不同浓度医用臭氧对大鼠星形胶质细胞
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的研究多集中于免疫系统、 心血管系统、神经内分泌系统、呼吸系统 等方面。在疼痛领域，对臭氧的研究都集 中在臭氧的治疗作用，尤其是臭氧溶解椎 间盘髓核作用和消炎止痛作用。
国内外研究进展
在臭氧的毒性方面，本科前期观察了不同浓度的 医用臭氧2ml（30mg/L,50mg/L,80mg/L）经小脑 延髓池注入蛛网膜下腔后，兔行为学未受到明显 影响，而随着医用臭氧浓度的增加，脑脊液的抗 氧化水平逐渐提高，脂质过氧化反应被抑制；当 超出机体抵抗氧化的代偿能力时，抗氧化水平不 再继续提高，脂质过氧化反应短暂增强。这表明 随着剂量的增加医用臭氧鞘内注射有潜在的神经 毒性，研究结果发表在中华麻醉学杂志上，这一 结论为进一步研究医用臭氧的神经毒性提供了初 步的研究结果。
国内外研究进展
但关于臭氧对离体细胞作用的研究，国外 多是集中在臭氧对血液细胞和支气管上皮 细胞的作用上，国内几乎没有在此方面的 研究；而对于离体神经细胞的作用，国内 外都没有相关文献报道。
实验方法和内容
1 星形胶质细胞培养 参照Kim 等人的方法，并略作改动。大致步骤如 下： （1）取1～2天龄的大鼠，经75%乙醇消毒后， 用手术剪将头部剪下，置于无菌培养皿中。 （2）沿纵轴剪开皮肤和颅骨，打开颅腔，取出 脑组织并移入另一含有预冷生理盐水的培养皿中， 去除嗅部，小心分离出两侧的大脑皮质。 注：在取材过程中，为防止污染，所用的消毒手 术器械每一步骤均要加以更换。
研究的意义和主要内容
并且星形胶质细胞参与构成了血脑屏障， 最先接触蛛网膜下腔中的毒性物质，而它 本身也有强大的抗氧化能力，因此星形胶 质细胞在抵抗臭氧的毒性作用中可能发挥 了很大的作用，但广泛查阅未检索到相关 报道。本研究拟从生化改变和形态学两方 面观察不同浓度的医用臭氧对体外培养的 星形胶质细胞的影响，以期为临床工作提 供有意义的参考。
不同浓度医用臭氧对大鼠星形胶 质细胞影响的体外观察
内容
研究的意义和主要内容 国内外研究进展 实验方法和内容 初步计划 经费预算 可行性预测 不利因素 参考文献
研究的意义和主要内容
医用臭氧是臭氧和氧气的混合物，应用于 临床已有100多年的历史。医用臭氧技术在 临床各专业中被广泛关注，并显示了良好 的应用前景。在疼痛临床中，自1988年 Verga将臭氧注入腰大肌及椎旁间隙治疗腰 腿痛，臭氧开始越来越多的用于疼痛治疗。
在本试验中，生物膜尤其是细胞膜中的不饱和脂 肪酸对由臭氧产生的自由基及脂质过氧化物具有 极强的敏感性，过量可导致损伤，而且细胞膜相 对于胞内结构首先接触到内环境中的毒性物质， 因而细胞膜是臭氧攻击的重要靶点，会更多的受 到损伤。细胞膜损伤后会导致通透性增高，细胞 内的成分会比较容易的漏出，LDH也会漏出。细 胞膜损伤越严重，LDH就会漏出越多，因而测定 LDH漏出率可以较特异的反应细胞膜的损伤程度。
实验方法和内容
4 观测指标
若细胞生长状态不良，可见细胞轮廓增强， 细胞折光性变弱，细胞胞质中出现空泡， 脂滴和其他颗粒状物质，细胞之间空隙增 大，细胞形态不规则，甚至失去原有细胞 的特点，产生圆缩脱落，有时细胞表面及 周围出现丝絮状物，细胞死亡会崩解漂浮 在培养液中。在受到外界损伤因素时，细 胞会变得肿胀，突起增多。
