胶乳增强免疫比浊法试剂盒[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910849184.1
(22)申请日 2019.09.09
(71)申请人 元升生物科技（上海）有限公司
地址 201414 上海市奉贤区青村镇城乡路
39号
(72)发明人 陈开华　
(74)专利代理机构 南京申云知识产权代理事务
所(普通合伙) 32274
代理人 王云
(51)Int.Cl.
G01N 33/543(2006.01)
(54)发明名称
胶乳增强免疫比浊法试剂盒
(57)摘要
本发明提供了一种胶乳增强免疫比浊法试
剂盒，其包括第一试剂、第二试剂和校准品；其
中，第一试剂包括缓冲液、稳定剂、促凝剂、表面
活性剂和防腐剂；第二试剂包括包被有抗体的胶
乳颗粒、缓冲液、稳定剂、表面活性剂和防腐剂；
校准品包括抗原、缓冲液、稳定剂、表面活性剂和
防腐剂；本发明提供的试剂盒与目前临床使用试
剂盒相比，特异性、灵敏度和准确性一致，且本发
明的试剂盒适用于一般检测机构都具有的生化
分析仪上使用，检测时间短，操作方便，检测成本
低，无放射性污染，
更适合临床推广使用。

权利要求书1页 说明书4页CN 110687286 A 2020.01.14
C N 110687286
A
1.一种胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其特征在于：其包括第一试剂、第二试剂和校准品；
所述第一试剂包括缓冲液、稳定剂、促凝剂、表面活性剂和防腐剂；
所述第二试剂包括包被有抗体的胶乳颗粒、缓冲液、稳定剂、表面活性剂和防腐剂；所述校准品包括抗原、缓冲液、稳定剂、表面活性剂和防腐剂。

2.根据权利要求1所述的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其特征在于：所述胶乳颗粒为聚苯乙烯胶乳颗粒；
所述聚苯乙烯胶乳颗粒的表面修饰选自硫酸基、磺酸基、羧基、氨基、羟基或氯甲基中的一种以上；
所述胶乳颗粒的直径为60-200nm，浓度为0.08-0.5%。

3.根据权利要求1所述的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其特征在于：所述缓冲液选自Tris缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液或甘氨酸缓冲液中的一种以上。

4.根据权利要求1所述的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其特征在于：所述表面活性剂选自Tween40、TritonX -100或Span80中的一种以上。

5.根据权利要求1所述的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其特征在于：所述稳定剂选自0.1-5%浓度范围的牛血清蛋白、0.1-5%浓度范围的氯化钠、2-50mM的EDTA、0.1-1%浓度范围的吐温-20或1-10%浓度范围的丙三醇中的一种以上。

6.根据权利要求1所述的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其特征在于：所述防腐剂选自叠氮钠、山梨酸钾、苯酚或亚硝酸钠中的一种以上。

7.根据权利要求1所述的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其特征在于：所述促凝剂选自PEG -4000、PEG -6000、PEG -8000、PEG -10000、硫酸葡聚糖钠、葡聚糖T -40或聚凝胺中的一种以上。

8.一种如权利要求1-7任一项所述的胶乳增强免疫比浊试剂盒的制备方法，其特征在于：其包括如下步骤：
（1）分别配制第一试剂和校准品；
（2）将胶乳颗粒与抗体反应，进行抗体包被；将包被后的胶乳经过清洗和封闭步骤后，分散于缓冲液中，制得第二试剂；
（3）将第一试剂、第二试剂和校准品混匀得到胶乳增强免疫比浊法试剂盒。

权　利　要　求　书1/1页CN 110687286 A
胶乳增强免疫比浊法试剂盒
[0001]
技术领域
[0002]本发明属于医学免疫体外诊断技术领域，具体涉及一种胶乳增强免疫比浊法试剂盒。

[0003]
背景技术
[0004]胶乳颗粒增强比浊法（particle-enhanced turbidimetric immunoassay, PETIA）是近年来出现的一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法。

PETIA法大体分为两种，一种是散射比浊检测法，另一种是投射比浊检测法，这两种方法的基本原理非常相似，都是在高分子胶乳微球的表面交联单克隆抗体，当交联有抗体的微球与抗原结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，改变了反应液的散光性能或透光性能。

