MALDI-TOF-MS病原体鉴定质量保证专家共识
【专家共识】临床微生物实验室真菌检测能力建设基本要求
临床微生物实验室真菌检测能力建设基本要求【专家共识】近年来侵袭性真菌感染呈持续增多趋势，准确、早期诊断是治疗疾病的关键。
然而，目前我国临床实验室真菌检测能力离临床诊治需求尚有较大差距，亟待改进。
国家卫生计生委办公厅于2016年底发布了《关于提高二级以上综合医院细菌真菌感染诊疗能力的通知》（国卫办医函[2016]1281号），要求在2020年以前加强临床细菌真菌感染诊疗体系的建设，促进抗菌药物的合理应用，维护人民群众健康。
本共识的制定旨在建立临床微生物实验室真菌检测能力基本要求，推动真菌检测技术的普及和人员能力的提升，从而提高综合医院真菌感染诊疗能力。
一、术语和定义（一）酵母菌单细胞真菌呈圆形或卵圆形，以出芽方式繁殖，称为酵母菌（yeast）。
临床致病的酵母菌主要包括念珠菌、隐球菌、毛孢子菌等。
（二）丝状真菌多细胞真菌有菌丝和孢子，菌丝延长分枝，交织成团，称为丝状真菌（filamentous fungi）。
又称霉菌（mold）。
临床重要的丝状真菌包括曲霉菌、毛霉菌、镰刀菌等。
（三）双相型真菌有些真菌可因环境条件（如营养、温度、氧气等）改变，由一种形态转变为另一种形态，称为双相型真菌（dimorphic fungi），如球孢子菌、组织胞浆菌、芽生菌、孢子丝菌、马尔尼菲篮状菌等。
这些真菌在体内或在含动物蛋白的培养基上，37 ℃培养时呈酵母相；而在普通培养基，25 ℃培养时呈霉菌相。
二、环境和设施要求真菌实验室环境和设施的设计应确保实验的质量和生物安全。
（一）环境要求真菌实验室应与细菌、病毒等实验室区分，以防发生交叉污染。
其面积以满足工作和安全要求为宜，合理布局。
在建设实验室或开展实验活动之前，应进行生物危害评估。
（二）基本设施设置防飞虫纱窗和门禁，有充足的照明、应急灯、通风、供水、供电、紧急疏散标识及信息系统，工作区设有洗手池、应急淋浴和洗眼装置；门外有生物安全级别标识[1]。
配置生物安全柜和不同温度培养箱（至少包括25~30 ℃以及35~37 ℃）。
MALDI-TOF-MS技术及应用
MALDI技术中基质的作用
把样品分子彼此分开(基质：样品=10，000：1)，削弱 样品分子之间的相互作用。 基质吸收激光的能量，并将部分能量传递给样品。 帮助样品离子化。
基质是如何帮助样品分子电离的？
以正离子模式为例： • 基质吸收激光的紫外波长后增加能量，並将能量部分 释放给样品分子 • 帮助样品分子质子化，並帶有电荷（M+H+） • [M+H]+ 在真空状态下，雾化形成气态单一分子。在 高压电场的吸引下[M+H]+ 离开离子源飞向飞行管
Matrix - CHCA
常用基质及选择
基质
HCCA
样品
蛋白，多肽，糖，小分子，极性聚合物
DHB
HPA Dithranol IAA
蛋白，多肽，糖，小分子，极性聚合物
核苷酸 非极性聚合物 非极性聚合物
MALDI-TOF质谱的原理
t = c ·m/z
E=U· z=1/2mv2 和 t=L/V
Pulsed Laser generates MALDI ions
20 KeV MALDI Ion Source
MALDI-TOF质谱的应用
应用MALDI-TOF-MS技术 鉴定和分类微生物
实验流程
菌种鉴定 Bacillus globigii
数据分析 Profiling results from different Bacillus strains 质谱分析
基质辅助激光解吸电离(MALDI)
基本原理： 将样品分散在基质分子中并形成共结晶后直接进样, 当用激光(337 nm的氮激 光或355 nm的固体激光器)照射晶体时, 基质吸收了激光的大部分能量，使基质分子 和样品获得能量投射到气相并得到电离，成为带电荷的离子。因此基质在样品离子 形成过程中起到了质子化或去质子化的作用，使样品分子带上正电荷或负电荷，成 为带电荷的离子。 离子源特点: 1、使用脉冲式激光； 2、产生单电荷离子和部分双单电荷离子，质谱图中的谱峰与样品各组分的质量 数有一一对应关系； 3、离子化效率高，灵敏度高 (fmol～amol) 常用基质： 芥子酸(3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸)（SA)、龙胆酸(2,5-二羟基苯甲酸)(DHB)、 α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)、吡啶甲酸(PA)、3-羟基吡啶甲酸(3HPA)。
maldi-tof
新闻网页贴吧知道MP3图片视频百科文库MALDI-TOF-MS进入词条搜索词求助编辑MALDI-TOF-MS1. 基本原理MALDI-TOF-MS（基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱, 英文名Matrix-Assisted Laser Desorption/n Time of Flight Mass Spectrometry）是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱，其无论是在理论在设计上都是十分简单和高效的。
