Piezo1通道激活促进大鼠冠脉平滑肌细胞内钙浓度升高的机制研究

用t 检验，多组间比较采用单因素方差分析（one -way ANOVA ）。

以P <0.05为差异有统计学意义。

结
果
1　细胞免疫荧光染色检测Piezo1蛋白在CASMCs
中的表达
采用原代细胞培养获得CASMCs ，再进行免疫荧光染色，结果显示Piezo1在原代培养CASMCs 的胞质和胞核中均有所表达，Piezo1蛋白在细胞核周围的表达较高，见图1。

2　Piezo1诱导CASMCs 胞内Ca 2+升高与L 型钙通道无关
如图2所示，与DMSO 组相比，Yoda1 （10 µmol/
L ）组Ca 2+荧光强度显著增加（P <0.01）；与Yoda1组相
比，Yoda1+GsMTx4（3 µmol/L ；Piezo1抑制剂）组Ca 2+荧光强度显著降低（P <0.01），而Yoda1+Nif （1 µmol/L ；L 型钙通道抑制剂）组Ca 2+荧光强度没有明显变化。

3　Piezo1诱导CASMCs 胞内Ca 2+释放与IP3R 和RyR 通道无关
无钙台式液中加入Yoda1 （10 µmol/L ），Yoda1组Ca 2+荧光强度与DMSO 组相比显著增加（P <0.01），见图3A 。

分别使用IP3R 抑制剂xestospongin C （0.1 µmol/L ）和RyR 抑制剂dantrolene （10 µmol/L ）抑制
IP3R 和RyR 通道，实验结果表明，与Yoda1组相比，Yoda1+xestospongin C 组和Yoda1+dantrolene 组Ca 2+荧光强度无明显变化，见图3B 。

4　Piezo1诱导CASMCs 内质网和其它细胞器Ca 2+
释放
无钙台式液中使用SERCA2抑制剂TG （2 µmol/L ），结果如图4A~E 所示，第一峰值中TG 引起的Ca 2+荧光升高比值明显高于Yoda1（P <0.01）；第二峰值中，TG -Yoda1组Ca 2+荧光强度与对照组TG -TG 组相比显著增加（P <0.01），Yoda1-TG 组Ca 2+荧光强度与TG -TG 组相比显著增加（P <0.01）。

免疫荧光染色结
果显示，Piezo1与内质网标志物SERCA2、线粒体外膜标志物TOM20和核膜标志物lamin B1共定位程度
较高，见图4F~H 。

5　Piezo1通过诱导CASMCs 内质网Ca 2+耗竭而激
活SOCC 如图5A 所示，与Nif 组相比，Nif+BTP2（10 µmol/
L ；SOCC 抑制剂）组中2 mmol/L CaCl 2诱导的Ca 2+荧光
强度显著降低（P <0.01）。

敲减STIM1后，Western blot 结果显示CASMCs 中STIM1蛋白表达显著下调
（P <0.01），见图5B ；激光共聚焦显微镜检测结果显示si -STIM1组中2 mmol/L CaCl 2诱导的Ca 2+荧光强度显著低于si -NC 组（P <0.01），见图5C 。

敲减Piezo1后，si -Piezo1组蛋白表达显著下调（P <0.05），见图5D ；敲减STIM1后，si -STIM1组蛋白表达显著下调（P <0.01），见图5E ；与si -NC 组相比，si -Piezo1组中
2
Figure 1.　Cell immunofluorescence staining showed that Piezo1 was expressed in CASMCs （scale bar=20 µm ）.
图1　细胞免疫荧光染色结果显示Piezo1在CASMCs
中表达
Figure 2.　The changes of intracellular Ca 2+ concentration mediated
by Piezo1 were not affected by L -type calcium channels.
A ： representative fluorescence intensity of CASMCs stimulated by Yoda1 in Tyrode's solution with 2 mmol/L Ca 2+；
B ： the changes of intracellular Ca 2+ concentra‐
tion in CASMCs stimulated by Yoda1. Mean±SEM. n =111 in DMSO group ； n =154 in Yoda1 group ； n =152
in Yoda1+Nif group ； n =121 in Yoda1+GsMTx4 group. **
P <0.01 vs DMSO group ； ##P <0.01 vs Yoda1 group.
图2　L 型钙通道不参与Piezo1诱导CASMCs 胞内Ca 2+升高
12
µmol/L TG 诱导的Ca 2+荧光强度显著增加（P <0.05），si -STIM1组中2 mmol/L CaCl 2诱导的Ca 2+荧光强度显著降低（P <0.01），见图5F 。

