电荷翻转普鲁兰多糖衍生物及其合成方法和用途[发明专利]

(10)申请公布号
(43)申请公布日 (21)申请号 201610052021.7
(22)申请日 2016.01.27
C08B 37/02(2006.01)
A61K 47/36(2006.01)
A61K 9/14(2006.01)
A61K 49/00(2006.01)
A61P 35/00(2006.01)
A61P 1/16(2006.01)
(71)申请人天津医科大学
地址300070 天津市和平区气象台路22号
天津医科大学药学院
(72)发明人王银松 张聪 安彤 王丹
(74)专利代理机构天津市杰盈专利代理有限公
司 12207
代理人
赵尊生
(54)发明名称
电荷翻转普鲁兰多糖衍生物及其合成方法和
用途
(57)摘要
本发明涉及一种电荷翻转普鲁兰多糖衍生物
及其合成方法和用途。

该普鲁兰多糖衍生物是由
普鲁兰多糖骨架、多氨基改性基团与β-羧酸酰
胺改性基团构成，具有显著的肝/肝癌靶向性，能
够对弱酸性的肿瘤微环境与细胞内涵体/溶酶体
产生快速响应，实现由负电性向正电性的翻转。

以
该普鲁兰多糖衍生物修饰聚β-氨基酯（PBAE）/
聚乳酸-聚乙醇酸共聚物（PLGA）复合纳米粒，能
够高效介导纳米粒的肝癌靶向输送，并实现了所
携载药物在肿瘤部位的有效释放，是一种性质优
良的药物、基因及影像对比剂的肝/肝癌靶向载
体材料，具有广阔的应用空间。

(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书2页 说明书8页 附图9页CN 105566511 A 2016.05.11
C N 105566511
A
1.一种电荷翻转普鲁兰多糖衍生物，其特征在于：该衍生物包括普鲁兰多糖骨架、多氨基改性基团与β-羧酸酰胺改性基团：
Ⅰ
其中，所述普鲁兰多糖骨架R1的分子量在20~250 kDa；
多胺基改性基团R2为二亚乙基三胺、精胺、亚精胺或1,4-丁二胺；
β-羧酸酰胺化改性基团R3为顺-4-环己烯-1, 2-二羧酸、琥珀酸、马来酸或邻苯二甲酸。

2.一种权利要求1所述的电荷翻转普鲁兰多糖衍生物的合成方法，其特征在于包括以下步骤：
1) 普鲁兰多糖的氨基化改性：将普鲁兰多糖与N,N'-羰基二咪唑溶于无水二甲基亚砜溶液中，搅拌5~10 min后缓慢滴加至多胺基化合物的二甲基亚砜溶液中，于35℃下持续搅拌15~30 h，然后将反应溶液转移至超纯水中透析处理，除去未反应的小分子物质和二甲基亚砜，透析液冷冻干燥，即得普鲁兰多糖的氨基化改性产物；
2) 电荷翻转普鲁兰多糖衍生物的合成：将上述普鲁兰多糖氨基化改性产物溶解于无水二甲基亚砜中，加入邻二酸酐化合物，室温下搅拌反应18 ~ 36 h，然后将反应产物转移至用三乙胺调节pH值为8.5~9.5的超纯水中透析处理，除去未反应的小分子物质和二甲基亚砜，透析液冷冻干燥，即得电荷翻转的普鲁兰多糖衍生物。

3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于步骤 1) 所述的普鲁兰多糖在二甲基亚砜溶液中的浓度为5~15 mg/ml。

4.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于所述的N,N'-羰基二咪唑与普鲁兰多糖分子中糖单元的摩尔比为1/1~3/1。

5.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于步骤 1) 所述的多胺基化合物是指二亚乙基三胺、精胺、亚精胺或1,4-丁二胺; 步骤 1) 所述的多胺基化合物与普鲁兰多糖分子中糖单元的摩尔比为1/1~3/1。

6.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于步骤 1) 和2) 所述的透析袋截留分子量8~14 kDa。

7.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于步骤 2) 所述的邻二酸酐化合物是指顺-4-环己烯-1,2-二羧酸、琥珀酸酐、马来酸酐或邻苯二甲酸酐；步骤 2) 所述的邻二酸酐化合物与普鲁兰多糖氨基化改性产物中改性基团的摩尔比为0.8/1~1.2/1。

