人体组织干细胞及其使用[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201880020841.5
(22)申请日 2018.03.27
(30)优先权数据
2017-063171 2017.03.28 JP
(85)PCT国际申请进入国家阶段日
2019.09.24
(86)PCT国际申请的申请数据
PCT/JP2018/012356 2018.03.27
(87)PCT国际申请的公布数据
WO2018/181276 JA 2018.10.04
(71)申请人 学校法人庆应义塾
地址 日本东京
(72)发明人 佐藤俊朗　下川真理子　
(74)专利代理机构 深圳中一联合知识产权代理有限公司 44414代理人 徐飞(51)Int.Cl.C12N 15/09(2006.01)C12N 5/10(2006.01)C12Q 1/02(2006.01)G01N 33/15(2006.01)G01N 33/50(2006.01)
(54)发明名称
人体组织干细胞及其使用
(57)摘要
本发明提供将靶基因导入到干细胞标记物
基因的基因座而得的人体组织干细胞。

权利要求书1页 说明书12页 附图5页CN 110546258 A 2019.12.06
C N 110546258
A
1.人体组织干细胞，其是将靶基因导入到干细胞标记物基因的基因座而得的人体组织干细胞。

2.权利要求1所述的人体组织干细胞，其中，上述干细胞标记物基因为富含亮氨酸重复序列G蛋白偶联受体5即LGR5基因。

3.权利要求2所述的人体组织干细胞，其中，将靶基因导入到Lgr5基因座的第18外显子。

4.权利要求1或2所述的人体组织干细胞，其中，上述靶基因为报道基因。

5.权利要求1～4中任一项所述的人体组织干细胞，其中，上述靶基因为第1报道基因，且进一步导入了由强制表达用启动子驱动的第2报道基因。

6.权利要求1～5中任一项所述的人体组织干细胞，其为来自癌组织的干细胞。

7.将靶基因导入至人体组织干细胞的干细胞标记物基因的基因座的方法，所述方法具备：通过基因组编辑将上述靶基因导入至包含人体组织干细胞的培养类器官的上述干细胞标记物基因的基因座的步骤。

8.权利要求7所述的方法，其中，上述导入靶基因的上述步骤通过电穿孔来进行，且进一步具备在导入上述靶基因之后将上述培养类器官在30℃下培养2天的步骤。

9.权利要求7或8所述的方法，其中，上述干细胞标记物基因的基因座为Lgr5基因座。

10.权利要求9所述的方法，其中，将上述靶基因导入至Lgr5基因座的第18外显子。

11.权利要求7～10中任一项所述的方法，其中，上述靶基因是编码细胞谱系标记诱导蛋白的基因。

12.试验通过权利要求11所述的方法制作的人体组织干细胞是否为干细胞的方法，所述方法具备：通过上述人体组织干细胞的细胞谱系分析检测上述人体组织干细胞的自我复制和分化的步骤，其中，上述人体组织干细胞的自我复制和分化的两者被检测出，则表明上述人体组织干细胞为干细胞。

13.权利要求7～12中任一项所述的方法，其中，上述人体组织干细胞为来自癌组织的干细胞。

14.对癌干细胞有效的抗癌剂的筛选方法，所述筛选方法具备：在受试物质的存在下，培养癌干细胞的步骤，所述癌干细胞导入有由癌干细胞标记物基因的启动子驱动的报道基因；和测定上述报道基因的表达量的步骤，其中，上述报道基因的表达量降低，则表明上述受试物质为对癌干细胞有效的抗癌剂。

15.试验抗癌剂对癌干细胞和癌细胞的有效性的方法，所述方法具备：在上述抗癌剂的存在下，培养癌干细胞的步骤，所述癌干细胞导入有由癌干细胞标记物基因的启动子驱动的第1报道基因和由强制表达用启动子驱动的第2报道基因；和测定上述第1和上述第2报道基因的表达量的步骤，其中，上述第1报道基因的表达量降低，则表明上述抗癌剂为对癌干细胞有效的抗癌剂，上述第2报道基因的表达量降低，则表明上述抗癌剂为对癌干细胞和癌细胞有效的抗癌剂。