6　抑制SOCC 后Piezo1能诱导CASMCs 胞外Ca 2+
内流
Western blot 结果显示，与阴性对照组相比，si -Piezo1组中Piezo1蛋白表达显著减少（P <0.01），见图6A 。

在无钙台式液中使用1 µmol/L Nif 和10 µmol/L BTP2抑制L 型钙通道和SOCC ，与si -NC 组相比，si -Piezo1组中10 µmol/L Yoda1和2 mmol/L CaCl 2
诱导的Ca 2+荧光强度显著降低（P <0.01），见图6B 。

讨论
多数机械转导过程依赖于机械激活的阳离子通道来使细胞内Ca 2+浓度升高，导致Ca 2+依赖的下游信号通路被激活，进而控制不同的细胞过程和生理反应［6］。

Piezo1作为一种机械敏感性阳离子通道，在心
血管系统中充当压力传感器［6］，并与多种心血管疾病的发生发展有关。

研究表明，Piezo1存在于内皮细胞、VSMCs 和成纤维细胞等多种细胞中，它能将机械信号转化为胞内Ca 2+信号，参与细胞的分化、增殖、迁
移等生物过程［4， 7］。

其中，VSMCs 具备感受机械刺激
和传导的能力，它在维持血管完整性和血管重塑方面发挥着重要作用［8］。

冠状动脉是供应心脏血液的血管，位于冠脉中层VSMCs 的收缩状况是影响冠脉血流量大小的重要因素，Piezo1能将脉管系统中的生物力学转化为CASMCs 内Ca 2+信号，通过Ca 2+信号传
导途径调节血管功能［2， 4］，从而影响心脏的供血。

因
此，选择探索Piezo1在CASMCs 中对Ca 2+稳态调节的机制对心血管系统研究有重要意义。

本研究通过细胞免疫荧光实验证实，Piezo1存在于原代细胞培养的CASMCs 中，在细胞质和细胞核中均有表达，且在细胞核周围表达较高，可能是由于Piezo1广泛表达于
内质网上［9］，
而内质网与核膜相互连接所导致。

