材中黄酮类成分指纹图谱，同时使用该法测定川麦冬药材中黄酮类成分的含量，取得了良好的效果。

发明内容：
[0005] 本发明提供一种川麦冬药材中黄酮类成分的含量测定，该方法包括以下步骤：[0006] 步骤1、对照品溶液的制备，分别精密称取对照品甲基麦冬黄烷酮A、B、6-醛基异麦冬黄烷酮A适量，加甲醇溶解，分别制成甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B，6-醛基异麦冬黄烷酮A三种对照品溶液；
[0007] 步骤2、供试品溶液的制备，取川麦冬药材粉末用甲醇溶解，过C18柱，甲醇洗脱得供试品溶液；
[0008] 步骤3、将步骤1和步骤2注入HPLC仪器中，得到色谱图；
[0009] 步骤4、对图谱的相似性进行比较相似为含量合格。

[0010] 本发明中所述指纹图谱是HPLC的色谱图。

[0011] 另一种方法为：
[0012] (A)取合格的川麦冬药材粉末，按照上述方法建立川麦冬药材粉末标准指纹图谱；
[0013] (B)取待检川麦冬药材粉末，按照上述方法得到指纹图谱；
[0014] (C)将步骤(B)得到的指纹图谱和步骤(A)得到的标准指纹图谱进行比对，符合即为合格产品，不符合即为不合格产品。

[0015] 优选的本发明的测定方法，步骤如下：
[0016] 步骤1、对照品溶液的制备，分别精密称取对照品甲基麦冬黄烷酮A、B、6-醛基异麦冬黄烷酮A适量，加甲醇溶解，分别制成甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B，6-醛基异
麦冬黄烷酮A三种对照品溶液。

[0017] 步骤2、供试品溶液的制备，取川麦冬药材粉末约6.0g，精密称定，用甲醇超声提取3次，每次30min，每次加甲醇50mL，合并提取液，过滤，蒸干，加水50mL使溶解，上自制C18小柱富集(80～100目，内径1cm，柱高为2cm，单个柱体积约为6ml，上样前用0.5mol·L-1NaOH溶液处理，再加水平衡)，首先上样(流速0.5ml·min-1)，用4倍柱体积50％甲醇除去杂质(流速0.5ml·min-1)，再用5倍柱体积甲醇洗脱目标物质(流速0.3ml·min-1)，将所得甲醇液蒸干，加甲醇溶解至5mL容量瓶，即得供试品溶液。

[0018] 步骤3、将步骤1和步骤2的溶液分别注入HPLC仪器中，得到色谱图，对图谱的相似性进行比较。

[0019] 步骤4、相似为含量合格。

[0020] 本发明的色谱条件如下：
[0021] 色谱柱：Waters symeteryC18色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)；流动相：A(0.05％磷酸)-B(乙腈)，梯度洗脱(见表1)，柱温30℃，流速1.0mL·min-1，检测波长296nm，进样量10μL。

[0022] 表1液相梯度洗脱条件
[0023]
[0024] 本发明的方法是经过筛选获得的，研究过程如下：
[0025] 1.仪器与试药
[0026] Waters Alliance2695高效液相色谱仪，Waters2998检测器，Empower色谱工作站(美国Waters公司)，AL204电子天平，XS105梅特勒精密电子分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)，KQ-500DE数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

乙腈为色谱纯，水为重蒸水，其他试剂均为分析纯。

甲基麦冬黄烷酮A、B、6-醛基异麦冬黄烷酮A对照品(自制，经光谱与色谱鉴定，纯度均达到98％以上)。

10批川麦冬药材为市售药材，均来自四川雅安，经天津天士力之骄药业有限公司叶正良研究员鉴定为川麦冬。

[0027] 2.方法与结果
[0028] 2.1色谱条件
[0029] 色谱柱：Waters symeteryC18色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)；流动相：A(0.05％磷酸)-B(乙腈)，梯度洗脱(见表1)，柱温30℃，流速1.0mL·min-1，检测波长296nm，进样量10μL。

色谱图见图1。

[0030] 表1液相梯度洗脱条件
[0032] 2.2 对照品溶液的制备
[0033] 分别精密称取对照品甲基麦冬黄烷酮A、B、6-醛基异麦冬黄烷酮A适量，加甲醇溶解，分别制成甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B，6-醛基异麦冬黄烷酮A三种对照品溶液。

[0034] 2.3 供试品溶液的制备
[0035] 取川麦冬药材粉末约6.0g，精密称定，用甲醇超声提取3次，每次30min，每次加甲醇50mL，合并提取液，过滤，蒸干，加水50mL使溶解，上自制C18小柱富集(80～100目，内径1cm，柱高为2cm，单个柱体积约为6ml，上样前用0.5mol·L-1NaOH溶液处理，再加水平衡)，首先上样(流速0.5ml·min-1)，用4倍柱体积50％甲醇除去杂质(流速0.5ml·min-1)，再用5倍柱体积甲醇洗脱目标物质(流速0.3ml·min-1)，将所得甲醇液蒸干，加甲醇溶解至5mL容量瓶，即得供试品溶液。