8.一种权利要求1所述的电荷翻转普鲁兰多糖衍生物CAPL修饰的PBAE/PLGA纳米粒子，其特征在于包括以下步骤：
1) PBAE/PLGA复合纳米粒的制备：将50 mg PBAE与10 mg PLGA溶于4 mL二氯甲烷中，加入20 mL超纯水，探头超声处理3 min，制备O/W型初乳；将该初乳倾入至50 mL超纯水中，500 rpm下持续搅拌4 h，离心收集沉淀，并用超纯水洗涤多次，重新分散于水中，冷冻干燥即得PBAE/PLGA纳米粒；
2) CAPL对PBAE/PLGA的表面修饰：将上述PBAE/PLGA纳米粒10 mg分散于弱碱性水性介质（pH=9.0）中，滴加至溶有150 mg CAPL的10 mL超纯水中，500 rpm条件下搅拌孵育 4 h；离心收集，洗涤多次，重新分散于水中，冷冻干燥即得。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于步骤 1) 所述的PBAE分子量为20~50 kDa；PLGA分子量为20~50 kDa；丙交酯/乙交酯比例为50/50。

10.权利要求1所述的电荷翻转普鲁兰多糖衍生物在对抗肿瘤药物、基因与影像对比剂载体系统的肝癌靶向性修饰，以及自身作为肝病/肝癌载体材料中的应用。

电荷翻转普鲁兰多糖衍生物及其合成方法和用途
技术领域
[0001]本发明涉及一种电荷翻转普鲁兰多糖衍生物及其合成方法和用途。

具体说是由多氨基化合物修饰普鲁兰多糖，并通过末端氨基与邻二酸酐反应引入pH-敏感的β-羧酸酰胺键制备而得。

普鲁兰多糖衍生物具有肝/肝癌靶向性，能够对弱酸性的肿瘤微环境与细胞内涵体/溶酶体产生快速响应，实现由负电性向正电性的翻转，可用作药物、基因及影像对比剂的肝/肝癌靶向载体材料，属于生化医药技术领域。

背景技术
[0002]生物医用高分子材料是生物材料的重要组成部分，目前在医药领域已得到广泛应用，如用于疾病的诊断和治疗、损伤组织和器官的替换或修复、 合成或再生等。

根据不同来源，可将其分为天然和人工合成的生物医用高分子材料两大类，而天然生物医用高分子材料来源于自然界，主要包括多糖类与蛋白质类等。

[0003]多糖（polysaccharide）是单糖通过糖苷键组成的直链或支链聚合物，包括纤维素、淀粉、葡聚糖、壳聚糖、普鲁兰多糖、黄原胶、肝素、海藻酸、透明质酸、果胶等。

多糖资源丰富、容易获取，具有较好的生物相容性、可生物降解性和较低的毒性，并且表现出一些特殊的生物活性，如肝素的抗凝血作用，壳聚糖的抗炎抗肿瘤作用，肺炎球菌细胞壁中多糖的抗原作用等。

多糖分子中含有大量的活泼基团（如羟基、氨基与羧基），可以进行化学或生化修饰，得到不同改性基团的衍生物，加之多糖不同的化学组成与分子质量（几万至几千万），形成了其在结构与功能上的多样性。

[0004]普鲁兰多糖（pullulan）是由出芽短梗霉菌中发酵得来，类似葡聚糖、黄原胶等胞外水溶性粘质多糖。

普鲁兰多糖的结构是由α-1,4糖苷键连接的麦芽三糖重复单位经α-1,6糖苷键聚合而成的直链多糖，分子量20~2000 kDa。

它是一种水溶性、无毒、无免疫原性、无致突变、无致癌性的天然多糖，具有良好的成膜、成纤维、易加工等特性。

2006年5月19日，国家卫生部发布了第8号公告，将普鲁兰多糖新增四种食品添加剂产品之一，可在糖果、巧克力包衣、膜片、复合调味科和果蔬汁饮料中用作被膜剂和增稠剂。

目前，普鲁兰多糖在医药领域的应用研究也越来越受到关注。

一些研究发现，普鲁兰多糖具有电中性，能够实现血液中的长循环，并且是肝/肝癌细胞表面去唾液酸糖蛋白受体（asialoglycoprotein receptor, ASGPR）的特异性配基，具有显著的肝/肝癌靶向性。