Figure 3.　The intracellular calcium release mediated by Piezo1 were not affected by IP3R and RyR calcium channels. A ： representa‐
tive fluorescence intensity of CASMCs stimulated by Yoda1 in Tyrode's solution without Ca 2+ （n =101 in DMSO group ； n =110 in Yoda1 group ）； B ： representative fluorescence intensity of CASMCs stimulated by Yoda1 in Tyrode's solution with‐
out Ca 2+ after treatment with IP3R and RyR inhibitors （n =109 in Yoda1 group ； n =122 in Yoda1+xestospongin C group ； n =
113 in Yoda1+dantrolene group ）. Mean±SEM. **P <0.01 vs DMSO group.
图3　IP3R 和RyR 钙通道不参与Piezo1诱导胞内Ca 2+释放
13
Figure 4.　The intracellular calcium release from endoplasmic reticulum and other organelles in CASMCs was mediated by Piezo1.
A~C ： in Tyrode's solution without Ca 2+， representative fluorescence intensity of CASMCs stimulated by thapsigargin （TG ） and Yoda1 in different ways ； D ： analysis of changes of intracellular Ca 2+ concentration of CASMCs after the addition of the
first drug ； E ： analysis of changes of intracellular Ca 2+ concentration of CASMCs after the addition of the second drug ； F~H ： representative immunofluorescent images of Piezo1 （green ） and specified marker proteins （red ） and merged with DAPI （blue ） in CASMCs （scale bar=20 µm ）. Subcellular organelles were detected with ER marker （SERCA2） or mitochondria marker （TOM20） or nucleus marker （lamin B1）. The regions in white boxes were enlarged. Mean±SEM. n =41 in TG -TG
group ； n =41 in TG -Yoda1 group ； n =52 in Yoda1-TG group. **P <0.01 vs TG -TG group.
图4　Piezo1诱导CASMCs 内质网和其它细胞器Ca 2+释放
14
Figure 5.　Piezo1 activated SOCC by exhausting calcium from endoplasmic reticulum. A ： representative fluorescence intensity of
CASMCs stimulated by Yoda1 and CaCl 2 in Tyrode's solution without Ca 2+ after treatment with Nif and BTP2 （n =122 in Nif group ； n =111 in Nif+BTP2 group ）； B ： the protein expression of STIM1 in the CASMCs after knockdown of STIM1 （n =4）； C ： representative fluorescence intensity of CASMCs stimulated by Yoda1 and CaCl 2 in Tyrode's solution without Ca 2+ af‐
ter treatment with Nif （n =144 in si -NC group ； n =117 in si -STIM1 group ）； D ： the protein expression of Piezo1 in the CASMCs after knockdown of Piezo1 （n =4）； E ： the protein expression of STIM1 in the CASMCs after knockdown of STIM1
（n =5）； F ： representative fluorescence intensity of CASMCs stimulated by TG and CaCl 2 in Tyrode's solution without Ca 2+
after treatment with Nif （n =106 in si -NC group ； n =180 in si -Piezo1 group ； n =99 in si -STIM1 group ）. Mean±SEM. *P <0.05 vs si -NC group ； **P <0.01 vs Nif group ； **P <0.01 vs si -NC group.
图5　Piezo1诱导CASMCs 内质网Ca 2+耗竭从而激活SOCC
15
VSMCs 内Ca 2+浓度变化主要包括细胞膜上Ca 2+
通道诱导细胞外Ca 2+内流和细胞内Ca 2+储存器诱导
内Ca 2+释放。

血管平滑肌功能异常在一定程度上取决于细胞内Ca 2+浓度变化［10］，包括Piezo1在内的各种Ca 2+通道在维持胞内Ca 2+稳态以及调节血管平滑肌兴奋性中发挥着重要作用［11］。

小分子Yoda1是Piezo1的特异性激动剂，可直接与Piezo1结合，通过改变其构象来激活Piezo1。

已有研究证实Yoda1可以诱导CASMCs 中Ca 2+水平升高［5］，但Piezo1参与CASMCs 的Ca 2+浓度调节机制还不太明确。

本研究在含钙台式液中使用Piezo1的选择性抑制剂GsMTx4，结果显示Yoda1诱导Ca 2+内流显著减少，证明CASMCs 中Ca 2+水平升高是由Piezo1导致的。

L 型钙通道属于常见的细胞内外Ca 2+交换通道，本研究实验结果表明Piezo1诱导CASMCs 中Ca 2+水平升高与细胞膜上的L 型钙通道无关。

在无钙台式液中加入Yoda1，CASMCs 的Ca 2+荧光强度显著增加，提示Piezo1可以诱导细胞内Ca 2+库的Ca 2+释放。

使用Ca 2+
通道抑制剂后，实验结果表明Piezo1诱导CASMCs 内Ca 2+释放与内质网上的RyR 和IP3R 无关。

细胞内大部分Ca 2+储存在细胞器中［12］，包括内质
网、线粒体和核膜等。

内质网上的SERCA2可以将胞质中Ca 2+重新摄回内质网中，使用其阻断剂TG 可
以导致内质网中Ca 2+耗竭。

本研究实验结果显示，在无钙台式液中加入TG 引起胞内Ca 2+释放显著高于Yoda1所诱导的Ca 2+释放，而且加入Yoda1之后TG 仍能引起内质网Ca 2+释放，说明Piezo1只能诱导内质网中部分Ca 2+释放；在无钙台式液中使用TG 排空内质网中Ca 2+后，加入Yoda1也能显著引起细胞内Ca 2+释放，说明Piezo1能诱导细胞内除内质网以外其它细胞器Ca 2+释放。

