基因克隆全过程

Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0（50 次量）
割胶回收操作流程：
全套操作约需 30 分钟，详细说明如下。

1. 使用TBE 缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的 DNA 进行琼脂糖凝胶电泳。

2. 在紫外灯下切出含有目的 DNA 的琼脂糖凝胶，此时应注意尽量切除不含目的 DNA 部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高 DNA 回收率。

注）切胶时请注意不要将 DNA 长时间暴露于紫外灯下，以防止 DNA 损伤。

3. 切碎胶块。

胶块切碎后可以加快操作步骤 6 的胶块融化时间，提高 DNA 的回收率。

4. 称量胶块重量，计算胶块体积。

计算胶块体积时，以 1 mg=1 μl 进行计算。

5. 向胶块中加入胶块融化液 DR-I Buffer，DR-I Buffer 的加量如下表：
均匀混合后 75℃加热融化胶块（低熔点琼脂糖凝胶只需在 45℃加热）。

此时应间断振荡混合，使胶块充分融化（约 6～10 分钟）。

注）胶块一定要充分融化，否则将会严重影响 DNA的回收率。

7. 向上述胶块融化液中加入DR-I Buffer量的1/2体积量的 DR-II Buffer，均匀混合。

当分离小于 400 bp的 DNA 片段时，应在此溶液中再加入终浓度为 20%的异丙醇。

8. 将试剂盒中的 Spin Column 安臵于 Collection Tube 上。

9. 将上述操作 7 的溶液转移至 Spin Column 中，12,000 rpm 离心 1 分钟，弃滤液。

注）如将滤液再加入 Spin Column 中离心一次，可以提高 DNA 的回收率。

10. 将500 μl的Rinse A加入Spin Column中，12,000 rpm 离心 30 秒钟，弃滤液。

11. 将700 μl的Rinse B加入Spin Column中，12,000 rpm 离心 30 秒钟，弃滤液。

注）请确认 Rinse B 中已经加入了指定体积的 100%乙醇。

12. 重复操作步骤 11。

13. 将 Spin Column 安臵于 Collection Tube 上，12,000 rpm 离心 1 分钟。

14. 将 Spin Column 安臵于新的 1.5 ml 的离心管上，在 Spin Column 膜的中央处加入 25 μl 的灭菌蒸馏水或 Elution Buffer，室温静臵 1 分钟。

注）把灭菌蒸馏水或 Elution Buffer 加热至 60℃使用时有利于提高洗脱效率。

15. 12,000 rpm 离心 1 分钟洗脱 DNA。

●注意事项
1. 纯化的 DNA 用于 DNA 序列分析时，最好使用灭菌蒸馏水洗脱 DNA。

2. DNA 需长期保存时，建议在 Elution Buffer 中保存。

DNA 片段的连接
1）在微量离心管中配制下列 DNA 溶液，全量为10 μl。

试剂使用量
Solution I 5 μl
Insert DNA*3 4.5 μl
pMD ® 19-T Vector*1 0.5 μl
3） 16℃反应 3小时。

注）①室温（25℃）也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。

② 5 分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。

质粒 DNA 的转化方法*
1. 把感受态细胞臵于冰中融化。

2. 加入用于转化的 DNA（10ul）,冰中放臵 30 分钟。

3. 42℃热击 45～60 秒。

4. 冰中放臵 5分钟。

5. 加入 37℃预温好的 LB液体培养基（890 ul），使终体积为 1 ml。

6. 37℃振荡培养 1 小时（160～225 rpm）。

7. 取适量涂布琼脂平板培养基。

8. 37℃过夜培养。

LB培养基配制：
LB液体培养基：
Tryptone 1g
yeast extract 0.5g
NaCl 1g
ddH2O 100ul
LB固体培养基：
在液体培养基中再加入1.5g琼脂，倒平板之前要加Amp溶液（50mg/ml）（每100ul培养基加50 ul Amp溶液）
MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0（50 次量）
●操作方法
第一次使用本试剂盒时，请将 RNase A1 混浊液全部加入到SolutionⅠ中，均匀混合后 4℃保存。