4.3.2丙二醛（MDA）
MDA为脂质过氧化物终产物之一,具有细胞毒性。 其含量多少能体现机体的脂质过氧化程度，能够 反映细胞受损的程度。机体通过酶系统与非酶系 统产生氧自由基，自由基能攻击生物膜中的多不 饱和脂肪酸(PUFA)，引发脂质过氧化作用，并因 此形成脂质过氧化物，如:醛基(丙二醛)、酮基、 羟基、氢过氧基或过氧基，以及新的氧自由基等。 脂质过氧化作用不仅把活性氧转化成活性化学剂， 即非自由基性的脂类分解产物，而且通过链式或 链式支链反应，放大活性氧的作用。
说明： 医用臭氧是氧气和臭氧的混合物，臭氧代谢生成氧气。氧气具有生物活性，要全面的观察医用臭氧的生物 效应除了要考虑到臭氧本身的作用外还要考虑到在混合气体中共同存在和经由代谢生成的氧气的作用。
实验方法和内容 3 干预手段
将各组细胞悬液中分别通入纯氧及臭氧（浓度各 为10mg/L，20mg/L，40mg/L，60mg/L， 80mg/L），体积与细胞培养液按体积以1：1计， 在10分钟内通完，分别孵育2h,4h后进行显微镜 下观察及生化检测。 臭氧抽取方法：将臭氧发生器接通电源，通过调 校臭氧浓度及氧气输入量按钮或去所需浓度的医 用臭氧。用一次性注射器接至臭氧输出端口，并 用力下压，臭氧即可依靠自身压力充满注射器， 第一管废弃不用，获得的医用臭氧需立即使用。
4.3.2丙二醛（MDA）
因此，初始的一个活性氧能导致很多脂类分解产 物的形成，这些分解产物中，一些是无害的，另 一些则能引起细胞及功能障碍，甚至死亡。氧自 由基不但通过生物膜中多不饱和脂肪酸(PUFA)的 过氧化引起细胞损伤，而且还能通过脂质过氧化 物的分解产物引起细胞损伤。因而测试MDA的量 常常可反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反 应了机体清除氧自由基的能力，而MDA的高低又 间接反应了机体细胞受自由基攻击的严重程度。
研究的意义和主要内容
对于腰腿痛病人，医用臭氧椎间盘内和椎 旁注射取得了良好的疗效。但是臭氧作为 一种极强的氧化剂，在治疗过程中有可能 会误入或渗入蛛网膜下腔，这是否会对中 枢神经系统造成损伤，或是多大剂量能造 成损伤，已经引起了临床医务工作者的关 注和重视。
研究的意义和主要内容
星形胶质细胞作为中枢神经系统中数量最 多的细胞，它的功能在近年来被人们越来 越多地认识到，甚至有人把星形胶质细胞 和神经元比作中枢神经系统中同等重要的 功能伙伴。
实验方法和内容
1 星形胶质细胞培养
（6） 加入20ml含血清的DMEM完全培养 基,并用吸管柔和的吹打3次。 （7） 静置数分钟待组织下沉后，将细胞 悬液移入另一新的离心管，再加入 15mlDMEM至剩余组织中，稍用力吹打3-4 次后，再让组织下沉，收集细胞悬液。
实验方法和内容
1 星形胶质细胞培养
4.3.1超氧化物歧化酶（SOD）
SOD是氧化-抗氧化系统中重要的酶, 对机体的氧 化与抗氧化平衡起着至关重要的作用。 SOD专一 以超氧阴离子自由基为底物，能清除自由基并终 止其连锁反应，保护细胞免受损伤，同时本身被 消耗。它的含量可反映体内自由基的变化情况， 能够反映抵抗自由基损伤的能力。SOD活力的高 低与衰老、肿瘤、炎症、自身免疫病、血液病、 辐射、药物作用等有着密切的联系，对疾病的病 因学探讨，诊断治疗的观察有着重要意义。
实验方法和内容
2 实验分组