双标免疫荧光染色结果显示，Piezo1与CASMCs 中内质网标志物SERCA2、线粒体外膜标志物TOM20和核膜标志物Lamin B1的共定位程度较高，表明除内质网以外，Piezo1也可能诱导线粒体和核膜Ca 2+释放。

SOCC 在心血管疾病的发生发展中起重要作
用［13］，它主要由STIM1和通道蛋白ORAI1构成。

内
质网中Ca 2+浓度变化信号能被跨膜Ca 2+传感器STIM1所感知，导致位于内质网上的STIM1迁移至细胞膜与ORAI1结合，随后激活SOCC ，进而触发钙库操纵
性Ca 2+内流（store -operated calcium entry ， SOCE ）［14］。

因此，进一步探究Piezo1诱导CASMCs 内质网Ca 2+释放后是否会导致SOCE 发生。

本研究在无钙台式液中抑制L 型钙通道以及使用SOCC 阻断剂BTP2，实验结果表明抑制SOCC 后Yoda1诱导细胞外Ca 2+内流减少；通过敲减STIM1抑制SOCC 的功能，
实验结果
Figure 6.　Piezo1 on cell membrane induced extracellular Ca 2+ influx. A ： the protein expression of Piezo1 in the CASMCs after knock‐
down of Piezo1 （n =4）； B ： representative fluorescence intensity of CASMCs stimulated by Yoda1 and CaCl 2 in Tyrode's so‐lution without Ca 2+ after treatment with Nif and BTP2 （n =195 in si -NC group ； n =250 in si -Piezo1 group ）. Mean±SEM. **P <
0.01 vs si -NC group.
图6　细胞膜上Piezo1诱导细胞外Ca 2+内流
16
再次证明Yoda1可以诱导细胞膜上SOCE发生。

为了探究Piezo1诱导SOCE发生的机制，分别敲减Piezo1和STIM1，并且在实验中抑制了L型钙通道，实验结果表明敲减Piezo1并不影响TG诱导的
SOCE，提示Piezo1是通过诱导内质网Ca2+释放从而激活SOCC，可能不会直接影响SOCC。

有研究报道SERCA2和Piezo1的相互抑制作用［15］，本研究实验结果显示敲减Piezo1后TG诱导的Ca2+释放显著增加，证明了Piezo1对SERCA2具有抑制作用。

敲减Piezo1并抑制细胞膜上的SOCC和L型钙通道，实验结果表明细胞膜上Piezo1通道能诱导胞外Ca2+内流。

研究表明Piezo1介导细胞Ca2+稳态失衡是疾病的重要触发因素：Piezol通过升高［Ca2+］i促进肺动脉高压的进展［9］；高血压下Piezo1激活引起细胞内Ca2+调控异常是血栓形成的关键［16］；Piezo1激活调控Ca2+信号传导加重主动脉瓣钙化病的发展［17］等。

目前大部分研究关注Piezo1的机械转导和Ca2+信号调控作用，而Piezo1促进CASMCs钙浓度增加的机制仍不清楚。

研究正常生理状态下Piezo1对CASMCs钙调节的机制，以及Piezo1与重要Ca2+通道之间的关系，为疾病状态Piezo1导致钙稳态失衡提供了干预策略。

［Ca2+］i增加受离子通道和蛋白的调节，除了常见的Ca2+通道和Ca2+库，细胞中还有其它更复杂的钙调节机制，并且在疾病状态下，Piezo1是如何感知病理变化进行Ca2+调节仍然未知，因此Piezo1在细胞中钙调控机制有待更深入的研究。

综上所述，本研究初步证实Piezo1激动剂在CASMCs中诱导细胞外Ca2+内流主要通过细胞膜上Piezo1通道和间接激活的SOCC，也能触发胞内细胞器Ca2+释放，共同增加CASMCs中［Ca2+］i。

