核酸检测基本知识

核酸检测基本知识
核酸检测的基本知识
核酸是一类由核苷酸或脱氧核苷酸通过3′，5′-磷酸二酯
键连接而成的生物大分子，具有贮存遗传信息和传递遗传信息的重要生物功能。

核酸大分子可分为两类：脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。

DNA是绝大多数生物的遗传
物质，RNA是少数不含DNA的病毒（如HIV病毒，流感病毒，SARS病毒等）的遗传物质。

DNA和RNA都是由核苷酸
头尾相连而形成的，由C、H、O、N、P五种元素组成，但在
碱基种类、五碳糖种类和核苷酸链等方面有所区别。

核酸在蛋白质的复制和合成中起着储存和传递遗传信息的作用，同时在蛋白质的生物合成上也占重要位置，因而在生长、遗传、变异等一系列重大生命现象中起决定性的作用。

核酸检测方法主要通过同时进行靶核酸扩增和可检测信号的生成来检测样品中的靶核酸。

目前主要使用的方法有核酸序列依赖性扩增法和转录介导的扩增技术。

这些方法可应用于临
床微生物学、血液筛选、遗传病诊断和预防、法医学等领域的核酸检测。

TMA技术利用MMLV逆转录酶和T7RNA聚合酶进行扩增，反应在41.5℃下进行，可以在1小时内将RNA模板扩增
约109倍。

与NASBA技术相比，TMA技术略有不同。

LCR是一种探针扩增技术，基于靶分子依赖的寡核苷酸
探针相互连接。

当两段DNA探针与目标序列杂交且中间没有
核苷酸间隔时，它们可以在连接酶作用下连接起来，连接后的新链又可以作为模板引导下一周期的连接产生新的子链。

若连接区段发生核苷酸的碱基突变，则连接反应不能发生，扩增反应终止。

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特
异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性、退火和延伸三个基本反应步骤构成。

模板DNA经加热变性成
单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序
列配对结合。

在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应
原料，靶序列为模板，合成1条新的与模板DNA链互补的半
保留复制链，重复循环变性、退火和延伸三个过程，就可获得更多的“半保留复制链”，这种新链又可成为下次循环的模板。

实时荧光定量PCR技术是一种实时监测PCR反应进程的方法，通过在PCR反应体系中加入荧光基团，实时监测整个PCR进程，并最终通过标准曲线对未知模板进行定量分析。

这种技术可以用于检测HIVRNA，需要先利用逆转录反应将RNA转录为cDNA，继而以cDNA为模板进行PCR扩增。

这样的反应称为RT-PCR。

逆转录合成cDNA是将RNA转录成cDNA的过程。

首先将RNA加入逆转录酶和随机引物反应，生成cDNA。

该步骤需要注意反应条件和逆转录酶的选择，以确保cDNA的质量和数量。

c.PCR扩增反应
PCR扩增反应是将cDNA作为模板，利用引物和酶的作用，在一定的温度和时间下进行反应，扩增目标DNA片段。

PCR扩增反应需要注意反应条件、引物的设计和酶的选择，以确保扩增的特异性和灵敏度。

d.扩增产物定性分和结果判定
扩增产物定性分和结果判定是将PCR扩增产物进行分析和判定。

常用的方法包括凝胶电泳、毛细管电泳、高分辨率熔解曲线分析等。

根据扩增产物的大小、形态和特异性，判断样品是否含有目标序列。

e.完成报告单
根据检测结果，完成报告单，包括样品信息、检测方法、检测结果和结论等内容。

报告单应详细准确，同时注意保护个人隐私和数据安全。