在之前的研究中，我们制备了系列基于普鲁兰多糖的纳米载体，结合纳米的被动靶向EPR效应（实体瘤的透过性增强及滞留效应）和普鲁兰多糖的主动靶向作用，开发抗肿瘤药物或基因的肝癌靶向递送系统，其中一些表现出良好的肝癌靶向性以及对肝癌的有效抑制作用。

综上所述，普鲁兰多糖是一种性质优良的理想高分子载体材料，在肝病或肝癌治疗领域具有广阔的应用空间。

[0005]当前，越来越多的纳米体系被开发用于药物、基因以及影像对比剂的载体系统。

其中正电性的纳米体系，如阳离子脂质体，壳聚糖、聚乙烯亚胺（PEI）、聚氨基酯（PBAE）、多聚赖氨酸纳米粒以及聚酰胺-胺型树枝状高分子（PAMAM-D）等，能够和负电性的细胞膜相互作用，通过胞吞的方式有效携载基因、蛋白、多肽以及小分子药物进入肿瘤细胞，而后通过“质
子-海绵”效应逃逸内吞体/溶酶体，从而实现药物的胞内释放。

此外，一些具有穿透细胞膜能力的短肽（穿膜肽, cell penetrating peptides, CPP），如Tat、小分子鱼精蛋白等，也带有大量正电荷，通过和细胞膜的相互作用穿透细胞。

然而这些正电性的载体系统存在生物安全性及稳定性等方面的问题（如溶血、易被吞噬系统摄取等），并且缺乏肿瘤靶向性，因此其体内应用受到极大限制。

发明内容
[0006]本发明旨在提供一种电荷翻转普鲁兰多糖衍生物及其合成方法和用途。

具有肝癌靶向性的电荷翻转普鲁兰多糖衍生物，其分子结构中含有多氨基和pH-敏感的β-羧酸酰胺改性基团，在生理条件下荷负电，可对载体表面的正电荷进行有效屏蔽，从而增加正电性载体系统的体内稳定性，并实现载体系统的肝癌靶向输送。

在肿瘤病灶，β-羧酸酰胺键可对肿瘤微环境或内吞体/溶酶体的低pH条件产生快速响应—断键，由负电性翻转为正电性，从而释放电正性的载体系统，促进携载药物被肿瘤细胞的摄取，提高药物疗效，降低药物毒副作用。

此外，该电荷翻转普鲁兰多糖衍生物本身具有显著的肝/肝癌靶向性，可作为肝病或肝癌药物高分子前药的载体材料。

[0007]本发明提供的一种电荷翻转普鲁兰多糖衍生物包括普鲁兰多糖骨架（R1）、多氨基改性基团（R2）与β-羧酸酰胺改性基团（R3）组成：
Ⅰ
其中，所述普鲁兰多糖骨架R1的分子量在20~250 kDa。

[0008]多胺基改性基团R2为二亚乙基三胺、精胺、亚精胺或1,4-丁二胺。

[0009]β-羧酸酰胺化改性基团R3为顺-4-环己烯-1, 2-二羧酸、琥珀酸、马来酸或邻苯二甲酸。

[0010]本发明提供的一种电荷翻转普鲁兰多糖衍生物的合成方法包括以下步骤：
1) 普鲁兰多糖的氨基化改性：将普鲁兰多糖与N,N'-羰基二咪唑溶于无水二甲基亚砜溶液中，搅拌5~10 min后缓慢滴加至多胺基化合物的二甲基亚砜溶液中，于35℃下持续搅拌15~30 h，然后将反应溶液转移至超纯水中透析处理，除去未反应的小分子物质和二甲基亚砜，透析液冷冻干燥，即得普鲁兰多糖的氨基化改性产物。

[0011]2) 电荷翻转普鲁兰多糖衍生物的合成：将上述普鲁兰多糖氨基化改性产物溶解于无水二甲基亚砜中，加入邻二酸酐化合物，室温下搅拌反应18 ~ 36 h，然后将反应产物转移至用三乙胺调节pH值为8.5~9.5的超纯水中透析处理，除去未反应的小分子物质和二甲基亚砜，透析液冷冻干燥，即得电荷翻转的普鲁兰多糖衍生物。