这些结果为Piezo1调控细胞Ca2+平衡提供更多可能性。

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（责任编辑：宋延君，李淑媛）
17
18
［文章编号］1000-4718（2024）01-0018-10
过表达或沉默lncRNA SNHG8的脂肪干细胞对血管内皮细胞功能障碍的影响*
陈自强，胡晓咏，杨朝颖，邹婷，吕忠英，张颖，王欢，李红建△
（新疆医科大学第五临床医学院高血压科，新疆乌鲁木齐 830011）
［摘要］目的：研究过表达或沉默长链非编码RNA（lncRNA）SNHG8的脂肪干细胞（ADSCs）对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）活力、迁移、成管及表达血管活性因子的影响。

方法：（1）流式细胞术及成脂、成骨诱导实验鉴定病态肥胖患者来源的脂肪干细胞（O-ADSCs）；RT-qPCR检测健康人群来源的脂肪干细胞（H-ADSCs）及O-ADSCs内lncRNA SNHG8的表达。

（2）Transwell建立ADSCs与HUVECs间接共培养48 h体系，设置O-ADSCs+HUVECs组、H-ADSCs+HUVECs组和HUVECs组，通过RT-qPCR和Western blot检测HUVECs内血管紧张素II（Ang II）、内皮素1
（ET-1）和内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的mRNA及蛋白表达水平。

（3）进一步构建lncRNA SNHG8过表达或沉默慢病毒并感染O-ADSCs，设置O-ADSCs-OE-SNHG8+HUVECs组、O-ADSCs-OE-NC+HUVECs组、O-ADSCs-sh-SNHG8+ HUVECs组和O-ADSCs-sh-NC+HUVECs组，共培养48 h后，通过CCK-8实验、划痕实验和小管形成实验分别检测HUVECs活力、迁移能力和成管能力；RT-qPCR和Western blot检测HUVECs内Ang II、ET-1和eNOS的mRNA及蛋白表达水平；硝酸还原酶法检测HUVECs内NO含量。

结果：（1）所培养细胞经鉴定符合ADSCs特征；（2）与H-ADSCs 比较，lncRNA SNHG8在O-ADSCs中显著高表达（P<0.01）；（3）与H-ADSCs+HUVECs和HUVECs组相比，O-ADSCs+ HUVECs组中HUVECs内Ang II和ET-1的mRNA及蛋白表达水平上调（P<0.01）；（4）过表达lncRNA SNHG8的O-ADSCs可增强HUVECs的活力、迁移能力及成管能力，上调HUVECs中Ang II和ET-1的mRNA及蛋白表达水平，下调eNOS的mRNA及蛋白表达水平，减少HUVECs内NO含量（P<0.05）；而沉默O-ADSCs中lncRNA SNHG8的表达则呈现相反的结果（P<0.05）。

结论：（1）O-ADSCs可通过旁分泌作用增强内皮细胞活力、迁移能力及成管能力；
（2）过表达lncRNA SNHG8的O-ADSCs促使内皮细胞分泌舒张-收缩因子失衡，导致血管内皮细胞功能障碍。