权　利　要　求　书1/1页CN 110546258 A
人体组织干细胞及其使用
技术领域
[0001]本发明涉及人体组织干细胞及其使用。

更具体而言，涉及人体组织干细胞、将靶基因导入至人体组织干细胞的干细胞标记物基因的基因座的方法、试验人体组织干细胞是否为干细胞的方法、对癌干细胞有效的抗癌剂的筛选方法、以及试验抗癌剂对癌干细胞和癌细胞的有效性的方法。

本申请基于2017年3月28日在日本申请的特愿2017-063171号要求优先权，并将其内容援引到本文中。

背景技术
[0002]癌干细胞理论是关注于支持肿瘤生长且自我复制的癌细胞亚群的理论(例如参照非专利文献1)。

根据癌干细胞理论，认为从癌发生的早期在肿瘤组织中存在少量的癌干细胞，且通过癌干细胞重复自我复制和分化而形成肿瘤组织。

[0003]现有技术文献
[0004]非专利文献
[0005]非专利文献1：Kreso A.and Dick J.E.,Evolution of the cancer stem cell model.Cell Stem Cell,4(14),275-291,2014。

发明内容
[0006]发明所要解决的课题
[0007]然而，尚未建立对癌干细胞等干细胞进行基因座特异性的基因操作的技术。

因此，特别是通过细胞谱系性地分析人体的组织干细胞，难以确认单个细胞具有自我复制能力和分化能力。

因此，本发明的目的在于，提供对组织干细胞进行基因座特异性的基因操作的技术。

[0008]用于解决课题的手段
[0009]本发明包含以下的方案。

[0010][1]人体组织干细胞，其是将靶基因导入到干细胞标记物基因的基因座而得的人体组织干细胞。

[0011][2][1]所述的人体组织干细胞，其中，上述干细胞标记物基因为富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5(Leucine Rich Repeat Containing GProtein-Coupled Receptor 5,LGR5)基因。

[0012][3][2]所述的人体组织干细胞，其中，将靶基因导入到Lgr5基因座的第18外显子。

[0013][4][1]或[2]所述的人体组织干细胞，其中，上述靶基因为报道基因。

[0014][5][1]～[4]中任一项所述的人体组织干细胞，其中，上述靶基因为第1报道基因，且进一步导入了由强制表达用启动子驱动的第2报道基因。

[0015][6][1]～[5]中任一项所述的人体组织干细胞，其为来自癌组织的干细胞。

[0016][7]将靶基因导入至人体组织干细胞的干细胞标记物基因的基因座的方法，所述方法具备：通过基因组编辑将上述靶基因导入至包含人体组织干细胞的培养类器官的上述
干细胞标记物基因的基因座的步骤。

[0017][8][7]所述的方法，其中，上述导入靶基因的上述步骤通过电穿孔来进行，且进一步具备在导入上述靶基因之后将上述培养类器官在30℃下培养2天的步骤。

[0018][9][7]或[8]所述的方法，其中，上述干细胞标记物基因的基因座为Lgr5基因座。

[0019][10][9]所述的方法，其中，将上述靶基因导入到Lgr5基因座的第18外显子。

[0020][11][7]～[10]中任一项所述的方法，其中，上述靶基因为编码细胞谱系标记诱导蛋白的基因。

[0021][12]试验通过[11]所述的方法制作的人体组织干细胞是否为干细胞的方法，所述方法具备：通过上述人体组织干细胞的细胞谱系分析检测上述人体组织干细胞的自我复制和分化的步骤，其中，上述人体组织干细胞的自我复制和分化的两者被检测出，则表明上述人体组织干细胞为干细胞。

[0022][13][7]～[12]中任一项所述的方法，其中，上述人体组织干细胞为来自癌组织的干细胞。

[0023][14]对癌干细胞有效的抗癌剂的筛选方法，所述筛选方法具备：在受试物质的存在下，培养癌干细胞的步骤，所述癌干细胞导入有由癌干细胞标记物基因的启动子驱动的报道基因；和测定上述报道基因的表达量的步骤，其中，上述报道基因的表达量降低，则表明上述受试物质为对癌干细胞有效的抗癌剂。

