高效液相色谱法原理及其应用ppt课件

并依次进入检测器，由积分仪或数据处
理系统记录和处理色谱信号，最终得到
各组分的色谱峰。
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（一）高效液相色谱法的特点
+ 一、与经典液相色谱法比较
现代液相色谱法是在经典色谱理论
的基础上，采用了高压泵、化学键
合固定相高效分离柱、高灵敏专用
检测器等新实验技术建立的一种液
相色谱分析法。
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+ 二、与气相色谱法比较 1．分析对象的区别 GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较
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※（二）高压输液泵及梯度洗脱装置
+ 一、高压输液泵的种类
+ 高压输液泵可以分为以下两类：
+ 1．恒流泵：可输出恒定体积流量的 流动相。
+ （1）注射式泵（又称螺杆注射泵）
液液色谱法、液固色谱法
➢ 按分离机制分类：
分配色谱法、吸附色谱法、离子交
换色谱法、空间排阻色谱法及亲合
色谱法
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➢ 按流动相与固定相极性的相对强弱 分类： 正相色谱法、反相色谱法
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+ 一、※液固吸附色谱法（LSC） 流动相为液体，固定相为固体吸附 剂
分离机制：利用溶质分子占据固定 相表面吸附活性中心能力的差异
剂 孔性凝胶
多种不同 性能的配 位体键联 在固相基 体上
流动相
不同极性 有机溶剂
不同极性 有机溶剂 和水
不同pH值 有机溶剂 不同pH值
的缓冲溶 或一定pH 的缓冲溶
液
值的缓冲 液，可加
溶液
入改性剂
分离原理
吸附与解 吸
溶解与挥 发
可逆性的 离子交换
多孔凝胶 的渗透或 过滤
具有锁匙 结构络合 物的可逆 性离解
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※反相色谱——固定相极性 < 流动 相极性
极性大的组分先出柱，极性小的组 分后出柱
用于分离非极性至中等极性的分子 型化合物。
通常对于亲水固定液采用 疏水性 流
动相
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三、离子交换色谱法（IEC） + ※分离机制：利用组分与固定相表
面离子的交换能力的差别（与流动
相的性质无关）
+ 离子交换色谱与紫外－可见检测器 适用于检测可离解化合物
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+ 流动相（淋洗剂、洗脱剂）是影响
液相色谱分离的一个非常重要的实
验因素。改变流动相的性质和组成
将改变溶质组分的保留值、分离选
择性和柱效。在实际工作中，流动
相的可选择范围较大是液相色谱的
一个显著特点。
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+ ※液相色谱中, 组分的保留值大 小决定于组分与流动相和固定 相分子间作用力：比如吸附、 分配、离子交换、亲和力等。
+ 离子交换色谱与电导检测器结合适 用于检测无机离子——离子色谱法
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四、空间排斥色谱法（SEC）
+ 分离机制：利用组分的分子尺寸与 凝胶固定相孔径间的渗透系数的差 别
+ 按流动相的性质不同：
流动相为有机溶剂——凝胶渗透色谱
流动相为水溶液——凝胶过滤色谱
+ 主要用于分离生物大分子组分
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五、亲合色谱法（AC）
低的样品；但对高沸点、挥发性差、 热稳定性差、离子型及高聚物的样 品，尤其对大多数生化样品不可检测
占有机物的20%
HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包 括有机介质溶液），不受样品挥发性 和热稳定性的限制，对分子量大、难 气化、热稳定性差的生化样品及高分 子和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80%
3．进样装置 4．色谱柱——分离 5．检测器——分析 6．废液出口或组分收集器 7．记录装置
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※（一）输液系统
+ 一、储液装置：过滤器 + 二、脱气装置：脱气机 + 流动相脱气： + （1）吹氦脱气法 + （2）加热回流法 + （3）抽真空脱气法
+ （4）超声波脱气法
+ （5）在线真空脱气法
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（四）高效液相色谱法的定性定量分析方法
+ 与气相色谱法的分析方法基本相同
+ 定性分析方法：
色谱鉴定法
化学鉴定法
两谱联用鉴定法
+ 定量分析方法：
外标法
内标法
面积归一化法（要求每一个组分
都出峰） -
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第二节 高效液相色谱仪
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1．贮液瓶（滤芯，可滤 去颗粒状物质）
2．高压泵（输液泵、梯 洗脱度）
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2．流动相的区别
GC：流动相为惰性气体，组分与流动相无亲合作 用力，只与固定相有相互作用。
HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作
用力，能提高柱的选择性、改善分离度，对 分离起正向作用。且流动相种类较多，选择余
地广，改变流动相极性和pH值也对分离起到
调控作用，当选用不同比例的两种或两种以
+ 固定相：极性小的烷基键合相 C8柱，C18柱（ODS柱）
+ 流动相：极性大的甲醇-水或乙腈水 流动相极- 性 > 固定相极性 16
按分离过程物理化学原理分类的各种液相 色谱法的比较
吸附色谱 分配色谱 离子色谱 空间排阻 亲和色谱 色谱
固定相
全多孔固 固定液载 体吸附剂 带在固相
基体上
高效微粒 具有不同 离子交换 孔径的多
+ 分离机制：利用组分与固定相表面 上配基的专属性亲和作用的差别
+ 固定相——具有生物活性的配基键 合到载体表面上形成
+ 适用于生物样品中酶、抗体、受体
等的分离
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六、化学键合相色谱法（BPC）
+ 分离机制：利用化学反应将固定液 的官能团键合在载体表面，使组分 在吸附－分配的过程中分离
+ 应用较广泛的色谱法：反相键合相 色谱
+ 调节溶剂极性，可以控制组分的保 留时间
+ 出柱顺序：强极性组分后出柱，弱 极性组分先出柱
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二、※液液分配色谱法（LLC）
+ 分离机制：利用组分在两相中溶解度 的差异
※正相色谱—固定相极性 > 流动相极性
极性小的组分先出柱，极性大的组分后 柱，适用于分离溶于有机溶剂的极性 及中等极性的分子型物质，用于含有 不同官能团物质的分离。
高效液相色谱法 （HPLC）
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第一节 高效液相色谱法基本原理
+ 色谱分析法是分析化学中获得广泛应用 的一个重要分支，是一个具有强大生命 力的分离分析技术。
+ 采用高压输液泵将规定的流动相泵入装
有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离
测定的色谱方法。注入的供试品由流动
相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，
上液体作为流动相也可以增大分离选择性。
-5ຫໍສະໝຸດ 3．操作条件区别 GC：加温操作（※对气相色谱分离效
率最有影响的因素） HPLC：室温；高压
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三、高效液相色谱法的特点
+ 1 ．分离效能高 + 2 ．选择性高 + 3 ．检测灵敏度高 + 4 ．分析速度快
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（二）高效液相色谱法的分类及 分离机制
➢ ※按固定相的聚集状态分类：