分析方法验证3

8
准确度 Accuracy
• 回收试验 空白+已知量A的对照品测定, 测定值为 M
M 空白 回收率 R 100 % A
• 加样回收试验 已准确测定药物含量P的真实样品+ 已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M
M P R 100 % A
9
准确度 Accuracy
含量测定方法的准确度
3
分析方法验证的法规要求
• 中国GMP(2010)对分析方法验证规定： – 符合下列情形之一的，应对检验方法进行验证： • 采用新的检验方法 • 检验方法需变更的 • 采用中国药典未收载的检验方法 • 法规规定的其他需要验证的检验方法 – 对不需要进行验证的检验方法，企业应进行方法 确认，以保证检验数据准确、可靠 • 2010版药典中分析方法验证指导原则(附录XIX A) 只规定了项目和基本方法而没有合格标准, ICH 和 USP 类似
12
专属性 Specificity
专属性指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能 存在情况下采用的方法能准确测定出被测物的特性， 能反映该方法在有共存物时对供试物准确而专属的测 定能力，是指该法用于复杂样品分析时是否受到相互 干扰程度的度量
通常是通过分析含有加了杂质、降解产物、有关化学 物质或安慰剂成分的样品，将所获分析结果与未加前 述成分之样品的测试结果进行比较，两组测试结果之 差即专属性
–准确度
–精密度（重复性、中间精密度和重现性） –专属性 –检测限 –定量限
–线性
–范围 –耐用性
7
准确度 Accuracy
准确度是指用该方法测定的结果与真实值或参考值接
近的程度，用回收率%表示。
测定回收率R （recovery）的具体方法可采用“回收 试验法”和“加样回收试验法”。 数据要求：规定的范围内，至少用9次测定结果评价， 如制备高、中、低三个不同浓度样品各测三次。
13
专属性 Specificity
• 鉴别反应---应能与可能共存的物质或结构相似化 合物区别，不含被分析的样品，以及结构相似或 组分中的有关化合物，均应呈负反应 • 含量测定和杂质测定---色谱法和其他方法，应附 代表性图谱，亦说明专属性。图中应标明各组份 的位臵，色谱法中的分离度应符合要求 • 杂质可获得的情况下，对于含量测定，试样中可 加入杂质或辅料，考察测试结果是否受干扰；对 于杂质测定，也可向试样中加入一定量的杂质， 考察杂质间是否得到分离；反之则需用其他方法 进行比较。 • 色谱峰纯度试验（二极管阵列，质谱）
• 原料药可用已知纯度的对照品或样品进行测定，或用本
法所得结果与已建立准确度的另一方法测定的结果进行 比较 • 制剂可用含己知量被测物的各组分混合物进行测定，即 采用在空白辅料中加入原料药对照品的方法；如不能得
到制剂的全部组分，可向制剂中加入已知量的被测物进
行测定，或与另一个已建立准确度的方法比较结果
15
定量限 Quantitation Limit, LOQ
定量限是指样品中被测物能被定量测定的最低量，结 果应具有一定准确度和精密度要求 • 非仪器分析目视法： 用已知浓度的被测物，试验出 能被可靠地检测出的符合准确度和精密度要求的最 低浓度或量 • 信噪比法：一般以信噪比（S/N）为10∶1时相应的 浓度或注入仪器的量进行确定，也可用仪器所测空 白背景响应标准差（SD）的10倍为估计值，再经试 验确定方法的实际测定下限
• FDA cGMP [21 CFR 211.]
– Test method, which are used for assessing compliance of pharmaceutical articles with established specifications, must meet proper standards of accuracy and reliability.
