细胞工程 (3)

优点： 转基因范围广，转移基因大，可达数百kb；且转基因不含任何
病毒基因组片段，绝对安全 。
缺点：整合机制不明确，无规律随机整合，多拷贝整合导致转基因不
表达；整合位点随机会造成转动物基因组的重排、突变、易位
缺失等；需显微操作仪，技术性要求强。
胚胎干细胞方法
胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）是从早期胚胎内细 胞团（ICM）分离出来的，能在体外培养的一种高度未分化的 多能干细胞。
ES细胞的扩增：离散ES细胞
置四孔培养板中培养
ES细胞的常规培养：ES细胞由四孔板转至培养皿进行常规培养
（二）ES细胞的基因组操作
将外源基因移入到ES细胞基因组后，既能高效稳定表达，又不 影响ES细胞的各种功能。
这就要求目的基因必须要定点参入，并且参入整合后，对原有基 因结构及功能没有影响或影响最小。
基因表达；尽管病毒载体被设计为复制缺陷型的，但在包装细胞的
包装过程中，若与整合型辅助表达基因组发生同源重组，就有可能 组装成野生型逆转录病毒颗粒，因此在构建具有商业价值的转基因 动物时，一般使用受到限制。操作繁琐。
习题（11）
名词解释：逆转录病毒载体，包装细胞 显微注射法生产转基因动物的优点和缺 点？ 逆转录病毒感染法生产转基因动物的原 理是什么？有何优缺点？
原核多位于周边部，体积较大，为主要注射对象）。注射针刺入细胞内进行 注射时，如细胞核微微发生膨胀，证明DNA已被注入，反之需重新进行注 射； 注射细胞数量越多越好； （9）用支持吸管把已注射细胞移入另一培养小滴中，使之与未注射细胞分开；
待
注射结束后，把所有细胞均移入培养液中，置入温箱培养30分种；
显微注射法获得转基因鼠的成活率
受精卵发育成胚胎，并繁殖成转基因小鼠子代 ；
从小鼠子代体内取出DNA样品，进行杂交，鉴定转基因的整合与否及位 点；
子代小鼠间进行再交配，繁殖，观察转基因是否遗传及表达 。
通过DNA显微注射获得转基因小鼠示图
显微注射DNA的制备与纯化
DNA构型和末端结构
载体
DNA的长度与浓度
1 ug of pBR322 DNA=0.36 pmole DNA 1 pmole of pBR322 DNA=2.8 ug
1对互补配对的脱氧核苷酸残基平均分子量为618
Avogadro constant
In chemistry and physics, the Avogadro constant (symbols: L, NA) is defined as the number of constituent particles (usually atoms or molecules) in one mole of a given substance. It is a dimensionless number and has the value 6.02214129(27)×1023 mol−1 Changes in the SI units are proposed that will change the constant to exactly 6.02214X×1023 when it is expressed in the unit mol−1 .
成为转基因动物。
DNA显微注射法的基本程序
通过激素疗法使小鼠超数排卵，开始时注射雌性妊娠血清，48小时后再注 射人绒毛膜促进腺激素，这时小鼠便会超数排卵，一般情况下5-10个，超 数排卵为35个；
与雄性小鼠交配，然后杀掉小鼠，从其输卵管内取出受精卵；
将经纯化的转基因样品迅速注射入受精卵中变大的雄性原核内 ； 将25-40个注射了转基因的受精卵移植入代孕小鼠体内 ；
Dec 4th, 2012
第九章
转基因动物与生物反应器(2)
转基因动物的概念：
将特定的目的基因从某一生物体分离出来，进行扩增和
加工，再导入另一动物的早期胚胎细胞中，使其整合到宿主动 物的染色体上，在动物的发育过程中表达，并通过生殖细胞传 给后代。这种在基因组中稳定整合有人工导入外源基因的动物 称为转基因动物（transgenetic animal）。
在含有抗菌素G418的培养基中，没有整合外 源基因的细胞将全部死亡，只有整合了外源基
因的细胞才可以存活下来。
负选择法筛选出特异整合型ES细胞：
如果非特异性整合发生，则两个tk基因或
其中一个基因很大可能与TG和neor一起整合， 这时用GCV筛选， tk基因表达的胸苷激酶能
将GCV转化成有毒的化合物，使细胞死亡。这
二、目的基因的克隆
• 通过载体在适当的宿主中克隆
选择载体
目的基因与载体的连接
重组体导入受体细胞
• 通过PCR反应克隆目的基因
Properties of nucleic acids