[0024][15]试验抗癌剂对癌干细胞和癌细胞的有效性的方法，所述方法具备：在上述抗癌剂的存在下，培养癌干细胞的步骤，所述癌干细胞导入有由癌干细胞标记物基因的启动子驱动的第1报道基因和由强制表达用启动子驱动的第2报道基因；和测定上述第1和上述第2报道基因的表达量的步骤，其中，上述第1报道基因的表达量降低，则表明上述抗癌剂为对癌干细胞有效的抗癌剂，上述第2报道基因的表达量降低，则表明上述抗癌剂为对癌干细胞和癌细胞有效的抗癌剂。

[0025]本发明也可以包含以下的方案。

[0026][P1]组织干细胞，其是将靶基因导入到靶基因座而得的组织干细胞。

[0027][P2][P1]所述的组织干细胞，其中，上述靶基因座为干细胞标记物基因的基因座。

[0028][P3][P2]所述的组织干细胞，其中，上述干细胞标记物基因为富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5(LGR5)基因。

[0029][P4][P3]所述的组织干细胞，其中，上述靶基因为报道基因。

[0030][P5][P1]～[P4]中任一项所述的组织干细胞，其中，上述靶基因为第1报道基因，且进一步导入了由强制表达用启动子驱动的第2报道基因。

[0031][P6][P1]～[P5]中任一项所述的组织干细胞，其为来自癌组织的干细胞。

[0032][P7]将靶基因导入至组织干细胞的靶基因座的方法，所述方法具备：将上述靶基因导入至包含组织干细胞的培养类器官的上述靶基因座的步骤。

[0033][P8][P7]所述的方法，其中，上述导入靶基因的上述步骤通过电穿孔来进行，且进一步具备在导入上述靶基因之后将上述培养类器官在30℃下培养2天的步骤。

[0034][P9][7]或[8]所述的方法，其中，上述靶基因座为干细胞标记物的基因座。

[0035][P10][P9]所述的方法，其中，上述靶基因为编码细胞谱系标记诱导蛋白的基因。

[0036][P11]试验通过[P10]所述的方法制作的组织干细胞是否为干细胞的方法，所述方
法具备：通过上述组织干细胞的细胞谱系分析检测上述组织干细胞的自我复制和分化的步骤，其中，上述组织干细胞的自我复制和分化的两者被检测出，则表明组织干细胞为干细胞。

[0037][P12][P7]～[P11]中任一项所述的方法，其中，上述组织干细胞为来自癌组织的干细胞。

[0038][P13]对癌干细胞有效的抗癌剂的筛选方法，所述筛选方法具备：在受试物质的存在下，培养癌干细胞的步骤，所述癌干细胞导入有由癌干细胞标记物基因的启动子驱动的报道基因；和测定上述报道基因的表达量的步骤，其中，上述报道基因的表达量降低，则表明上述受试物质为对癌干细胞有效的抗癌剂。

[0039][P14]试验抗癌剂对癌干细胞和癌细胞的有效性的方法，所述方法具备：在上述抗癌剂的存在下，培养癌干细胞的步骤，所述癌干细胞导入有由癌干细胞标记物基因的启动子驱动的第1报道基因和由强制表达用启动子驱动的第2报道基因；和测定上述第1和上述第2报道基因的表达量的步骤，其中，上述第1报道基因的表达量降低，则表明上述抗癌剂为对癌干细胞有效的抗癌剂，上述第2报道基因的表达量降低，则表明上述抗癌剂为对癌干细胞和癌细胞有效的抗癌剂。