将培养的细胞悬液分为纯氧组（O2组）及各浓度臭氧组（02-O3 10 组，02-O3 20组，02-O3 40组，02-O3 60组，02-O3 80组）， ──────────────────── 分组 平行试验数量 处理 P组 O2 组 5 通入纯氧 O2-O3 10组 5 通入10mg/L臭氧 O2-O3 20组 5 通入20mg/L臭氧 O2-O3 40组 5 通入40mg/L臭氧 O2-O3 60组 5 通入60mg/L臭氧 O2-O3 80组 5 通入80mg/L臭氧 ────────────────────
（8） 重复步骤（7）3-4次，直至组织全部分散 成细胞悬液。将收集的细胞悬液用130um的筛网 过滤。 （9） 过滤后的细胞悬液用50ml的无菌离心管 分装，以1000r/min离心10min。 （10） 尽可能吸去上清液，每管加入10ml DMEM/F12，并柔和吹打3min,让细胞碎片和残 余组织团块下沉后，收集细胞悬液。 （11） 用吸管将细胞悬液转移至细胞培养瓶， 37C，5%CO2孵育40分钟，然后翻转培养瓶， 将细胞悬液转移至另一培养瓶，重复此步骤3~4 次以除去成纤维细胞。
4.3.3乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)
进行离体细胞培养时，如果培养的细胞受 损，LDH也会由细胞漏出至培养液中，因 此通过细胞培养液LDH漏出率的测定可以 较客观地衡量细胞的受损程度。在相同的 条件下细胞培养液LDH的漏出率高的细胞 损伤程度就大。
4.3.3乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)
4.3.3乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)
乳酸脱氢酶是存在于细胞浆内参与糖酵解 最后一步即丙酮酸和乳酸相互转化时的一 种催化酶。LDH在正常人体血浆中含有少 量，均系来源于组织细胞，但在某些疾病 时所累及的细胞会额外释放入血或脑脊液， 故临床上常用血清或脑脊液LDH活性测定 来诊断疾病和进行药物治疗作用的评价。
实验方法和内容
1 星形胶质细胞培养
（12） 取0.1%苔盼蓝与细胞悬液以1：1稀释后， 检查活细胞的数量，将细胞密度稀释成1.5× 106 ／ml , 接种入75cm2 的培养瓶中，5％C02／95 ％ 空气，37℃ ，饱和湿度培养。（培养液组成： DMEM /F12， 添加10％胎牛血清、4mmol／L 一谷氨酰胺、10万U青霉素／10万U链霉素、 15mmol／LHEPES）。 (13) 接种三天后更换培养液，以后每隔两天换 液一次。定期换液观察至培养第8天时细胞已融 合，用0．25% 胰蛋白酶消化处理后传代，两次 传代后约第三周时即可得纯化的星形胶质细胞。
4 观测指标
细胞损伤或死亡时，由于细胞膜的结构或 通透性发生改变，某些染料可穿透细胞膜 进入细胞内，使细胞染色，从而可以根据 细胞是否着色来区分活细胞和死细胞，并 根据活细胞和死细胞的比例即活细胞百分 率来判断细胞受损的程度。
实验方法和内容
4 观测指标
4.3 生化指标 生物膜中的不饱和脂肪酸对自由基及脂 质过氧化产物具有极强的敏感性,过量可导 致损伤。文献表明，脊髓损伤后5～30min 自由基即有升高，2小时后脂质过氧化产物 升高最明显，此后不同性质损伤变化不同。 这表明在脊髓损伤后的急性期改变中氧化抗氧化系统失衡起重要作用。