仪器主要由两部分组成：基质附助激光解吸电离离子源（MALDI）和质量分析器（TOF）。
MALDI的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。
因种软电离技术，适用于混合物及生物大分子的测定。
TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比（M/Z）与离子的飞行时间成正比 ，检测离子。
OF-MS具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点，为生命科学等领域提供了一种强有力的分析测试手扮演着越来越重要的作用。
2 分子量测定分子量是有机化合物最基本的理化性质参数。
分子量正确与否往往代表着所测定的有机化合物及生的结构正确与否。
MALDI-TOF是一种软电离技术，不产生或产生较少的碎片离子。
它可直接应用于混合析，也可用来检测样品中是否含有杂质及杂质的分子量。
分子量也是生物大分子如多肽、蛋白质等鉴定参数，也是基因工程产品报批的重要数据之一。
MALDI-TOF的准确度高达0.1%~0.01%，远远高于目前的SDS电泳与高效凝胶色谱技术，目前可测定生物大分子的分子量高达600KDa。
3. 蛋白质组学中的质谱技术——肽质量指纹谱技术（PMF）蛋白质组学是当前生命科学研究的前沿领域。
对蛋白质快速、准确的鉴定是蛋白质组学研究中必不键性的一步。
采用MALDI-TOF-MS测得肽质量指纹谱（PMF）在数据库中查询识别的方式鉴定蛋白质，蛋白质组学研究中最普遍应用的最主要的鉴定方法。
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱微生物鉴定系统性能验证方案的建立
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱微生物鉴定系统性能验证方案的建立徐蓉;慎慧;黄媛媛;何丽华;倪丽君;郭建;吴文娟【摘要】目的建立基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱系统(MALDI-TOF MS)在常规临床微生物鉴定中的性能验证方法,指导临床实验室规范微生物鉴定程序.方法选取标准菌株、质控菌株和临床菌株共115株,包含革兰阳/阴性球菌30株、革兰阳/阴性杆菌31株、真菌30株,厌氧菌、苛养菌各12株,所有菌株均经Vitek Compact鉴定和/或细菌16S rDNA、真菌ITS DNA测序分析验证.任意选择3种MALDI-TOF MS微生物鉴定系统厦门质谱、布鲁克质谱、安图质谱,采用检测系统推荐方法进行菌株鉴定,进行准确度验证试验.精密度验证:选取标准菌株和临床菌株10株,1位操作者使用3个检测系统对10株菌株分别进行质谱鉴定3次,连续鉴定3 d;3位操作者使用3个检测系统对10株菌株每d分别进行质谱鉴定3次,连续鉴定3 d,从而验证鉴定结果的重复性.结果厦门质谱、布鲁克质谱、安图质谱对标准/质控菌株(除外厌氧菌)的鉴定符合率为100％;对临床菌株的属水平鉴定符合率为100％;对革兰阴/阳性杆菌的种水平鉴定符合率分别为100％、100％、96.77％;对革兰阳性球菌的种水平鉴定符合率分别为96.67％、96.67％、100％;对真菌的种水平鉴定符合率均为90％一致;对苛养菌的种水平鉴定符合率均为100％;对厌氧菌鉴定符合率为91.67％种水平一致.精密度验证试验结果重复性100％.结论 3种MALDI-TOF MS系统在革兰阳/阴性球菌、革兰阳/阴性杆菌、真菌、苛养菌鉴定的准确度和精密度符合要求,验证通过.本文建立的微生物鉴定质谱仪性能验证方案可满足综合性医院临床微生物实验室常规鉴定基本要求.【期刊名称】《临床检验杂志》【年(卷),期】2018(036)010【总页数】5页(P783-787)【关键词】基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱;性能验证;微生物鉴定【作者】徐蓉;慎慧;黄媛媛;何丽华;倪丽君;郭建;吴文娟【作者单位】上海市临床检验中心临床微生物室,上海200126;同济大学附属东方医院南院检验科,上海 200123;同济大学附属东方医院南院检验科,上海 200123;同济大学附属东方医院南院检验科,上海 200123;同济大学附属东方医院南院检验科,上海 200123;同济大学附属东方医院南院检验科,上海 200123;同济大学附属东方医院南院检验科,上海 200123【正文语种】中文【中图分类】R446.520世纪90年代末，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)成功应用于微生物菌种鉴定并得到迅猛发展。