[0040]发明效果
[0041]根据本发明，可以提供对组织干细胞进行基因座特异性的基因操作的技术。

附图说明
[0042][图1](a)是人LGR5基因座的示意图。

(b)是显示实验例1中制作的靶向构建体的结构的示意图。

(c)是显示实验例1中制作的类器官的LGR5基因座的结构的示意图。

[0043][图2](a)～(c)是实验例2中来自移植到小鼠的类器官的肿瘤组织的组织切片的荧光显微镜照片。

(d)～(f)是观察实验例2中来自建立类器官克隆的原患者的大肠癌组织切片的荧光显微镜照片。

[0044][图3](a)～(c)是说明通过细胞谱系标记物的标记的图。

[0045][图4]是说明实验例4中制作的类器官的LGR5基因座的结构和药物诱导型自杀基因的行为的图。

[0046][图5](a)是显示观察实验例4中对照小鼠的肿瘤组织切片的结果的荧光显微镜照片。

(b)是显示观察实验例4中给予AP20187的小鼠的肿瘤组织切片的结果的荧光显微镜照片。

[0047][图6]是显示经时性地测定实验例4中给予AP20187的小鼠(Dimerizer，二聚体)和对照小鼠(Vehicle，媒介物)的肿瘤尺寸(大小)的结果的图表。

[0048][图7](a)和(b)是显示经时性地测定实验例5中来自类器官的肿瘤组织的尺寸的结果的图表。

[0049][图8]是显示实验例6的代表性结果的类器官的显微镜照片。

具体实施方式
[0050][组织干细胞]
[0051]一个实施方案中，本发明提供将靶基因导入到靶基因座而得的组织干细胞。

[0052]本实施方案中，组织干细胞可为人体细胞，也可为非人动物细胞。

干细胞是具有自我复制能力和分化能力的细胞。

组织干细胞也称为成体干细胞，是存在于组织中的干细胞，与胚胎干细胞(ES细胞)或诱导多能干细胞(iPS细胞)不同。

本说明书中，组织干细胞包含癌干细胞。

另外，本实施方案的组织干细胞包含由于细胞的可塑性而可以去分化成干细胞的细胞。

[0053]以往，难以对组织干细胞进行基因座特异性的基因操作。

相对于此，如后面实施例中所述，发明人明确了：通过对包含组织干细胞的培养类器官进行基因座特异性的基因操作，可以制作将靶基因导入到靶基因座而得的组织干细胞。

[0054]本实施方案的组织干细胞中，靶基因座可为待关注的任意的基因座，例如可为干细胞标记物基因的基因座。

更详细而言，本实施方案的组织干细胞为癌干细胞，靶基因座可为癌干细胞标记物基因的基因座。

作为癌干细胞标记物基因，例如可举出：LGR5、SPARC相关模块化钙结合蛋白2(SPARC Related Modular Calcium Binding 2,SMOC2)、排斥性导向分子家族成员B(Repulsive Guidance Molecule Family Member B,RGMB)、AXIN2、嗅介蛋白4 (Olfactomedin 4,OLFM4)、细胞分裂周期相关蛋白7(Cell Division Cycle Associated 7,CDCA7)、富含亮氨酸重复序列和免疫球蛋白样结构域1(Leucine Rich Repeats And Immunoglobulin Like Domains 1,LRIG1)、环指蛋白43(Ring Finger Protein 43, RNF43)、Achaete-Scute家族BHLH转录因子2(Achaete-ScuteFamily BHLH Transcription Factor 2,ASCL2)等，但不限于这些。

[0055]另外，对癌干细胞来源的癌没有特别限定，例如可为大肠癌、胃癌、胰腺癌的癌干细胞。

发明人确认：这些癌干细胞中，LGR5基因可以用作癌干细胞标记物。

[0056]发明人还明确：通过对来自正常细胞的培养类器官进行基因座特异性的基因操作，可以将靶基因导入至正常细胞的组织干细胞的靶基因座。

[0057]在此，无论是来自正常细胞的培养类器官还是来自癌细胞的培养类器官，均可以通过类器官培养所需的增殖因子的需求性、通过测序确认基因突变、确认染色体异常等来判断。

[0058]另外，本实施方案的干细胞中，靶基因可为任意的基因。

例如靶基因可为报道基因。

另外，报道基因可导入至位于靶基因座的基因的第1外显子以外的区域。

例如，报道基因可导入至LGR5基因的第18外显子。

在此，作为报道基因，没有特别限定，例如可举出：各种的荧光蛋白、酶等。

[0059]在通过基因组编辑等的基因座特异性的基因操作中，往往将靶基因导入至对象基因的第1外显子。

首先，发明人尝试了将报道基因导入至大肠癌干细胞的LGR5基因的第1外显子。

然而，该基因导入并没有成功。

相对于此，如后面实施例中所述，在将报道基因导入到LG5基因的第18外显子时，可以有效地进行所期望的基因导入。

[0060]导入靶基因座的靶基因可不具有启动子序列。

即，靶基因可构成为通过靶基因座的启动子表达。

[0061]例如，通过将内部核糖体进入位点(Internal Rebosomal Entry Site，IRES)、T2A 或P2A等的核糖体跳跃位点(ribosomal skip site)等连接至靶基因的5’侧，靶基因可以由靶基因座的启动子表达。