实验方法和内容
1 星形胶质细胞培养
（3）小心地撕去脑膜，通常脑膜呈粉红色， 若皮质组织已不见该颜色一般说明脑膜已 去除干净。 （4） 将组织切成约0.2×0.2×0.2mm3大 小的碎块后，移入另一含有9ml生理盐水的 培养皿中。 （5） 加入无菌的1ml0.25% 胰蛋白酶液 (预先用5%调节Ph7.3) , 置37℃水浴振荡消 化20-30分钟。
实验方法和内容
4 观测指标
4.2 细胞计数 这是细胞培养中常用的基本技术之一，也 是比较简便实用的观测指标。在细胞培养 研究中，了解细胞的数量和存活情况是很 重要的一个环节，由此可以判断培养条件 和方法是否合适，而且通过细胞数量的变 化可以初步了解所使用的某些因素对细胞 的影响。
实验方法和内容
实验方法和内容
4 观测指标
4.1相差显微镜下星形胶质细胞形态观察 星形胶质细胞形状不规则、呈多角形或星 形，扁平状;胞体较大,直径大约为9-10um, 胞质较丰富、胞突较多较长;细胞核大，呈 圆形或卵圆形， 常偏于胞体一侧,染色质少。 生长良好的细胞，在显微镜下可观察到细 胞透明度大，折光性强，轮廓不清，并可 见细胞部分细微结构。
实验方法和内容
1 星形胶质细胞培养
（14） 星形胶质细胞的鉴定采用胶原纤维酸性蛋 白(GFAP)免疫组化染色： 以无水酒精固定贴壁细胞10 min，PBS漂洗；过 氧化酶阻断剂，室温下孵育10 min；一抗(鼠抗) 一抗GFAP抗体室温下60 min；生物素标记的第 二抗体，室温下孵育10 min；链亲和素一过氧化 物酶溶液，室温下孵育10 min；DAB染色，苏木 精对比染色，中性树胶封固。进行胶质原纤维酸 性蛋白(GFAP)抗血清反应，显示阳性反应的是星 形胶质细胞。 GFAP鉴定星形胶质细胞纯度85%以上可用于实 验。
国内外研究进展
在臭氧的毒性方面，本科前期观察了不同浓度的 医用臭氧2ml（30mg/L,50mg/L,80mg/L）经小脑 延髓池注入蛛网膜下腔后，兔行为学未受到明显 影响，而随着医用臭氧浓度的增加，脑脊液的抗 氧化水平逐渐提高，脂质过氧化反应被抑制；当 超出机体抵抗氧化的代偿能力时，抗氧化水平不 再继续提高，脂质过氧化反应短暂增强。这表明 随着剂量的增加医用臭氧鞘内注射有潜在的神经 毒性，研究结果发表在中华麻醉学杂志上，这一 结论为进一步研究医用臭氧的神经毒性提供了初 步的研究结果。
国内外研究进展
但关于臭氧对离体细胞作用的研究，国外 多是集中在臭氧对血液细胞和支气管上皮 细胞的作用上，国内几乎没有在此方面的 研究；而对于离体神经细胞的作用，国内 外都没有相关文献报道。
实验方法和内容
1 星形胶质细胞培养 参照Kim 等人的方法，并略作改动。大致步骤如 下： （1）取1～2天龄的大鼠，经75%乙醇消毒后， 用手术剪将头部剪下，置于无菌培养皿中。 （2）沿纵轴剪开皮肤和颅骨，打开颅腔，取出 脑组织并移入另一含有预冷生理盐水的培养皿中， 去除嗅部，小心分离出两侧的大脑皮质。 注：在取材过程中，为防止污染，所用的消毒手 术器械每一步骤均要加以更换。
研究的意义和主要内容
并且星形胶质细胞参与构成了血脑屏障， 最先接触蛛网膜下腔中的毒性物质，而它 本身也有强大的抗氧化能力，因此星形胶 质细胞在抵抗臭氧的毒性作用中可能发挥 了很大的作用，但广泛查阅未检索到相关 报道。本研究拟从生化改变和形态学两方 面观察不同浓度的医用臭氧对体外培养的 星形胶质细胞的影响，以期为临床工作提 供有意义的参考。