而且，反应液散光性能或透光性能（即吸光度）的改变与被测抗原的浓度有较强的相关性，在一定范围内可以反映被测抗原的浓度。

PETIA检测方法是在均相反应体系中进行抗原、抗体反应及结果的测定。

抗原、抗体反应后，直接测定反应液的吸光度值，省却了ELISA法反复孵育和洗板等繁琐操作步骤，几分钟就能获得结果，省时省力。

此外，纳米免疫比浊法操作步骤的简化也相应地避免了许多人为操作因素和试剂、环境等外界因素的干扰，稳定性和重复性都较好，能较真实地反映被测物质的含量。

免疫比浊法的灵敏度虽然比ELISA法差一些，但足于检测到健康人血浆中许多标志蛋白的下限值，可完全满足临床检测要求。

[0005]
发明内容
[0006]针对现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种胶乳增强免疫比浊法试剂盒。

[0007]为达到上述目的，本发明的解决方案是：
胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其包括第一试剂、第二试剂和校准品；
所述第一试剂包括缓冲液、稳定剂、促凝剂、表面活性剂和防腐剂；
所述第二试剂包括包被有抗体的胶乳颗粒、缓冲液、稳定剂、表面活性剂和防腐剂；
所述校准品包括抗原、缓冲液、稳定剂、表面活性剂和防腐剂。

[0008]优选地，所述胶乳颗粒为聚苯乙烯胶乳颗粒。

[0009]优选地，所述聚苯乙烯胶乳颗粒的表面修饰选自硫酸基、磺酸基、羧基、氨基、羟基或氯甲基中的一种以上。

[0010]优选地，所述胶乳颗粒的直径为60-200nm，浓度为0.08-0.5%。

[0011]优选地，所述缓冲液选自Tris缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液或甘氨酸缓冲液中的一种以上。

[0012]优选地，所述表面活性剂选自Tween40、TritonX-100或Span80中的一种以上。

[0013]优选地，所述稳定剂选自0.1-5%浓度范围的牛血清白蛋白、0.1-5%浓度范围的氯
化钠、2-50mM的EDTA、0.1-1%浓度范围的吐温-20或1-10%浓度范围的丙三醇中的一种以上。

[0014]优选地，所述防腐剂选自叠氮钠、山梨酸钾、苯酚或亚硝酸钠中的一种以上。

[0015]优选地，所述促凝剂选自PEG-4000、PEG-6000、PEG-8000、PEG-10000、硫酸葡聚糖钠、葡聚糖T-40或聚凝胺中的一种以上。

[0016]一种如上述的胶乳增强免疫比浊试剂盒的制备方法，其包括如下步骤：（1）分别配制第一试剂和校准品；
（2）将胶乳颗粒与抗体反应，进行抗体包被；将包被后的胶乳经过清洗和封闭步骤后，分散于缓冲液中，制得第二试剂。

[0017]（3）将第一试剂、第二试剂和校准品混匀得到胶乳增强免疫比浊法试剂盒。

[0018]由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
本发明提供的试剂盒与目前临床使用试剂盒相比，特异性、灵敏度和准确性一致，且本发明的试剂盒适用于一般检测机构都具有的生化分析仪上使用，检测时间短，操作方便，检测成本低，无放射性污染，更适合临床推广使用。

[0019]
具体实施方式
[0020]以下结合实施例对本发明作进一步的说明。

[0021]实施例1：
第一试剂的制备方法：
将30mM Tris缓冲液、4%聚乙二醇、5%氯化钠、1% Tween40、0.05% TritonX-100、0.2%牛血清白蛋白、50mM EDTA、0.01%叠氮钠和1% PEG-4000依次放入容器内，低速搅拌至全部溶解，调节pH至7.5，再加蒸馏水定容至所需体积，室温混合约20分钟，用0.50μm孔径滤器过滤，完成后2-8℃保存。

[0022]实施例2：
第二试剂的制备方法：
（1）胶乳活化：取适量胶乳，用10倍于胶乳体积的40mM Tris缓冲液（pH7.5）清洗，再用0.04M Tris缓冲液稀释至4倍体积，加入1倍胶乳体积的1% EDC均匀振摇活化，活化时间为30min；
（2）抗体标记：活化好的胶乳中加入抗体（加入比例为每ml胶乳2-6mg抗体）于37℃轻微均匀振摇2小时，再加入二分之一体积的封闭缓冲液于室温均匀摇晃2小时，其中封闭缓冲液主要成分及浓度为：30mM Tris缓冲液、0.2%牛血清白蛋白、1% Tween40和0.5%山梨酸钾；
（3）清洗复溶：标记并封闭好的胶乳于20000rpm的条件下离心20min，弃去上清，再用0.04M Tris缓冲液（pH7.5）清洗复溶，重复3次，最后用胶乳贮存缓冲液稀释复溶至4倍胶乳体积，得到的胶乳原液于2-8℃保存待用。