[0062]本实施方案的组织干细胞可以是：将由该标记物基因的启动子驱动的第1报道基
因导入到癌干细胞标记物基因的基因座、除此之外还导入有由强制表达用启动子驱动的第2报道基因的癌干细胞。

在此，第2报道基因也可以不进行基因座特异性地导入。

另外，作为强制表达用启动子，可以使用通常用于在动物细胞中强制表达基因的启动子，例如可举出：CMV启动子、EF1α启动子等，但不限于这些。

[0063]在此，优选第1报道基因和第2报道基应为彼此可识别的基因。

例如，第1报道基因和第2报道基因可为编码发出彼此波长不同的荧光的荧光蛋白的基因。

[0064]在此，第1报道基因在癌干细胞标记物基因表达时、即细胞维持癌干细胞性时表达。

另一方面，无论癌干细胞标记物基因的表达如何、即无论是在癌干细胞维持癌干细胞性的情况下还是在丧失癌干细胞性的情况下均表达第2报道基因。

因此，第1报道基因的表达则表明存在癌干细胞，第2报道基因的表达则表明存在癌干细胞或存在癌细胞的两者。

在此，癌细胞是指不表达癌干细胞标记物基因的癌细胞。

[0065]如后面实施例中所述，将这样的癌干细胞在受试物质的存在下培养，分别测定第1报道和第2报道基因的表达量，由此可以区分并评价对癌干细胞和癌细胞的影响。

因此，这样的癌干细胞可以用于筛选对癌干细胞有效的抗癌剂等。

[0066][将靶基因导入至组织干细胞的靶基因座的方法]
[0067]一个实施方案中，本发明提供将靶基因导入至组织干细胞的靶基因座的方法，所述方法具备：将上述靶基因导入至包含组织干细胞的培养类器官的上述靶基因座的步骤。

本实施方案的方法可以称为是具备将靶基因导入至构成培养类器官的细胞的靶基因座的步骤的方法。

[0068]本实施方案的方法中，作为干细胞，与上述的干细胞同样，可举出：癌干细胞、成体干细胞等。

[0069]以往，难以对癌干细胞或组织干细胞等的干细胞进行基因操作。

特别是，难以对组织干细胞进行基因座特异性的基因操作。

相对于此，如后面实施例中所述，发明人明确了：通过修饰包含组织干细胞的培养类器官的基因，可以制作导入有靶基因的培养类器官。

[0070]另外，如后面实施例中所述，根据本实施方案的方法，也可以对组织干细胞进行基因座特异性的基因操作。

由此，可以制作将靶基因导入到靶基因座而得的组织干细胞。

[0071]本说明书中，类器官是指通过对细胞进行三维培养而得的器官样组织。

另外，本说明书中，细胞团也包含在类器官中。

作为三维培养的方法，没有特别限定，例如可举出：使用基质胶的方法、使用胶原蛋白的方法、使用层粘连蛋白的方法等。

[0072]本实施方案的方法中，作为培养类器官，如果是包含组织干细胞的类器官则没有特别限定，例如可举出：上皮细胞的类器官、上皮肿瘤细胞的类器官等。

另外，作为上皮细胞，可举出：胃、小肠、大肠、胆管、胰管上皮等的消化道上皮细胞，乳腺、前列腺等的消化道以外的组织的上皮细胞等。

[0073]作为类器官的培养方法，可以使用公知的培养方法。

特别是，在来自癌组织的干细胞的培养方法中，可以选择由癌组织单独优化的培养方法(例如参照Fujii M.,等人, Nature Protocols,10卷,1474-1485,2015；Mihara E.,等人,eLIFE,5卷,E11621,2016；Fujii M.,等人,Cell Stem Cell,18卷,827-838,2016等)。