不同浓度医用臭氧对大鼠星形胶 质细胞影响的体外观察
内容
研究的意义和主要内容 国内外研究进展 实验方法和内容 初步计划 经费预算 可行性预测 不利因素 参考文献
研究的意义和主要内容
医用臭氧是臭氧和氧气的混合物，应用于 临床已有100多年的历史。医用臭氧技术在 临床各专业中被广泛关注，并显示了良好 的应用前景。在疼痛临床中，自1988年 Verga将臭氧注入腰大肌及椎旁间隙治疗腰 腿痛，臭氧开始越来越多的用于疼痛治疗。
在本试验中，生物膜尤其是细胞膜中的不饱和脂 肪酸对由臭氧产生的自由基及脂质过氧化物具有 极强的敏感性，过量可导致损伤，而且细胞膜相 对于胞内结构首先接触到内环境中的毒性物质， 因而细胞膜是臭氧攻击的重要靶点，会更多的受 到损伤。细胞膜损伤后会导致通透性增高，细胞 内的成分会比较容易的漏出，LDH也会漏出。细 胞膜损伤越严重，LDH就会漏出越多，因而测定 LDH漏出率可以较特异的反应细胞膜的损伤程度。
实验方法和内容
4 观测指标
若细胞生长状态不良，可见细胞轮廓增强， 细胞折光性变弱，细胞胞质中出现空泡， 脂滴和其他颗粒状物质，细胞之间空隙增 大，细胞形态不规则，甚至失去原有细胞 的特点，产生圆缩脱落，有时细胞表面及 周围出现丝絮状物，细胞死亡会崩解漂浮 在培养液中。在受到外界损伤因素时，细 胞会变得肿胀，突起增多。
4.3.2丙二醛（MDA）
MDA为脂质过氧化物终产物之一,具有细胞毒性。 其含量多少能体现机体的脂质过氧化程度，能够 反映细胞受损的程度。机体通过酶系统与非酶系 统产生氧自由基，自由基能攻击生物膜中的多不 饱和脂肪酸(PUFA)，引发脂质过氧化作用，并因 此形成脂质过氧化物，如:醛基(丙二醛)、酮基、 羟基、氢过氧基或过氧基，以及新的氧自由基等。 脂质过氧化作用不仅把活性氧转化成活性化学剂， 即非自由基性的脂类分解产物，而且通过链式或 链式支链反应，放大活性氧的作用。
说明： 医用臭氧是氧气和臭氧的混合物，臭氧代谢生成氧气。氧气具有生物活性，要全面的观察医用臭氧的生物 效应除了要考虑到臭氧本身的作用外还要考虑到在混合气体中共同存在和经由代谢生成的氧气的作用。
实验方法和内容 3 干预手段
将各组细胞悬液中分别通入纯氧及臭氧（浓度各 为10mg/L，20mg/L，40mg/L，60mg/L， 80mg/L），体积与细胞培养液按体积以1：1计， 在10分钟内通完，分别孵育2h,4h后进行显微镜 下观察及生化检测。 臭氧抽取方法：将臭氧发生器接通电源，通过调 校臭氧浓度及氧气输入量按钮或去所需浓度的医 用臭氧。用一次性注射器接至臭氧输出端口，并 用力下压，臭氧即可依靠自身压力充满注射器， 第一管废弃不用，获得的医用臭氧需立即使用。
4.3.2丙二醛（MDA）
因此，初始的一个活性氧能导致很多脂类分解产 物的形成，这些分解产物中，一些是无害的，另 一些则能引起细胞及功能障碍，甚至死亡。氧自 由基不但通过生物膜中多不饱和脂肪酸(PUFA)的 过氧化引起细胞损伤，而且还能通过脂质过氧化 物的分解产物引起细胞损伤。因而测试MDA的量 常常可反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反 应了机体清除氧自由基的能力，而MDA的高低又 间接反应了机体细胞受自由基攻击的严重程度。