[0012]步骤 1) 中，普鲁兰多糖在二甲基亚砜溶液中的浓度为5~15 mg/ml；N,N'-羰基二咪唑与普鲁兰多糖分子中糖单元的摩尔比为1/1~3/1。

[0013]步骤 1) 中，多胺基化合物是指二亚乙基三胺、精胺、亚精胺或1,4-丁二胺；多胺基化合物与普鲁兰多糖分子中糖单元的摩尔比为1/1~3/1。

[0014]步骤 1) 和2) 中，透析袋截留分子量8~14 kDa。

[0015]步骤 2) 中，邻二酸酐化合物是指顺-4-环己烯-1,2-二羧酸、琥珀酸酐、马来酸酐或邻苯二甲酸酐；邻二酸酐化合物与普鲁兰多糖氨基化改性产物中改性基团的摩尔比为0.8/1~1.2/1。

[0016]上述的电荷翻转普鲁兰多糖衍生物，在对抗肿瘤药物、基因与影像对比剂载体系统的肝癌靶向性修饰，以及自身作为肝病/肝癌载体材料中的应用。

[0017]所述电荷翻转普鲁兰多糖衍生物，具有显著的肝/肝癌靶向性，在pH 6.5的水性介质中，能够通过β-羧酸酰胺键的断裂实现由负电荷向正电荷的翻转。

以电荷翻转普鲁兰多糖衍生物对电正性载体材料进行表面修饰，能有效屏蔽其正电性，提高其在血液循环中的稳定性，降低其毒性，能够靶向输送所携载化疗药物、基因或影像对比剂至肝癌病灶发挥作用。

以电荷翻转普鲁兰多糖衍生物作为载体材料制备的抗肿瘤药物高分子前药，进入肝癌细胞后能够逃逸内吞体/溶酶体，实现有效的胞内释药，从而有利于逆转肝癌的耐药。

[0018]本发明提供了一种电荷翻转普鲁兰多糖衍生物，其显著优点是：
1) 合成工艺简单，条件温和，适用范围广泛。

[0019]2) 生物安全性高，具有良好生物相容性、可生物降解性、无毒性，无免疫原性。

[0020]3) 能够对肿瘤微环境与细胞内吞体/溶酶体的低pH条件产生快速响应，通过β-羧酸酰胺键的断裂实现由负电性向正电性的翻转。

[0021]4) 修饰药物载体系统或自身作为药物的载体材料时稳定性良好。

[0022]5) 具有显著的肝/肝癌靶向性。

以其修饰正电性纳米载体时能有效定位并滞留于肝癌病灶，明显减少正电性纳米载体在肝脏和脾脏中的分布；自身作为载体材料时主要分布于肝脏和肝癌组织。

[0023]6) 以其修饰正电性纳米载体携载抗肿瘤药物时表现出显著的体内外增效作用，并降低了药物的体内毒性。

[0024]因此，本发明在实现肝癌的靶向治疗方面具有广阔的临床应用前景。

附图说明
[0025]图1是实施例一中电荷翻转普鲁兰多糖衍生物的合成路线；
图2是实施例一中普鲁兰多糖（PL）、二亚乙基三胺改性普鲁兰多糖（AMPL）及顺-4-环己烯-1, 2-二羧酸单酰胺化-二亚乙基三胺改性普鲁兰多糖（CAPL）的红外图谱；
图3是实施例一中PL、AMPL与CAPL的核磁共振氢谱；
图4是实施例一中聚β-氨基酯（PBAE）/聚乳酸-聚乙醇酸共聚物（PLGA）复合纳米粒的透射电镜照片（a）和粒径分布图（b）；
图5是实施例一中以电荷翻转普鲁兰多糖衍生物CAPL修饰PBAE/ PLGA复合纳米粒制备而得的CAPL/PBAE/PLGA纳米载体的透射电镜照片（a）和粒径分布图（b）；
图6是实施例一中电荷翻转普鲁兰衍生物pH-响应的电荷翻转示意图；
图7是实施例一中CAPL/PBAE/PLGA纳米载体在不同pH值下的Zeta电位翻转数据；
图8是实施例一中PBAE/PLGA纳米粒与CAPL/PBAE/PLGA纳米载体在小鼠体内的组织分
布图；
图9是实施例一中CAPL/PBAE/PLGA复合纳米载体携载化疗药物紫杉醇（PTX）的透射电镜照片（a）和粒径分布图（b）；
图10是实施例一中CAPL/PBAE/PLGA载药纳米粒中PTX体外释放曲线；
图11是实施例一中CAPL/PBAE/PLGA复合纳米载体携载血管生成抑制剂康普瑞汀（CA4）的透射电镜照片（a）和粒径分布图（b）；
图12是实施例一中CAPL/PBAE/PLGA载药纳米粒中CA4体外释药曲线；
图13是实施例一中CAPL/PBAE/PLGA纳米载体分别携载PTX与CA4联合给药后HepG2荷瘤小鼠照片及其体内肿瘤的生长曲线；
图14是实施例一中CAPL/PBAE/PLGA纳米载体分别携载PTX与CA4联合给药后HepG2荷瘤小鼠的体重变化曲线；
图15是实施例一中CAPL/PBAE/PLGA纳米载体分别携载PTX与CA4联合给药后HepG2荷瘤小鼠体内各组织切片的H&E染色照片；
图16是实施例一中CAPL/PBAE/PLGA纳米载体分别携载PTX与CA4联合给药后HepG2荷瘤小鼠体内肿瘤组织CD31免疫组化照片。