[0036] 2.4 精密度试验
[0037] 取同一供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图，结果各共有峰相对峰面积比值的RSD小于2.82％，相对保留时间的RSD小于0.20％，说明仪器的精密度较好。

[0038] 2.5 重复性试验
[0039] 取同一批样品，按“2.2”项下制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别进样，记录色谱图，结果见表2和表3。

结果各共有峰相对峰面积比值的RSD小于3.01％，相对保留时间的RSD小于0.31％，说明实验方法的重现性较好。

[0040] 表2重复性试验相对峰面积(n＝6)
[0041]
[0043]
[0044] 2.6 稳定性试验
[0045] 取同一供试品溶液，分别放置0、2、4、8、12、24小时，按“2.1”项下色谱条件进样测
定，记录色谱图，结果各共有峰相对峰面积比值的RSD小于3.09％，相对保留时间的RSD小于0.33％，表明供试品溶液在24小时内稳定。

[0046] 2.7 结果
[0047] 10批具有代表性的川麦冬药材黄酮类成分的指纹图谱见图2，3。

由表4可见，10
批药材与对照指纹图谱的相似性较好，在0.960～0.995，说明得到的共有模式图具有代表性，可反映川麦冬药材中黄酮类成分的指纹特征。

[0048] 表4 10批川麦冬药材比较的相似度测定结果
[0049]
[0050] 3 讨论
[0051] 3.1 共有指纹峰相对保留时间及相对峰面积比值本实验根据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》[3]，采用HPLC法对川麦冬药材黄酮类成分的指纹图谱进行了研究。

结果表明，所建立的方法操作简单、重复性好，为川麦冬药材的质量评价提供了参考。

川麦冬中甲基麦冬黄烷酮A的含量高于甲基麦冬黄烷酮B[4]，本实验选定甲基麦冬黄烷酮A为参照峰(S)的相对保留时间和峰面积为1，进行了方法学验证，经分析，符合技术要求的有关规定。

[0052] 3.2 从川麦冬中黄酮类物质的指纹图谱相似度计算结果可以看出：各样品生成谱图的对照指纹图谱比较，相似度都大于0.96，说明在该产区中的样品质量基本一致，由10批川麦冬药材生成的对照指纹图谱有13个共有峰，在指纹图谱中可以指认出甲基麦冬黄烷酮A，甲基麦冬黄烷酮B，6-醛基异麦冬黄烷酮A等三种已知物质。

[0053] 3.3 作者对供试品溶液制备方法，检测波长，色谱柱选择，流动相选择都进行了相关考察，最终确定本实验中所选择的甲醇超声，C18小柱富集为最适宜提取方法；通过3D 数据分析确定样品在296nm处有最大吸收；经过与Phenomenex LunaC18(4.6mm×250mm，5μm)和Diamonsil C18(4.6mm×250mm，5μm)进行对比，确定Waters Symmetry C18色谱柱最为适；通过与乙腈-水[5]流动相洗脱效果对比，确定以乙腈-0.05％磷酸水溶液梯度洗脱溶剂系统所得图谱的峰形较好、分离度大，确定为为本试验的流动相系统。

[0054] 3.4 川麦冬药材是天津天士力之骄药业有限公司产品注射用益气复脉(冻干)的重要原料药，企业要求原料药产地固定，质量稳定，本实验经过对10批原料药的指纹图谱研究表明，原料药材质量稳定可控，为产品的质量标准建立提供了有力保障。

[0055] 本发明效果好，操作简单，易于推广。

附图说明
[0056] 图1对照品的色谱图(1.甲基麦冬黄烷酮A，2.甲基麦冬黄烷酮B，3.6-醛基异麦冬黄烷酮A)
[0057] 图2 10批川麦冬药材黄酮类指纹图谱
[0058] 图3 10批川麦冬药材黄酮类指纹图谱共有模式
具体实施方式：
[0059] 以下通过实施例，进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

[0060] 实施例1
[0061] 步骤1、对照品溶液的制备，分别精密称取对照品甲基麦冬黄烷酮A、B、6-醛基异麦冬黄烷酮A适量，加甲醇溶解，分别制成甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B，6-醛基异麦冬黄烷酮A三种对照品溶液。

[0062] 步骤2、供试品溶液的制备，取川麦冬药材粉末约6.0g，精密称定，用甲醇超声提取3次，每次30min，每次加甲醇50mL，合并提取液，过滤，蒸干，加水50mL使溶解，上自制C18小柱富集(80～100目，内径1cm，柱高为2cm，单个柱体积约为6ml，上样前用0.5mol·L-1NaOH溶液处理，再加水平衡)，首先上样(流速0.5ml·min-1)，用4倍柱体积50％甲醇除去杂质(流速0.5ml·min-1)，再用5倍柱体积甲醇洗脱目标物质(流速0.3ml·min-1)，将所得甲醇液蒸干，加甲醇溶解至5mL容量瓶，即得供试品溶液。

[0063] 步骤3、将步骤1和步骤2的溶液分别注入HPLC仪器中，得到色谱图，对图谱的相似性进行比较。

[0064] 步骤4、相似为含量合格。

图1
图2
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图3说 明 书 附 图CN 102759582 A 11。