研究的意义和主要内容
对于腰腿痛病人，医用臭氧椎间盘内和椎 旁注射取得了良好的疗效。但是臭氧作为 一种极强的氧化剂，在治疗过程中有可能 会误入或渗入蛛网膜下腔，这是否会对中 枢神经系统造成损伤，或是多大剂量能造 成损伤，已经引起了临床医务工作者的关 注和重视。
研究的意义和主要内容
星形胶质细胞作为中枢神经系统中数量最 多的细胞，它的功能在近年来被人们越来 越多地认识到，甚至有人把星形胶质细胞 和神经元比作中枢神经系统中同等重要的 功能伙伴。
实验方法和内容
1 星形胶质细胞培养
（6） 加入20ml含血清的DMEM完全培养 基,并用吸管柔和的吹打3次。 （7） 静置数分钟待组织下沉后，将细胞 悬液移入另一新的离心管，再加入 15mlDMEM至剩余组织中，稍用力吹打3-4 次后，再让组织下沉，收集细胞悬液。
实验方法和内容
1 星形胶质细胞培养
4.3.1超氧化物歧化酶（SOD）
SOD是氧化-抗氧化系统中重要的酶, 对机体的氧 化与抗氧化平衡起着至关重要的作用。 SOD专一 以超氧阴离子自由基为底物，能清除自由基并终 止其连锁反应，保护细胞免受损伤，同时本身被 消耗。它的含量可反映体内自由基的变化情况， 能够反映抵抗自由基损伤的能力。SOD活力的高 低与衰老、肿瘤、炎症、自身免疫病、血液病、 辐射、药物作用等有着密切的联系，对疾病的病 因学探讨，诊断治疗的观察有着重要意义。
实验方法和内容
2 实验分组
将培养的细胞悬液分为纯氧组（O2组）及各浓度臭氧组（02-O3 10 组，02-O3 20组，02-O3 40组，02-O3 60组，02-O3 80组）， ──────────────────── 分组 平行试验数量 处理 P组 O2 组 5 通入纯氧 O2-O3 10组 5 通入10mg/L臭氧 O2-O3 20组 5 通入20mg/L臭氧 O2-O3 40组 5 通入40mg/L臭氧 O2-O3 60组 5 通入60mg/L臭氧 O2-O3 80组 5 通入80mg/L臭氧 ────────────────────
（8） 重复步骤（7）3-4次，直至组织全部分散 成细胞悬液。将收集的细胞悬液用130um的筛网 过滤。 （9） 过滤后的细胞悬液用50ml的无菌离心管 分装，以1000r/min离心10min。 （10） 尽可能吸去上清液，每管加入10ml DMEM/F12，并柔和吹打3min,让细胞碎片和残 余组织团块下沉后，收集细胞悬液。 （11） 用吸管将细胞悬液转移至细胞培养瓶， 37C，5%CO2孵育40分钟，然后翻转培养瓶， 将细胞悬液转移至另一培养瓶，重复此步骤3~4 次以除去成纤维细胞。
4.3.3乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)
进行离体细胞培养时，如果培养的细胞受 损，LDH也会由细胞漏出至培养液中，因 此通过细胞培养液LDH漏出率的测定可以 较客观地衡量细胞的受损程度。在相同的 条件下细胞培养液LDH的漏出率高的细胞 损伤程度就大。
4.3.3乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)
4.3.3乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)