［关键词］肥胖相关性高血压；长链非编码RNA SNHG8；脂肪干细胞；人脐静脉内皮细胞
［中图分类号］R544.1； R363.2； R34 ［文献标志码］ A doi： 10.3969/j.issn.1000-4718.2024.01.003 Effect of adipose-derived stem cells with overexpression or silencing of lncRNA SNHG8 on vascular endothelial cell dysfunction
CHEN Ziqiang，HU Xiaoyong，YANG Zhaoying，ZOU Ting，LÜ Zhongying，ZHANG Ying，WANG Huan，LI Hongjian△
（Department of Hypertension， Fifth Clinical Medical College， Xinjiang Medical University， Urumqi 830011， China）［ABSTRACT］AIM： To investigate the effects of adipose-derived stem cells （ADSCs） with overexpression or si‐lencing of long noncoding RNA （lncRNA）SNHG8 on the viability， migration， angiogenesis， and the expression of vasoac‐tive factors in human umbilical vein endothelial cells （HUVECs）.METHODS：Identification of ADSCs derived from morbidly obese patients （O-ADSCs） was conducted using flow cytometry and induction of lipogenesis and osteogenesis.
The expression of lncRNA SNHG8 in healthy human ADSCs （H-ADSCs） and O-ADSCs was detected by RT-qPCR. Tran‐swell method was used to establish the indirect co-culture system of ADSCs and HUVECs for 48 h， and the cells were di‐vided into O-ADSCs+HUVECs group， H-ADSCs+HUVECs group， and HUVECs alone group. The mRNA and protein ex‐pression levels of angiotensin II （Ang II）， endothelin-1 （ET-1） and endothelial nitric oxide synthase （eNOS） in HUVECs were detected by RT-qPCR and Western blot.The lncRNA SNHG8overexpression and silencing lentiviruses were con‐［收稿日期］ 2023-09-11 ［修回日期］ 2023-11-16
*［基金项目］国家自然科学基金资助项目（No. 82260089）
△通讯作者E-mail： lhjdoctor_109@
structed and used to infect O-ADSCs. The indirect co-cultured ADSCs and HUVECs were divided into O-ADSCs-OE-SNHG8+ HUVECs group， O-ADSCs-OE-NC+HUVECs group， O-ADSCs-sh-SNHG8+HUVECs group， and O-ADSCs-sh-NC+HUVECs group.After co-culture for 48 h，the viability，migration and tubule formation of HUVECs were detected by CCK-8，scratch and angiogenesis assays， respectively. The mRNA and protein expression levels of Ang II， ET-1 and eNOS in HU‐VECs were detected by RT-qPCR and Western blot， respectively. The nitrate reductase method was used to detect the con‐tent of NO in HUVECs.RESULTS：（1） The cultured cells were identified as ADSCs.（2） Compared with H-ADSCs， ln‐cRNA SNHG8 expression was significantly up-regulated in O-ADSCs （P<0.01）.（3） Compared with H-ADSCs+HUVECs group and HUVECs group， the mRNA and protein expression levels of Ang II and ET-1 in HUVECs in O-ADSCs+HU‐VECs group were up-regulated （P<0.01）.（4） Overexpression of lncRNA SNHG8 in O-ADSCs enhanced the viability， mi‐gration and tube formation ability of HUVECs， up-regulated the mRNA and protein expression levels of Ang II and ET-1，down-regulated the mRNA and protein expression levels of eNOS，and decreased the content of NO in HUVECs （P< 0.05）. However， silencing of lncRNA SNHG8 in O-ADSCs exerted opposite results （P<0.05）.CONCLUSION：（1）The O-ADSCs can promote endothelial cell viability， migration and tubule formation through paracrine effects.（2） The O-ADSCs with overexpression of lncRNA SNHG8 promote the imbalance of diastolic and contractile factors secreted by endo‐thelial cells， and induce the dysfunction of vascular endothelial cells.
［KEY WORDS］obesity-related hypertension； long noncoding RNA SNHG8； adipose-derived stem cells； human umbilical vein endothelial cells
近年来，高血压和肥胖的患病率均呈显著上升趋势，且二者常合并存在，肥胖既增加了高血压患者血压控制的难度，也促进了多重心血管代谢危险因素的聚集，加重了心脑血管损害［1-2］。

血管内皮是血管壁内衬的单层血管内皮细胞，通过释放血管收缩因子，如血管紧张素II（angiotensin II， Ang II）、内皮素1（endothelin-1， ET-1），和舒张因子，如一氧化氮（nitric oxide， NO），来维持血管稳态［3］；其中内皮细胞NO的生成依赖内皮型一氧化氮合酶（endothelial
nitric oxide synthase， eNOS）的活性［4］。