具体实施方式
[0026]下面结合具体实施例，进一步详细阐述本发明。

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件；所用的通用设备、材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0027]实施例1
1．二亚乙基三胺改性普鲁兰多糖（AMPL）的合成（如图1）
将500 mg普鲁兰多糖（分子量200 kDa）与500 mg N,N'-羰基二咪唑（CDI）溶于20 ml无水二甲基亚砜（DMSO）中搅拌5~10 min，而后以1~2 ml/min速度缓慢滴入10 ml溶有2 ml二亚乙基三胺的DMSO溶液中，35℃下搅拌反应20 h。

反应结束后将反应液转移至透析袋（截留分子量12~14 kDa）中，超纯水中透析3 d，透析液冷冻干燥40 h，所得白色絮状产物即为AMPL。

多氨基改性基团的取代度可采用元素分析的方法通过检测氮元素含量进行计算，为15.7%。

[0028]2．顺-4-环己烯-1, 2-二羧酸单酰胺化-二亚乙基三胺改性普鲁兰多糖（CAPL）的合成（如图1）。

[0029]将200 mg上述胺基化普鲁兰多糖衍生物溶于10 ml DMSO中，加入100 mg顺-4-环己烯-1, 2-二酸酐搅拌反应24 h，而后将反应液倾入-4℃冷乙醇溶液中，析出白色絮状沉淀，离心收集，反复多次洗涤后干燥即得CAPL。

[0030]通过红外光谱和核磁共振氢谱对普鲁兰多糖（PL）、AMPL和CAPL进行化学结构表征，红外图谱见图2，核磁共振氢谱见图3。

[0031]3．聚β-氨基酯（PBAE）/聚乳酸-聚乙醇酸共聚物（PLGA）复合纳米粒的制备将实验室合成的PBAE（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004, 101: 16028–16033）（相对聚苯乙烯的分子质量为28,000）50 mg与PLGA（平均分子质量20 kDa，丙交酯/乙交酯50/ 50）10 mg（质量比5/1）溶于4 mL二氯甲烷中，加入20 mL超纯水，探头超声处理3 min，制备
O/W型初乳。

将该初乳倾入至50 mL超纯水中，500 rpm下持续搅拌4 h，离心收集沉淀，并用超纯水洗涤多次，重新分散于水中，冷冻干燥即得PBAE/PLGA纳米粒。

采用透射电镜（TEM）观察PBAE/PLGA纳米粒呈规则球状形态，结构致密；采用动态激光散射法检测PBAE/PLGA纳米粒的粒径为120.0 nm；Zeta电位为47.5 mV。

TEM照片与粒径分布图如图4。

[0032]4．普鲁兰多糖衍生物CAPL对PBAE/PLGA纳米粒的表面修饰
将上述PBAE/PLGA纳米粒10 mg分散于弱碱性水性介质（pH≈9.0）中，滴加至溶有150 mg CAPL的10 mL超纯水中，500 rpm条件下搅拌孵育 4 h；离心收集沉淀，并洗涤多次，重新分散于水中，冷冻干燥即得CAPL/PBAE/PLGA纳米粒。