乳酸脱氢酶是存在于细胞浆内参与糖酵解 最后一步即丙酮酸和乳酸相互转化时的一 种催化酶。LDH在正常人体血浆中含有少 量，均系来源于组织细胞，但在某些疾病 时所累及的细胞会额外释放入血或脑脊液， 故临床上常用血清或脑脊液LDH活性测定 来诊断疾病和进行药物治疗作用的评价。
实验方法和内容
1 星形胶质细胞培养
（12） 取0.1%苔盼蓝与细胞悬液以1：1稀释后， 检查活细胞的数量，将细胞密度稀释成1.5× 106 ／ml , 接种入75cm2 的培养瓶中，5％C02／95 ％ 空气，37℃ ，饱和湿度培养。（培养液组成： DMEM /F12， 添加10％胎牛血清、4mmol／L 一谷氨酰胺、10万U青霉素／10万U链霉素、 15mmol／LHEPES）。 (13) 接种三天后更换培养液，以后每隔两天换 液一次。定期换液观察至培养第8天时细胞已融 合，用0．25% 胰蛋白酶消化处理后传代，两次 传代后约第三周时即可得纯化的星形胶质细胞。
4 观测指标
细胞损伤或死亡时，由于细胞膜的结构或 通透性发生改变，某些染料可穿透细胞膜 进入细胞内，使细胞染色，从而可以根据 细胞是否着色来区分活细胞和死细胞，并 根据活细胞和死细胞的比例即活细胞百分 率来判断细胞受损的程度。
实验方法和内容
4 观测指标
4.3 生化指标 生物膜中的不饱和脂肪酸对自由基及脂 质过氧化产物具有极强的敏感性,过量可导 致损伤。文献表明，脊髓损伤后5～30min 自由基即有升高，2小时后脂质过氧化产物 升高最明显，此后不同性质损伤变化不同。 这表明在脊髓损伤后的急性期改变中氧化抗氧化系统失衡起重要作用。
实验方法和内容
1 星形胶质细胞培养
（3）小心地撕去脑膜，通常脑膜呈粉红色， 若皮质组织已不见该颜色一般说明脑膜已 去除干净。 （4） 将组织切成约0.2×0.2×0.2mm3大 小的碎块后，移入另一含有9ml生理盐水的 培养皿中。 （5） 加入无菌的1ml0.25% 胰蛋白酶液 (预先用5%调节Ph7.3) , 置37℃水浴振荡消 化20-30分钟。
实验方法和内容
4 观测指标
4.2 细胞计数 这是细胞培养中常用的基本技术之一，也 是比较简便实用的观测指标。在细胞培养 研究中，了解细胞的数量和存活情况是很 重要的一个环节，由此可以判断培养条件 和方法是否合适，而且通过细胞数量的变 化可以初步了解所使用的某些因素对细胞 的影响。
实验方法和内容
实验方法和内容
4 观测指标
4.1相差显微镜下星形胶质细胞形态观察 星形胶质细胞形状不规则、呈多角形或星 形，扁平状;胞体较大,直径大约为9-10um, 胞质较丰富、胞突较多较长;细胞核大，呈 圆形或卵圆形， 常偏于胞体一侧,染色质少。 生长良好的细胞，在显微镜下可观察到细 胞透明度大，折光性强，轮廓不清，并可 见细胞部分细微结构。
实验方法和内容
1 星形胶质细胞培养
（14） 星形胶质细胞的鉴定采用胶原纤维酸性蛋 白(GFAP)免疫组化染色： 以无水酒精固定贴壁细胞10 min，PBS漂洗；过 氧化酶阻断剂，室温下孵育10 min；一抗(鼠抗) 一抗GFAP抗体室温下60 min；生物素标记的第 二抗体，室温下孵育10 min；链亲和素一过氧化 物酶溶液，室温下孵育10 min；DAB染色，苏木 精对比染色，中性树胶封固。进行胶质原纤维酸 性蛋白(GFAP)抗血清反应，显示阳性反应的是星 形胶质细胞。 GFAP鉴定星形胶质细胞纯度85%以上可用于实 验。