[0023]实施例3：
校准品的制备：
将20ng/ml 抗原、540mM Tris缓冲液、0.2%牛血清白蛋白、1% Tween40、0.05% TritonX-100和0.01%叠氮钠依次加入容器内，低速搅拌至全部溶解，调节pH至7.5，再加蒸馏水定容至所需体积，室温混合约30分钟，用0.45μm孔径滤器过滤，即制备完成最高浓度校
准品。

系列校准品可由最高浓度校准品通过倍比稀释得到。

制备好的校准品短期放置时于2-8℃保存，长期放置时零下20℃保存。

[0024]实施例4：
胶乳增强免疫比浊法试剂盒的性能检测：
1.检测试剂盒的用法：
以日立7180生化分析仪为例：测定波长570nm，首先加入第一试剂100μL，37℃反应30s 后加入校准品3μL，再反应60s后加入第二试剂60μL，测定反应第10s、60s的吸光度值（A1、A2），计算吸光度差值△A=A2-A1，每管重复测定2次，将各校准品管2次测得的吸光度差值△A为纵坐标，对应的浓度为横坐标，制作“浓度-吸光度差值”校准曲线，取待测样本，同法测定样本的吸光度差值，代入校准曲线，即可计算出待测样本的含量。

[0025] 2.不同的物理交联方式获得的第二试剂差异比较：
比较优化后的物理交联方式和普通的物理交联方式获得的第二试剂检测标准品各点吸光度的差异，吸光度变化大表明所获得的第二试剂能够得到较高的灵敏度检测性能。

如下表1所示：
表1 不同物理交联方式获得的第二试剂吸光度差异
优化的物理交联获得的第二试剂吸光度普通的物理交联获得的第二试剂吸光度
0ng/mL1314
2ng/mL24080
8ng/mL413157
20ng/mL843320
3.低值样本重复性检测：
以生理盐水稀释人血清样本，配制浓度分别为1、2、4、8ng/mL的样本，用第一试剂、第二试剂和校准品组成的试剂盒，与A公司的化学发光试剂盒比较重复性能。

A公司的试剂基本分析原理是，采用双抗体夹心法测定血清中的水平。

用一株单抗包被磁性粒子制成固相抗体，用另一株单抗标记吖啶酯制成标记物。

在反应杯中加入标准品或待测血清及标记物，温育后即形成固相包被抗体-抗原-吖啶酯标记抗体的复合物，充分洗涤后加入氧化剂（H2O2）和NaOH成碱性环境，于3-10分钟内测定其发光强度，根据标准曲线即可算出样品中的含量，样品的发光强度值随浓度的增加而升高。

本发明试剂盒按照所述的方法测定10次，计算不同含量样本检测的变异系数，与A公司化学发光检测试剂盒比较结果如下表所示：表2 本发明试剂盒的低值样本重复性
1ng/mL2ng/mL4ng/mL8ng/mL
1 1.01 2.1
2 3.958.12
2 1.06 2.15 4.018.14
3 1.02 2.11 4.068.05
4 1.12 2.0
5 4.078.03
5 1.01 2.02 4.038.04
6 1.03 2.13 4.058.10
7 1.14 2.25 3.548.08
表3 A公司的化学发光试剂盒的低值样本重复性
1ng/mL2ng/mL4ng/mL8ng/mL
1 1.18 2.1
2 4.038.08
2 1.09 2.09 4.018.07
3 1.02 2.13 4.078.12
4 1.1
5 2.08 4.128.04
5 1.07 2.01 4.088.07
6 1.01 2.0
7 4.018.05
由上表2和表3可以看出，本发明的试剂盒在检测低值样本时重复性与A公司的化学发光检测试剂盒相当，达到了同CLIA技术相同的灵敏度，能满足临床诊断的应用。

[0026] 4.本发明试剂盒的特异性检测：
用生理盐水配制一定浓度的结合型样本和游离型样本，以及可能与检测有干扰的目标物质的浓度，主要包括ACT、AMG，检测结果表明本发明试剂盒能够准确地检测到结合型和游离型，并且不会受到ACT和AMG的干扰，如表4所示。

[0027]表4 本发明试剂盒的检测特异性
配制的目标物本发明检测到的浓度（ng/mL）
游离浓度（4ng/mL） 4.02
游离浓度（40ng/mL）39.84
样品-ACT浓度（4ng/mL） 4.01
样品-ACT浓度（40ng/mL）40.12
样品-AMG浓度（4ng/mL） 4.01
样品-AMG浓度（40ng/mL）40.21
ACT浓度（4ng/mL）0.05
ACT浓度（40ng/mL）0.03
AMG浓度（4ng/mL）0.08
AMG浓度（40ng/mL）0.12
上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。

熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。

因此，本发明不限于上述实施例。

本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。