采用TEM观察CAPL/PBAE/PLGA纳米粒呈规则球状形态，具有经典的“核-壳”结构；采用动态激光散射法检测CAPL/PBAE/PLGA纳米粒的粒径为178.1 nm；Zeta电位为‒17.3 mV。

TEM照片与粒径分布图如图5。

[0033]5．pH-响应电荷翻转能力的考察
CAPL分子中的β-羧酸酰胺键能够对弱酸性条件产生响应，断键实现末端羧基向氨基的转变（示意图如图6）；又由于同种电荷间的排斥作用，断键后的CAPL从表面脱落，释放出正电性的PBAE/PLGA纳米核。

为了考察这种pH-响应的电荷翻转能力，将上述CAPL/PBAE/PLGA 纳米粒冻干产物3 mg分别分散于pH分别为6.5、7.0与7.4的磷酸盐缓冲液5 mL中，100 rpm 下持续搅拌；在预定的时间点（0、5、15、30、60、120 min），将分散液离心，收集沉淀，并用去离子水水洗2次后重新分散，然后检测分散体系的Zeta电位，考察pH-响应的电荷翻转能力。

结果如图7，可见CAPL/PBAE/PLGA在pH 6.5介质中，2 h内即实现了Zeta电位由‒17.3 mV向9.8 mV的转变，证明其具有显著的pH-响应电荷翻转能力。

[0034]6．CAPL/PBAE/PLGA在小鼠体内的组织分布考察
以近红外荧光探针Cy5.5对纳米载体进行标记，方法如下：取Cy5.5溶于DMSO 20 μL中，浓度为1 mg/mL, 然后将10 μL Cy5.5、15 mg PBAE和3 mg PLGA溶解于1 mL二氯甲烷中，加入5 mLPBS，探头超声3 min后分散于10 mL PBS中，500 rpm搅拌4 h，过葡聚糖凝胶色谱柱2次，除去游离的Cy5.5后即得到荧光标记的PBAE/PLGA/Cy5.5纳米粒。

将2 mL PBAE/PLGA/ Cy5.5纳米分散液滴加至溶有5 mg CAPL的2 mL PBS中，500 rpm搅拌4 h，即得到荧光标记的CAPLPBAE/PLGA/Cy5.5纳米粒。

[0035]HepG2裸鼠肝癌模型：对数生长期的HepG2细胞经0.25%胰酶消化，1000 rpm转速常温离心10 min，弃去上清液，以PBS 离心洗涤2 次；计算细胞数，调整细胞浓度至5×107/ mL，将细胞悬浮于无血清DMEM培养液中，制成细胞悬液。

然后用注射器抽取细胞悬液200 μL，接种于裸鼠皮下，为第一代荷瘤裸鼠。

当经细胞接种成功的移植瘤的直径长至约1 cm，拉颈处死传代鼠，在无菌条件下，解剖切取适当大小的肿瘤组织，立即放入无血清DMEM 中，剪碎肿瘤组织，去除脂肪和坏死肿瘤组织，并用无血清DMEM 洗涤，将其剪成1 mm3大小的瘤组织块待接种用。

将要接种的裸鼠左侧鼠鼷部皮肤进行碘酊和75%乙醇消毒，然后用消毒后的剪刀剪一小口，并用无菌镊夹取上述肿瘤组织块，沿切口接种于皮下，最后用75%乙醇消毒皮肤切口。

对第2代的荷瘤小鼠用于以下实验。

[0036]组织分布观察：将荷瘤裸鼠随机分为3组，分别接收游离Cy5.5、PBAE/PLGA/Cy5.5与CAPL/PBAE/PLGA/Cy5.5纳米粒尾静脉注射给药，Cy5.5给药剂量均为0.4 μg/kg，同时以正常裸鼠注射生理盐水作为对照。