[0074]本实施方案的方法中，将靶基因导入至培养类器官的步骤可以使用公知的基因导入方法。

特别是，如实施例中所示，优选通过电穿孔来进行。

而且，优选具备在电穿孔后将培
养类器官在30℃下培养2天的步骤。

发明人明确了：通过具备上述的步骤，可以显著提高向类器官的基因导入效率。

[0075][试验组织干细胞是否为干细胞的方法]
[0076]一个实施方案中，本发明提供试验用由对象基因的启动子驱动的细胞谱系标记物标记的组织干细胞是否为干细胞的方法，所述方法具备：通过上述组织干细胞的细胞谱系分析检测上述组织干细胞的自我复制和分化的步骤，其中，上述组织干细胞的自我复制和分化的两者被检测出，则表明组织干细胞为干细胞。

关于细胞谱系标记物如后所述。

[0077]本实施方案的方法也可以称为是证明被认为是组织干细胞的细胞为干细胞的方法。

另外，本实施方案的方法也可以称为是试验对象基因是否为干细胞标记物的方法。

即，本实施方案的方法也可以称为是试验对象基因是否为干细胞标记物的方法，所述方法具备：培养上述用由对象基因的启动子驱动的细胞谱系标记物标记的细胞的步骤；和通过上述细胞的细胞谱系分析检测上述细胞的自我复制和分化的步骤，其中，上述细胞的自我复制和分化的两者被检测出，则表明上述对象基因为干细胞标记物。

[0078]干细胞为具有自我复制能力和分化能力的细胞。

因此，为了证明对象细胞为干细胞，有必要显示单个对象细胞进行自我复制和分化的两者。

或者，为了证明对象基因为干细胞标记物，有必要显示表达对象基因的单个细胞进行自我复制和分化的两者。

[0079]为了显示单个细胞进行自我复制和分化的两者，有必要通过追踪并观察来自单个细胞的细胞的细胞谱系分析，显示来自单个细胞的细胞进行自我复制和分化的两者。

细胞谱系分析是指，无论对象的单个细胞是否重复细胞分裂、或分化而改变性质，均可鉴定并追踪作为对象的单个细胞的后代的细胞的分析方法。

[0080]本说明书中，细胞谱系标记物是指，无论对象的单个细胞是否重复细胞分裂、或分化而改变性质，均可鉴定作为对象的单个细胞的后代的细胞的标记。

[0081]本实施方案的方法中，用由对象基因的启动子驱动的细胞谱系标记物标记表达有对象基因的细胞。

其结果，可以鉴定并观察表达有对象基因的细胞及其后代。

其结果，在确认到所标记的细胞进行自我复制和分化的两者的情况下，可以证明对象基因为干细胞标记物。

细胞谱系标记物优选由对象基因座中的对象基因的启动子驱动。

[0082]对细胞谱系标记物没有特别限定，只要可追踪地标记细胞及其后代即可，例如，可以使用将由对象基因的启动子表达的细胞谱系标记诱导蛋白与另外导入到细胞的细胞谱系标记构建体组合而得者。

在此，细胞谱系标记诱导蛋白作用于细胞谱系标记构建体，而细胞谱系性地标记细胞。

[0083]作为更具体的细胞谱系标记物，例如可举出：利用Cre-LoxP体系、和VCre-VLoxP体系、SCre-SloxP体系等Cre-loxP体系的变体而得者；使用来自芽殖酵母的重组酶的利用Flp-Frt体系而得者；将这些组合而得者等。

[0084]作为细胞谱系标记诱导蛋白，例如可举出：Cre重组酶、VCre重组酶、SCre重组酶、Flp重组酶等。

[0085]作为细胞谱系标记构建体，例如可以使用：可以通过所使用的细胞谱系标记诱导蛋白进行细胞谱系标记而得者。

例如，在细胞谱系标记诱导蛋白为Cre重组酶的情况下，可举出在具有loxP序列且发生基因重组的情况下可检测的构建体。

细胞谱系标记构建体可构成为例如在发生基因重组的情况下表达荧光蛋白。