这种血管内皮细胞释放舒张-收缩因子之间的平衡紧密调节血管功能，该平衡的破坏意味着血管内皮功能障碍，这是高血压发生发展的关键因素。

脂肪干细胞（adipose-derived stem cells， ADSCs）是一类多能干细胞，易于从脂肪组织中分离并大量培养［5］。

越来越多证据表明，ADSCs可通过分泌细胞因子和细胞外囊泡等多种方式影响内皮细胞功能，并能根据微环境变化释放不同的旁分泌因子［6-8］。

Dzhoyashvili等［9］的研究表明，与健康人群相比，从冠心病或糖尿病患者中分离的ADSCs分泌更高水平的生长因子。

此外，课题组前期研究显示，相比于健康人群（18.5 kg/m²≤BMI<24 kg/m²）来源ADSCs （healthy human ADSCs，H-ADSCs），病态肥胖患者（BMI≥40 kg/m2）来源ADSCs（morbidly obese patients ADSCs， O-ADSCs）中ET1表达上调，且O-ADSCs条件培养液可诱导内皮细胞收缩因子表达上调［10］；该结果提示O-ADSCs可能通过某种方式调控内皮细胞分泌血管活性因子，而长链非编码RNA（long non-coding RNA， lncRNA）作为一种重要的生物调节因子可能参与到该调控过程中。

lncRNA是一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA，它可以通过调节基因表达、影响mRNA和蛋白稳定性等多种机制发挥功能［11］。

课题组前期通过生物信息学分析O-ADSCs与H-ADSCs间的差异基因表达谱，结果显示lncRNA SNHG8在O-ADSCs中显著升高；前期报道lncRNA SNHG8被确定为急性心肌梗死的关键调节因子［12］；此外，He等［13］研究显示，抑制lncRNA SNHG8的表达有助于维持内皮细胞的稳态；然而，在本研究中富含lncRNA SNHG8的O-AD‐SCs是否影响了内皮细胞功能及其血管活性因子的表达，目前尚不清楚。

因此，本研究将在前期工作基础上，以人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein en‐dothelial cells， HUVECs）及ADSCs为研究对象，建立ADSCs与HUVECs的间接共培养模型，构建lncRNA SNHG8沉默和过表达的慢病毒感染O-ADSCs，分组干预，初步探究ADSCs调控内皮细胞功能并可能诱发肥胖相关性高血压的作用机制，为今后研究其发病机制及创新诊疗手段提供参考。

材料和方法
1　实验细胞
HUVECs（货号：347734）购自北京北纳创联生物技术研究院；O-ADSCs（货号：tings-98890）购自合肥万物生物科技有限公司；H-ADSCs（货号：HUXMD-01001）购自赛业生物科技有限公司。

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2　主要试剂
DMEM 基础培养液和PBS 购自Procell ；胎牛血
清购自Gibco ；青霉素-链霉素混合溶液（100×）购自
上海中乔新舟生物科技有限公司；HyCyte TM 成人脂肪间充质干细胞完全培养液购自海星生物科技有限公
司；SPL Insert™细胞共培养板购自SPL Life Sciences ；NO 比色法检测试剂盒购自Elabscience ；FITC anti -human CD105抗体、PE anti -human CD29抗体、FITC anti -human CD34抗体和FITC anti -human CD45抗体购自BioLegend ；Ang II 抗体购自Affinity ；eNOS 抗体购自Proteintech ；ET -1抗体购自Bioss ；HRP 标记的山
羊抗兔Ⅱ抗购自杭州联科生物技术股份有限公司。

所用引物均由北京擎科生物科技股份有限公司根据设计合成，序列见表1。

3　主要方法
3.1　细胞培养　HUVECs 用DMEM 完全培养液培
养，O -ADSCs 用原代间充质干细胞专用培养液培养，H -ADSCs 用HyCyte TM 成人脂肪间充质干细胞完全培养液培养，以上细胞均在37 ℃、5% CO 2培养箱中培养，细胞生长融合度达80%~90%左右时，用0.25%
胰蛋白酶消化并按1∶2比例进行传代或冻存。

3.2　O -ADSCs 分子表达和分化鉴定
3.2.1　流式细胞术鉴定　取处于对数生长期的O -ADSCs ，消化，离心收集细胞，PBS 洗涤细胞，向流式管中加入100 µL 缓冲液重悬细胞，并分别加入5 µL 的流式抗体（CD105-FITC 、CD45-FITC 、CD34-FITC 和CD29-PE ）混匀，冰上避光孵育20 min ，加入1 mL 缓
冲液洗涤细胞，离心，加入500 µL 缓冲液重悬细胞，流式细胞仪上选择对应通道进行检测，以未染色的细胞作为阴性对照。

