高效液相色谱法测定复方半胱氨酸注射液中半胱氨酸的含量

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药品质量与检验
高效液相色谱法测定复方半胱氨酸注射液中半胱氨酸的含量 3
靳文仙 1 ,阎 卉 2 ,刘 衡 2 ,王春龙 1, 2 ,赵广荣 1
(1. 天津大学化工学院 ,天津 300072; 2. 天津药物研究院 ,天津 300193)
摘 要 目的 :建立以高效液相色谱法测定复方半胱氨酸注射液中半胱氨酸含量的方法 。方法 :采用迪马公司 C18钻 石色谱柱 (250 mm ×4. 6 mm , 5μm ) ,以磷酸二氢铵溶液 - 甲醇 (95∶5, pH 5. 0)为流动相 ,流速为 1. 0 m l/m in,进样量为 20 μl,检测波长为 220 nm。结果 :半胱氨酸在 240 ～560 μg/m l ( r = 0. 999 6)范围内线性关系良好 ,平均回收率为 99. 32% (RSD = 1. 06% , n = 9)结论 :该方法操作简便快速 ,结果准确 ,可用于复方半胱氨酸注射液中半胱氨酸的含量测定 。
关键词 半胱氨酸 ,高效液相色谱法 ,含量测定 中图分类号 : R927. 2 文献标识码 : A 文章编号 : 100625687 (2008) 0220013203
D eterm ina tion of cyste ine in com plex prescr iption in jection by HPLC J in W enxian1 , Yan Hui2 , L iu Heng2 ,W ang Chunlong1, 2 , Zhao Guangrong1 (1. School of Chem ical Engineering and technology, Tianjin University, Tianjin 300072; 2. Tianjin Institute of Pharmaceutical Re2 search, Tianjin 300193)
参考文献
1 中国药典. 二部. 2005. 485
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.
天津药学 Tianjin Pharmacy 2008年 4月 第 20卷第 2期
ABSTRACT OBJECTIVE To establish a HPLC method for determ ining of cysteine in comp lex p rescrip tion injection. M ETHODS The HPLC was performed on a C18 column ( 250 mm ×4. 6 mm , 5 μm ). Ammonium dihydrogen phosphate - methanol ( 95: 5, pH 5. 0) was used as mobile phase w ith a flow rate of 1. 0 m l/m in, the samp le size was 20 μl and the detection wave was at 220 nm. RESULTS A linear relationship was obtained in the range from 240 ～560 μg /m l ( r = 0. 999 6 ) , the average recovery was 99. 32% (RSD = 1. 06% , n = 9). CONCLUSION The method is convenient, rap id and accuratissime. It can be used for determ ina2 tion of cysteine in comp lex p rescrip tion injection.
97. 54
060722
98. 62
060808
100. 61
3 讨论 311 半胱氨酸的测定 ,国内外药典有采用碘滴定法 , 但由于本复方制剂中另一主药容易被氧化而干扰测 定 ,且该方法操作烦琐 ,准确性低 。而文献报道的柱前 衍生法 、流动注射荧光法 、单扫描极谱法等也存在局限 而无法实现 。经查阅国内外文献 ,作者并未发现采用 高效液相色谱法对其直接测定 。本实验组进行了很好 的尝试 ,结果发现 :半胱氨酸在 220 nm 处有末端吸收 。 312 验发现在 220 nm 波长下 ,空白溶液中的很多辅 料均有吸收 ,特别是本制剂中的抗氧剂 - 亚硫酸氢钠 , 严重干扰了半胱氨酸的准确测定 ,通过调整流动相条 件 ,并加入离子对试剂 (四丁基溴化铵 )后 ,得到了很 好的结果 。经过方法学考察表明 ,本方法快速 ,简便 , 重复性高 ,可用于复方半胱氨酸注射液中半胱氨酸的 含量测定 。
KEY WO RD S cysteine, HPLC, content determ ination
复方半胱氨酸注射液是一种代谢性制剂 ,作为补 充营养给药的同时 ,具有掌握体细胞氧化和还原机能 , 促使肝脏生理机能旺盛 ,减轻心肌细胞在缺血再灌流 中的损伤和增加人体对某些毒素的抵抗力等作用 。半 胱氨酸作为其中的一种主药成分 ,是生命体内重要的 生理活性物质 。目前 ,其定量测定一般是利用其还原 性及其与某些有机试剂发生反应后 ,采用碘量法 [ 1, 2 ] 、 柱前衍生法 [ 3 ] 、旋光度法 [ 4 ] 、流动注射荧光法 [ 5 ] 和单 扫描极谱法 [ 6 ]等进行 ,这些方法存在操作复杂 、灵敏度 不高 、选择性较差或价格昂贵等缺点 。本实验采用高 效液相色谱法对其直接测定 ,具有简单快速 、精密度好 和灵敏度高等优点 。 1 仪器与试药
Model 500 紫外检测器 (美国 SSI/ LabA lliance公 司 ) , Series 1500 泵 (美 国 SSI/ LabA lliance 公 司 ) , SpectraSYSTEM AS1000 自 动 进 样 系 统 (美 国 Ther2 moFinnigan公司 ) ,W aters液相色谱仪 ,含 600泵 - 717
- 自动进样仪 - 996二极管阵列检测器和 510泵 - 486
紫外检测器 - 746数据处理机 。复方半胱氨酸注射液 (规格 : 20 mg /5 m l,由本制剂组研制 ) 。半胱氨酸对照 品 (武汉武大弘元股份有限公司提供 ) ,甲醇 (色谱纯 , 天津市康科德科技有限公司提供 ) ,磷酸二氢铵 (分析 纯 ,天津大学科威公司提供 ) ,四丁基溴化铵 (分析纯 , 天津市光复精细化工研究所提供 ) ,水为注射用水 。 2 方法与结果 211 色谱条件与系统适应 性 色谱 柱 : D iamonsilTM (钻石 ) 5 U C18 (250 mm ×4. 6 mm , 5 μm ) ;流动相 :以 的 0. 02 mol/L 磷酸二氢铵溶液 [含 1. 5%的四丁基溴 化铵 (m / v) ,磷酸调节 pH ( 5. 0 ±0. 05) ] - 甲醇 ( 95 ∶ 5) ;检测波长 220 nm;流速 1. 0 m l/m in;柱温 40 ℃;进 样量 20 μl,理论塔板数按照半胱氨酸计算不应低于 6 000。
供试品溶液的配制方法配制 6份溶液 ,分别进样 ,记录 峰面积 ,其 RSD 值 0. 69%。
表 1 回收率试验结果
样品名称 对照 对照
序号 1 2
半胱氨酸 (mg) 20. 19 20. 01
峰面积 622 234 608 248
回收率 ( % ) -
80%
3
16. 03
483 033
97. 96
在上述色谱条件下 ,以对照品溶液 、供试品溶液和 不含半胱氨酸的空白溶液分别进样测定 ,色谱图见图 1,同时 ,采用二极管阵列检测器对供试品溶液进行检 测 ,在 220 nm 波长下 ,观察半胱氨酸出峰位置是否存
3 收稿日期 : 2007203226 © 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.