基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术在临床微生物鉴定中的应用及发展
基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术在临床微生物鉴定中的应用及发展发表时间：2016-11-22T15:50:01.333Z 来源：《中国医学人文》(学术版)2016年7月第14期作者：张小莉马建芬通讯作者[导读] 本文就MALDI-TOF-MS在临床病原微生物鉴定中的应用做一综述。
江苏省宜兴市人民医院检验科 214200基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱，在国外实验室运用较多，对一些疾病如肿瘤、关节炎、阿尔茨海默病提供快速分析诊断，近年来，更把这项技术应用于微生物的鉴定，完全颠覆了传统微生物实验室从接种、孵育、分纯直至生化鉴定最后出结果的漫长过程，弥补了传统方法操作繁琐和检测周期长等缺陷。
目前，MALDI-TOF 质谱技术作为一种快速而准确的检测技术，也被国内越来越多的学者重视，应用于病原微生物的鉴定及耐药研究中。
本文就MALDI-TOF-MS在临床病原微生物鉴定中的应用做一综述。
1 MALDI-TOF-MS检测技术MALDI-TOF-MS主要由三个部分组成：基质辅助激光解析电离离子源（MALDI）、飞行时间质量分析器（TOF）及检测器。
MALDI的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，使生物分子电离，适用于混合物及生物大分子的测定。
TOF的原理是离子在电场作用下加速通过飞行管道，根据离子质荷比与离子飞行时间成正比，不同离子因到达飞行器的时间不同而被检测到，形成以离子峰为纵坐标，离子质荷比为横坐标的质量图谱，通过对比蛋白指纹库实现微生物种属的区分和鉴定[1]。
MALDI-TOF 质谱仪的这一原理使它能完成多种成分（包括脂类、糖类、蛋白质、DNA、多肽等能被离子化的分子）的分析[，具有高灵敏度、高通量的特点，能耐受一定量的杂质，对样品的纯度要求，可以分析细菌培养液等复杂的生物样品。
2 MALDI-TOF-MS在临床微生物鉴定中的应用2.1鉴定临床纯培养菌株MALDI-TOF-MS对于细菌的鉴定主要是两种，全菌分析法（ICM）和蛋白提取法（PEM）。
MALDI-TOFMS在临床微生物检验中的应用效果分析
近年来，微生物成为导致人类疾病的最主要因素，不断影响着人们的正常生活，再加上人们使用抗生素日益频繁，存在着明显滥用的情况，导致细菌侵略人体，影响人类健康的现象也日益严重。
因此现代医学面临更艰难的任务和挑战，其中最重要的就是要不断发展检验致病菌种类的方法，目前检验科室最新的检验微生物的方法为MALDI-TOF MS [1]。
现选取2015年2月~2016年2月在本院进行微生物检验的280份样本作为研究对象，探究MALDI-TOF MS 在微生物检验中的应用效果，现研究如下。
1.资料与方法1.1临床资料选取2015年2月~2016年2月在本院进行微生物检验的280份样本作为研究对象，将280份样本随机分组，分别为研究组和实验组。
1.2方法研究组采用MALDI-TOF MS 对样本进行检验，而对照组则使用传统的方法进行检验。
主要方法为细菌培养法、革兰氏染色法以及一系列生化试验等[2]。
比较两组间的微生物检出率，分析MALDI-TOF MS 临床应用效果。
1.3统计学方法将实验所得数据采用SPSS17.0软件进行处理，若p <0.05，则说明数据具有统计学意义。
2.结果研究组通过MALDI-TOF MS 对样本检测后，微生物样本检出量为134份，检出率高达95.71%，而对照组的检出量为113份，检出率为80.71%，研究组的检验效果明显高于对照组，数据有显著性差异，具有统计学意义（p <0.05），见表1。
3.讨论3.1基本原理样本电离室、质谱分析器以及粒子探测器三个部分构成了MALDI-TOF MS [3]。
其基本原理为先量取一定量的微MALDI-TOF MS 在临床微生物检验中的应用效果分析李美丽 鞍山市肿瘤医院检验科 （辽宁 鞍山 114034）文章编号：1006-6586(2017)01-0015-02 中图分类号：R446.5 文献标识码：A内容提要： 目的：探究临床中使用MALDI-TOF MS 进行微生物检验的效果。
关于在MALDI-TOF_MS_技术背景下提高临床微生物检验实习教学能力的探讨
中国卫生产业CHINA HEAL TH INDUSTRY关于在MALDI-TOF MS 技术背景下提高临床微生物检验实习教学能力的探讨林慧珍，李泰阶，黄师，林青，王柏莲，蒋诚传，石姗以广西医科大学附属武鸣医院，广西南宁 530199[摘要] 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry ， MALDI-TOF MS ）技术是临床微生物诊断中的一项革命性创新技术，给临床微生物诊断带来了极大的便利，同时也给临床微生物实习带教带来了新的挑战。