18
耐用性 Robustness
耐用性又称粗放度，是指测定条件稍有变动时，结果 不受影响的承受程度，为常规检验提供依据。是衡量 实验室和工作人员之间在正常情况下实验结果重现性 的尺度; 如果方法易受到分析条件的影响，或要求苛 刻，应注明。 典型的变动包括： • 分析溶液的稳定性
用不同时间段的样品和标准品溶液与新制的标准品溶液的 对比结果来分析溶液的稳定性
4
ICH、USP、CP和EP中的方法验证
• ICH Q2(R1)：Validation of analytical Procedures: Text and Methodology -- 2005/11
ICH Q2A： Text on Validation of Analytical Procedure (Parent Guideline) -- 1994/10 ICH Q2B: Validation of Analytical Procedures: Methodology (Developed to complement the Parent guideline) -- 1996/11
20
检验项目和验证内容总结
中国药典要求 中国药典
鉴别
X
X X O X X X X O
杂质定 量测定
O
O O O X O O O O
杂质限 度测定
X
X X O O X X X O
含量
O
O O O X X O O O
溶出度 等
O
O O O X X O O O
21
准确度 精密度-重复 性
精密度-中间 精密度
10
精密度 Precision
精密度是指在规定条件下，同一个均匀样品，经多次 取样测定所得结果之间的接近程度。用偏差（d）、 标准偏差(SD)、相对标准偏差(RSD)（变异系数，CV） 表示
偏差（d）：测量值与平均值之差
标准偏差SD：
d xi x
SD ( xi x) 2 n 1
• 中国GMP(2010)、中国药典非常关注验证的过程, 分析方法验证不完善是常见的问题。
– 药品质量标准中分析方法必须验证 – 药物生产工艺变更、制剂的组分变更、原分析方法进行 修订时，则质量标准分析方法必须进行验证。
• ICH Q2(R1) Validation of Analytical Procedures • EU GMP Volume 4
专属性 检测限 定量限 线性 范围 耐用性
检验项目和验证内容总结
USP
准确度 精密度 专属性 鉴别 Cat IV
X X O
杂质定 量测定 Cat II
O O O
杂质限 度测定 Cat II
* X O
含量 Cat I
O O O
溶出度 等 Cat III
* O *
检测限 定量限
线性 范围
X X
X X
X O
相对标准偏差RSD：
SD RSD 100 % x
11
精密度 Precision
• 重复性(repeatability)：在相同条件下，由同一个分 析人员测定所得结果的精密度； • 在规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如 制备三个不同浓度样品各测三次 • 把被测物浓度当作100%，至少测6次进行评价 • 中间精密度(Intermediate Precision)：同一实验室， 不同时间由不同分析人员用不同设备所得结果的精 密度 (三人三机) • 重现性(reproducibility)：不同实验室，不同分析人 员测定结果的精密度 • 数据要求：需报告SD，RSD和臵信区间。
• USP<1225> Validation of Compendial Procedures • 中国药典附录XIX A 药品质量标准分析方法验证指 导原则 • European Directorate for the Quality of Medicines & HealthCare [PA/PH/OMCL (05) 47 DEF] Validation of Analytical Procedures – 2005/06
5
分析方法验证的要求
• 目的：证明所用的分析方法适合于相应的 检测要求 • 需验证的分析项目 – 鉴别试验 – 杂质定量或限度检查，原料或制剂中有效 成分含量测定 – 制剂中其它成分（降解产物、防腐剂）的 测定 – 溶出度、释放度等功能检查中的溶出量等 的测试方法
6
分析方法验证的要求
• 验证内容：
14
检测限 Detection Limit, LOD
检测限是指试样在确定的实验条件下，被测物能被检 测出的最低浓度或含量。它是限度检验效能指标，无 需定量测定，只要指出高于或低于该规定浓度即可。
• 非仪器分析目视法： 用已知浓度的被测物，试验出能被可 靠地检测出的最低浓度或量 • 信噪比法: 用于能显示基线噪音的分析方法（仪器分析方 法），是把已知低浓度试样测出的信号与空白样品测出的信 号进行比较，算出能被可靠地检测出的最低浓度或量。一般 以信噪比3∶1或2∶1时的相应浓度或注入仪器的量确定检测 限 • 标准差法： ①测定背景10次以上，求出标准差σb； ②将σb乘以三倍； ③在工作曲线上求出3σb相对应的浓度Xb；即为检出限； ④将求得的对应浓度值加上空白值（空白值为0则不加）即 得检出限。
17
范围 Range
范围是指达到一定精密度、准确度和线性的条件下， 测试方法适用的高、低限浓度或量的区间。范围应根 据分析方法的具体应用和线性、准确度、精密度结果 和要求确定。 • 原料药和制剂含量测定范围为80%-120%； • 制剂含量均匀度范围为70%-130%； • 杂质测定应为被测杂质报告值到限度的120%； • 溶出度应为测定范围的±20%，如规定了限度范围， 应为下限的-20%至上限的+20%，例如缓释片 1h<20%, 7h>70%, 则验证范围定为0-90%。