在给药后6与24 h运用小动物活体成像系统观察Cy5.5在小鼠各组织脏器中的分布，成像照片见图8。

结果表明：游离Cy5.5给药组，6 h时荧光信号较
少分布于肝脏与肾脏，24 h后各组织脏器中的荧光信号几乎完全消失，表明游离Cy5.5在小鼠体内能够较快地代谢消除，没有组织与肿瘤靶向性；PBAE/PLGA/Cy5.5纳米给药组中，6 h 时Cy5.5的荧光信号在各个脏器中均有分布，说明通过PBAE/PLGA纳米载体的携载，显著延长了Cy5.5在体内的循环时间，24 h后荧光信号集中分布于肝、肺与脾脏中，而在肿瘤与肾脏中仅有少量分布，说明PBAE/PLGA纳米粒没有肿瘤靶向性；CAPL/PBAE/PLGA/Cy5.5纳米给药组中，6 h时Cy5.5开始滞留于肿瘤病灶， 24 h后主要富集于肿瘤和肝脏，并且肿瘤中的富集量显著强于肝脏，充分说明通过电荷翻转普鲁兰多糖衍生物CAPL的表面修饰，显著增强了PBAE/PLGA纳米载体的肝癌靶向性。

[0037]7．载紫杉醇（PTX）的CAPL/PBAE/PLGA纳米粒的制备与表征
将质量比9/25/5的PTX与PBAE、PLGA充分溶解于二氯甲烷中，然后按照实施例1中第3、4项下的方法，制备携载PTX的CAPL/PBAE/PLGA纳米粒，并对其形态结构、粒径及其分布进行表征（图9）。

CAPL/PBAE/PLGA/PTX载药纳米粒具有规则球状形态和“核-壳”结构，粒径为209.4 nm，分布均匀。

PTX的载药量采用紫外分光光度法于240 nm波长处进行检测，为8.2%。

[0038]8．PTX体外药物释放实验
将上述CAPL/PBAE/PLGA/PTX载药纳米粒冻干产物5 mg分散于pH 7.4磷酸盐缓冲（PBS）溶液5 mL中，然后转移至截留分子量为10~14 kDa的透析袋中，置于50 mL pH 5.5、6.5、7.0和7.4的PBS溶液，37℃下避光振荡（100 rpm），规定时间点将整个释放介质用新鲜介质置换，超高效液相色谱进行检测（检测波长为240 nm）。

药物释放百分率按照以下公式进行计算：释放百分率 =（药物释放量/药物总量）×100%。

PTX释放曲线见图10，呈现显著的pH敏感性，说明该载药纳米体系能够对弱酸性肿瘤微环境（pH≈6.5）与内涵体/溶酶体（pH≈5.5）产生逐级响应，实现可控的药物释放。

[0039]9．载康普瑞汀（CA4）的CAPL/PBAE/PLGA纳米粒的制备与表征
将质量比9/25/5的CA4与PBAE、PLGA充分溶解于二氯甲烷中，然后按照实施例1中第3、4项下的方法，制备携载CA4的CAPL/PBAE/PLGA纳米粒，并对其形态结构、粒径及其分布进行表征（图11）。

CAPL/PBAE/PLGA/PTX载药纳米粒具有规则球状形态和“核-壳”结构，粒径为218.2 nm，分布均匀。

PTX的载药量采用紫外分光光度法于300 nm波长处进行检测，为6.9%。

[0040]10．CA4体外药物释放实验
将上述CAPL/PBAE/PLGA/CA4载药纳米粒冻干产物5 mg分散于pH 7.4 PBS溶液5 mL中，然后转移至截留分子量为10~14 kDa的透析袋中，置于50 mL pH 5.5、6.5、7.0和7.4的PBS 溶液，37℃下避光振荡（100 rpm），规定时间点将整个释放介质用新鲜介质置换，超高效液相色谱进行检测（检测波长为300 nm）。

计算药物释放百分率，绘制释放曲线，见图12。

CA4呈现更为显著的pH敏感性，可实现在肿瘤病灶的可控释放。

[0041]11．CAPL/PBAE/PLGA/PTX与CAPL/PBAE/PLGA/CA4载药纳米粒联合给药的体内抑瘤实验
将肿瘤接种2周后的HepG2荷瘤小鼠随机分为5组（6只小鼠/组）：对照组，注射200 μL生理盐水；游离PTX给药组，剂量为8 mg/kg；游离CA4给药组，剂量为10 mg/kg；游离PTX与游离CA4混合给药组，PTX与CA4的剂量分别为8和10 mg/kg；CAPL/PBAE/PLGA/PTX与CAPL/PBAE/ PLGA/CA4载药纳米粒联合给药组，PTX与CA4的剂量分别为8和10 mg/kg。