• 1 A260 unit of double-stranded DNA=50 ug/ml • 1 A260 unit of single-stranded DNA=33 ug/ml • 1 ug of 1,000bp DNA=1.52 pmoles (3.03 pmoles of ends)
① 与整合位点两端区域同源的两
段DNA序列（HB1和HB2） ② 转入的目的基因（TG）
③ 编码抗G418的新霉素磷酸转移 酶基因（neor）
④ 两个不同的胸苷激酶基因 （HSV-tk1和HSV-tk2）
（三）转基因ES细胞的筛选——正负选择法
正选择法筛选出转基因整合型ES细胞：
通过物理方法将重组DNA分子导入ES细胞，
源基因的方法。此法转入
基因长度可达数百kb；并 能随机地整合在受体细胞 染色体DNA上，因此应用 范围广。但是这种整合有
时会导致转基因动物基因
组的重排、易位、缺失或 定点突变。
（3）磷酸钙—DNA共沉淀法基因转移技术
这种方法是受二价金属离 子能促进细胞吸收外源 DNA的启发而发展起来的。 当核酸以磷酸钙—DNA共
植入发情的代孕母牛子宫内；
⑦对子代进行DNA检测，确定是 否存在转入基因。
二、转基因绵羊、山羊和猪
英国pharmaceutical pritein公司用羊β一乳球蛋白启动子与人 a， l抗胰蛋 白酶基因融合，得到绵羊奶中表达的一种糖蛋白（ATT），ATT可用于治疗 人的组织纤维化和肺气肿。
在山羊奶中生产ATT(Alpha 1-Antitrypsin)
三、转基因禽类
第五节 转基因动物的应用
一、转基因动物在生命科学基础研究中的应用
研究基因的结构与功能 研究基因的组织特异性表达
研究发育相关基因的表达与调控
克隆在发育中起重要作用的基因
基因多级调节系统的研究
细胞功能研究
基因敲除（gene knock out），是指对一个结构已知但功能未知的基
三、目的基因的转移方式
① 电穿孔法
② 显微注射法
③ 裸露DNA直接注射 ④ 磷酸钙—DNA共沉淀法 ⑤ 脂质载体包埋法 ⑥ 病毒介导的生物学方法
（1）电穿孔法实现外源基因的转移
利用脉冲电场提高细胞膜的
通透性，从而使外源DNA
转移至细胞中。此法简单、
效率较高，广泛应用于培养
细胞的基因转移。
（2）显微注射转基因技术 利用显微操作技术转移外
（4）DNA准备：从Eppendorf管中取一份DNA后；用75%乙醇漂洗后，真空中干燥， 重悬于注射缓冲液中(含1mgDNA／ml)，使其最终浓度为：0.05~0.5mg/ml；
（5）于临注射前把DNA样品在Eppendorf 管中再离心一次(1200rpm，10分钟)，
以消除末溶解物，防止阻塞注射管口； （6）转基因动物是一件 需要大量资金投入的事情。
三、反转录病毒法
优点：能有效地将转基因整合入受体细胞的基因组内，单拷贝整合型；转
基因整合后能稳定地遗传；整合机制相应明确，在TR区域内进 行，不会破坏转基因结构
缺点：载量较小，一般只有8kb，可能会因缺少必须的调控元件而影响转
（7）在显微镜下把支持吸管转移到培养液小滴中，选一健康胚卵；先吸少量培 养 液， 仅令充入吸管末端，然后吹出；在吸管保持负压状态下吸住胚卵，继 之把支持管调至皿底令胚卵靠于皿底面中央部； （8）调注射针至胚卵近处，先调显微镜焦点看清针尖，然后通过透明带刺入胚
卵细胞膜内(小鼠胚卵直径约10m)，进而继续进针再刺入任一原核内（雄性
是负选反择。
（四）转基因ES细胞的检测
（五）转基因小鼠的繁育
正确整合的转基因胚胎干细胞经培养后就可以移入胚 泡期的供体胚胎了。将这些胚胎移植到假孕的代孕母鼠子
宫内，繁育转基因小鼠。
（六）获得纯合的转基因鼠
优点：基因转移效率大大提高，且能进行定位基因转移。
缺点：需要多代才能得到纯合的转基因动物，这对饲养成本高，产
2 DNA注射
（1）硅烷油注入培养皿或表玻皿：取培养皿或表玻皿，注入已经过平衡处理过的液
体硅烷油或石蜡（厚约5mm）；
（2）加培养基：通过硅烷油或石蜡层向培养皿底接种培养液，以100l为单元的小滴 数个，各滴间相距1一2cm(视小滴多少而定)；
（3）胚卵接种：吸取待受注射胚卵数个，通过油层分别接种入培养液小滴中；
•它是一种含正常二倍体染色体的具有发育全能性的细胞。 •可以在体外进行人工培养，扩增，并能以克隆的形式保存。
（一）ES细胞的建立与维持
动物的准备：取受精之后3.5天的母鼠分离鼠胚。
胚胎的分离和初培养：3.5天孕鼠
鼠断颈处死
解剖小鼠取出胚胎 4—6天后，离散ICM。 酶解细胞团 培养离散
体外培养胚胎 胚胎内细胞团（ICM）的离散与ES的分离：分离ICM 细胞 ES细胞集落
Cf. transgender animal
转基因动物的一般过程：