3.2.2　成脂和成骨分化实验　为鉴定O -ADSCs 多
向分化潜力，我们取第3代O -ADSCs ，生长融合度在85%左右，按照操作指南分别使用成骨诱导分化培养液和成脂诱导分化培养液培养O -ADSCs ，14 d 后进行油红O 染色评估O -ADSCs 成脂分化情况；21 d
后用茜素红染色，观察O -ADSCs 成骨分化情况［10］。

3.3　细胞间接共培养体系的构建　参考前期报道［14］，构建ADSCs 与HUVECs 间接共培养体系，操作简述如下：取对数生长期的O -ADSCs/H -ADSCs/过表达或沉默lncRNA SNHG8的O -ADSCs （密度：5×107/L ），分别接种于细胞共培养板上室，HUVECs （密度：
1×108/L ）接种于细胞共培养板下室，上室和下室分别加入对应细胞专属培养液，间接共培养48 h 后，取下室HUVECs 进行后续检测。

3.4　制备慢病毒并感染细胞　根据人源lncRNA SNHG8全基因序列，构建lncRNA SNHG8慢病毒过表达和沉默的重组质粒，将慢病毒重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞，筛选并鉴定正确的慢病毒重组质粒，转染293T 细胞并验证，收集转染后72 h 的293T 细胞上清液，超速离心浓缩病毒，将浓缩后的慢病毒重组质粒感染已铺板的O -ADSCs ，48~72 h 后，验证感染效率［15］。

将感染慢病毒后的O -ADSCs 分别命名为：O -ADSCs -OE -NC （过表达对照）、O -ADSCs -OE -SNHG8（过表达SNHG8）、O -ADSCs -sh -NC （沉默对照）和O -ADSCs -sh -SNHG8（沉默SNHG8）。

3.5　实验分组与处理　（1）将处于对数生长期的O -ADSCs 和H -ADSCs 分别与HUVECs 共培养，分为：O -ADSCs+HUVECs 组、H -ADSCs+HUVECs 组和HUVECs 组（空白对照组，共培养板上下室均接种HUVECs ）；
（2）将已感染慢病毒的O -ADSCs 分别与HUVECs 共培养，
分为：O -ADSCs -OE -NC+HUVECs 组、O -ADSCs -OE -SNHG8+HUVECs 组、O -ADSCs -sh -NC+HUVECs 组和O -ADSCs -sh -SNHG8+HUVECs 组。

3.6　CCK -8实验检测HUVECs 活力　取共培养48 h 后的HUVECs ，调整细胞浓度为3×107/L ，每孔100 µL 接种于96孔板，分别在0、24、48和72 h 向各孔加入10 µL 的CCK -8试剂，在37 ℃、5% CO 2培养箱中避光孵育3 h 后，酶标仪检测450 nm 波长处同一时点吸光
度（A ），用测得的A 值进行细胞活力的分析。

3.7　细胞划痕实验检测HUVECs 迁移能力　取共培养48 h 后的HUVECs ，以每孔3×105的密度接种于6孔板，37 ℃，5% CO 2培养箱培养，次日待细胞完全贴壁后，用10 µL 吸头与标记线垂直的方向划线，缓冲液洗去脱落的细胞，加入含有丝裂霉素C 的培养液，继续培养，分别在0、24和48 h 取出细胞，显微镜
表1　RT -qPCR 引物序列
Table 1.　Sequences of the primers for RT -qPCR
Name
lncRNA SNHG8Ang II ET -1eNOS GAPDH
Primer sequence （5'-3'）
Forward ：
TGAGTGCTCATTAGGTCGCC Reverse ： ATGACACAGACGGCTGAACA
Forward ： CTCCAATTCAGGCCAAGACAT Reverse ： TGTCAAGTTTTGCAGCGACTA Forward ： AGAGTGTGTCTACTTCTGCCA Reverse ： CTTCCAAGTCCATACGGAACAA Forward ： TGATGGCGAAGCGAGTGAAG Reverse ： ACTCATCCATACACAGGACCC Forward ：ACAGCCTCAAGATCATCAGC Reverse ： GGTCATGAGTCCTTCCACGAT
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