实验操作前请将 Solution Ⅲ臵于 4℃（或冰上）预冷后使用。

操作流程见图 1，全套操作约需 1 小时，详细说明如下。

1. 大肠杆菌的培养。

从平板培养基上挑选单菌落接种至 1～4 ml 的含有抗生素的液体培养基中，37℃过夜培养。

注）培养液不宜过量，培养液过量时，会因菌量太大而溶菌不充分，纯化时会影响质粒的纯度。

2. 取 1～4 ml 的过夜培养菌液，12,000 rpm 离心 2 分钟，弃上清。

3. 用 250 μl 的 Solution Ⅰ（含 RNase A1）充分悬浮细菌沉淀。

注）注意不要残留细小菌块，可以使用振荡器（Vortex）等剧烈振荡使菌体充分悬浮。

4. 加入 250 μl 的 Solution Ⅱ轻轻地上下翻转混合 5～6次，使菌体充分裂解，形成透明溶液。

注）此步骤不宜超过 5 分钟。

5. 加入 400 μl的 4℃预冷的Solution Ⅲ，轻轻上下翻转混合 5～6 次，直至形成紧实凝集块，然后室温静臵 2分钟。

6. 室温 12,000 rpm 离心 10 分钟，取上清。

注）此时 4℃离心不利于沉淀沉降。

7. 将试剂盒中的 Spin Column 安臵于 Collection Tube 上。

8. 将上述操作 6 的上清液转移至 Spin Column 中，12,000rpm 离心 1 分钟，弃滤液。

9. 将 500 μl 的 Rinse A 加入 Spin Column 中，12,000 rpm 离心 30 秒钟，弃滤液。

10. 将 700 μl 的 Rinse B 加入 Spin Column 中，12,000 rpm 离心 30 秒钟，弃滤液。

注）请确认 Rinse B 中已经加入了指定体积的 100%乙醇。

11. 重复操作步骤 10。

12. 将 Spin Column 安臵于 Collection Tube 上，12,000 rpm 离心 1 分钟。

13. 将 Spin Column 安臵于新的 1.5 ml 的离心管上，在Spin Column 膜的中央处加入 60 μl 的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静臵 1 分钟。

注）把灭菌蒸馏水或 Elution Buffer 加热至 60℃使用时有利于提高洗脱效率。

14. 12,000 rpm 离心 1 分钟洗脱 DNA。

●注意事项
1. 每次起始的菌液量应控制在 1～4 ml，菌量太大影响溶菌及质粒 DNA 的释放，纯化时会影响质粒 DNA 的纯度。

2. 加入 Solution Ⅱ和 Solution Ⅲ后，不要剧烈混合（Vortex 等），剧烈混合会导致基因组 DNA 的污染。

3. 加入 Solution Ⅲ后，应充分混合使蛋白质、基因组 DNA 等形成白色沉淀，离心后沉降于离心管底部。

若离心后沉淀仍悬浮于溶液中时，请将离心管上下翻转混合数次后高速离心 3～5 分钟。

4. 纯化的质粒 DNA 用于 DNA 序列分析时，最好使用灭菌蒸馏水洗脱质粒 DNA。

5. 质粒 DNA 需长期保存时，建议在 Elution Buffer 中保存。

目的片段的验证：
将提取的质粒进行PCR扩增
反应体系如下：
dd H2O 175ul
10×PCR buffer 25ul
dNTP 20ul
M13 FP 4ul
M13 RP 4ul
Taq酶 2 ul
合计 230 ul
分装10管，每管加23 ul，再分别加2 ul质粒DNA，
PCR反应体系25 ul，反应程序：
95℃ 5min
95℃ 1min
58℃ 40s 35cycles
72℃ 1min
72℃ 5min。