尾静脉给药，隔2天给药1次，连续给药4次。

用游标卡尺测量肿瘤的长径（a）及宽径（b），按照公式（V=ab2/2）计
算肿瘤体积V与相对体积（V/V0），绘制肿瘤生长曲线（图13），同时记录小鼠体重，绘制体重变化曲线（图14）。

结果显示CAPL/PBAE/PLGA/PTX与CAPL/PBAE/PLGA/CA4载药纳米粒联合给药组表现出对肿瘤生长最强的抑制作用，并显著降低了PTX的体内毒性，逆转了小鼠体重下降的趋势。

[0042]给药20天后，处死小鼠，取出各脏器与肿瘤组织，石蜡包埋、切片，然后进行苏木精-伊红（H&E）染色，显微镜下观察，照片如图15。

游离PTX及其与游离CA4混合给药组的肝脏切片均显示出明显的充血、组织肿胀的现象，说明PTX具有一定的肝毒性；CAPL/PBAE/PLGA/ PTX与CAPL/PBAE/PLGA/CA4载药纳米粒联合给药组的各脏器和对照组相比，没有明显的差异，但肿瘤组织表现出更为显著的坏死、细胞侵袭抑制以及炎症的现象，说明CAPL/PBAE/ PLGA纳米粒能够靶向肝癌输送PTX与CA4，从而增强它们对肿瘤的杀伤效力，减低它们对正常组织、细胞的毒副作用。

此外，对肿瘤组织切片进行CD31免疫组化染色，考察血管生成情况，数据如图16。

CAPL/PBAE/PLGA/PTX与CAPL/PBAE/PLGA/CA4载药纳米粒联合给药组表现出最强的血管生成抑制作用，进一步证明了CAPL/PBAE/PLGA纳米粒的携载可促进PTX与CA4协同作用的发挥。

[0043]
实施例2
1．精胺改性普鲁兰多糖（SPL）的合成
将500 mg普鲁兰多糖（分子量200 kDa）与500 mg N,N'-羰基二咪唑（CDI）溶于20 ml无水二甲基亚砜（DMSO）中搅拌5~10 min，而后以1~2 ml/min速度缓慢滴入10 ml溶有5 ml精胺的DMSO溶液中，35℃下搅拌反应24 h。

反应结束后将反应液转移至透析袋（截留分子量12 ~14 kDa）中，超纯水中透析3 d，透析液冷冻干燥40 h，所得白色絮状产物即为SPL。

精胺改性基团的取代度为37.9%。

[0044]2．顺丁烯二酸单酰化-精胺改性普鲁兰多糖（MSPL）的合成
将200 mg上述SPL溶于10 ml DMSO中，加入100 mg马来酸酐搅拌反应24 h，而后将反应液倾入冷乙醇溶液中，析出白色絮状沉淀，离心收集，反复多次洗涤后干燥即得MSPL。

MSPL 具有pH-敏感电荷翻转的性质，响应pH为6.0~6.5。

[0045]3．聚乙烯亚胺（PEI）与绿色荧光蛋白质粒（pEGFP）的复合
将分子质量为25 kDa的支化PEI（Sigma-Aldrich）和pEGFP按照不同N/P比在醋酸盐缓冲溶液中蜗旋振荡30 min，形成纳米复合物。

运用琼脂糖凝胶电泳考察复合情况，结果显示当N/P为5/1时，PEI能够完全复合pEGFP，形成的PEI/pEGFP复合物粒径为132.5 nm，Zeta电位为32.75 mV。

[0046]4．MSPL对PEI/pEGFP复合物的表面修饰
将PEI/pEGFP复合物溶液逐滴滴加至溶有MSPL的PBS溶液（pH 7.4）中，室温下共孵育12 h，即得表面包覆MSPL的PEI/pEGFP（MSPL/PEI/pEGFP）纳米粒。

当MSPL/PEI质量比为3/5时，TEM观察MSPL/PEI/pEGFP呈规则球状形态，具有明显的“核-壳”结构，粒径为203.5 nm，zeta 电位为–13.8 mV。

[0047]5．MSPL/PEI/pEGFP纳米粒在肝癌HepG2细胞中的转染效率
将HepG2细胞接种于24孔板，细胞密度为8.0×104个/孔，在37℃, 5% CO2条件下孵育24 h，更换含有MSPL/PEI/pEGFP纳米粒的无血清培养基，培养8 h，弃去培养基，更换含10%。