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24. 05
733 860
99. 19
2. 8 样品稳定性试验 取供试品溶液 ,分别于 0、2、
4、6和 8 h进样测定 ,记录峰面积 ,结果 6 h后含量下
降了 3. 96% ,且在 8 h内其 RSD 值为 1. 82% ,说明半
胱氨酸 在 本 流 动 相 中 不 稳 定 , 而 4 h 后 含 量 下 降
1. 13% ,其 RSD 值为 0. 98% ,说明本溶液在 4 h内稳定
性良好 ,供试品溶液宜现用现配 。
2. 9 样品的含量测定 精密量取不同批号的注射液
1 m l,按照供试品溶液的制备方法制备 ,测测定结果 ( n = 3)
样品批号
含量 ( % )
060718
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天津药学 Tianjin Pharmacy 2008年 4月 第 20卷第 2期
在杂质干扰 ,结果其纯度角小于阈值 ,表明主峰纯度符 合要求 ,此测定方法专属性好 。
1. 半胱氨酸 A. 对照品溶液 B. 供试品溶液 C. 空白溶液
图 1 复方半胱氨酸注射液的 HPLC 图谱 212 溶液的制备 2. 2. 1 对照品溶液 精密称定半胱氨酸对照品 20 mg,置 50 m l容量瓶中 ,用流动相稀释至刻度 ,摇匀 ,滤 过即得 。 2. 2. 2 供试品溶液 精密量取注射液 1 m l(约相当于 半胱氨酸 4 mg) ,置 10 m l容量瓶中 ,用流动相稀释至 刻度 ,摇匀 ,滤过即得 。 2. 3 测定波长的选择 取对照品溶液 ,以流动相为空 白 ,于 200～400 nm 波长范围内记录紫外光谱 ,结果表 明半胱氨酸在 200 ～220 nm 波长下有吸收 ,但考虑到 波长越小 ,辅料对半胱氨酸的干扰就越大 ,因此选定 220 nm 为最终测定波长 。 2. 4 线性关系 精密配置浓度为 240、320、400、480 和 560μg /m l的半胱氨酸供试品溶液 ,摇匀 ,精密量取 20μl注入液相色谱仪 ,记录色谱图 ,以各主峰峰面积 为纵坐标 ,组分浓度为横坐标 ,进行线性回归 。结果 : 半胱氨酸在 240 ～560 μg /m l浓度范围内线性关系良 好 ,回归方程为 A = 112 082 C - 686. 4 ( r = 0. 999 6) 。 2. 5 回收率试验 根据制剂工艺 ,精密配置相当于半 胱氨酸注射液处方量的 80%、100%和 120%的注射液 各 3份 ,按照供试品溶液的配置方法配置溶液 ,进样并 记录峰面积 ,计算回收率 , 平均回收率 99. 32% , RSD 为 1. 06% ,见表 1。 2. 6 精密度试验 2. 6. 1 日内精密度 取供试品溶液 (批号 060808 ) , 按上述色谱条件连续进样 6 次 ,记录峰面积 ,其 RSD 值为 1. 18%。 2. 6. 2 日间精密度 取供试品溶液 (批号 060808 ) , 按照上述色谱条件 , 连续 5 d 进样 , 记录峰 面积 , 其 RSD 值为 1. 24%。 2. 7 重复性试验 取同一批样品 (批号 060717 ) ,按
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2 USP. 2004. 535 3 AMARNATH K, AMARNATH V , AMARNATH K, et a l. A specific
在上述色谱条件下以对照品溶液供试品溶液和不含半胱氨酸的空白溶液分别进样测定色谱图见图1同时采用二极管阵列检测器对供试品溶液进行检测在220nm波长下观察半胱氨酸出峰位置是否存tm31天津药学tianjinpharmacy2008年4月第20卷第2期3收稿日期
天津药学 Tianjin Pharmacy 2008年 4月 第 20卷第 2期
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16. 12
485 751
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5
16. 23
494 847
99. 11
100%
6
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619 750
100. 93
7
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619 369
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20. 20
617 938
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120%
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730 164
99. 64
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24. 14
734 281
98. 88