本文阐述了MALDI-TOF MS 技术在临床微生物检验实习带教中的应用探讨，旨在充分运用MALDI-TOF MS 技术结合传统鉴定技术，提高临床微生物检验实习的教学能力。
[关键词] 临床微生物检验；MALDI-TOF MS 技术；实习带教；应用效果；教学能力[中图分类号] R19 [文献标识码] A [文章编号] 1672-5654（2024）01（b ）-0238-04Discussion on Improving the Practical Teaching Ability of Clinical Micro⁃biological Examination Based on MALDI-TOF MS TechnologyLIN Huizhen, LI Taijie, HUANG Shi, LIN Qing, WANG Bolian, JIANG Chengchuan, SHI ShanyiWuming Hospital Affiliated to Guangxi Medical University, Nanning, Guangxi Zhuang Autonomous Region, 530199 China[Abstract] Clinical microbiology testing is one of the important specialties of clinical medical testing and plays an im⁃portant role in the clinical field. By providing accurate clinical microbiology test results and related suggestions, it pro⁃vides scientific basis for doctors' diagnosis and treatment decisions, thereby improving the accuracy of clinical diagno⁃sis and the effectiveness of treatment. Matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) technology is a revolutionary innovative technology in clinical microbiology diagnosis. It brings great convenience to clinical microbiology diagnosis, but also brings new challenges to clinical microbiology internship teaching. This article elaborated on the application of MALDI-TOF MS technology in teaching clinical microbiology testing practice, aiming to fully utilize MALDI-TOF MS technology combined with traditional identification technologyto improve the teaching ability of clinical microbiology testing practice.[Key words] Clinical microbiology testing; MALDI-TOF MS technology; Practice teaching; Application effect; Teach⁃ing capabilities临床微生物学检验综合了临床医学、免疫学、病原生物学、流行病学和细菌耐药监测等多方面的知识和技能，在临床领域中发挥重要的作用[1]。
(完整版)MALDI-TOFMS病原体鉴定质量保证专家共识
MALDI－TOF MS病原体鉴定质量保证专家共识基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption ionization time－of－flight mass spectrometry, MALDI－TOF MS)作为一种新兴的软电离质谱技术，由于其具有快速、准确、灵敏、自动化及高通量等检测特点，已成为一项革命性病原体快速鉴定技术被用于临床微生物实验室，并将逐步取代常规病原体生化鉴定方法。
任何新兴技术应用于临床都需要建立规范的质量保证体系，以确保检测质量。
本专家共识将对开展MALDI－TOF MS用于病原体鉴定的设施与安全要求、人员培训与能力评估、MALDI－TOF MS病原体鉴定过程的质量控制、检验程序性能验证等进行建议。
设施与安全要求1．风险评估：拟开展MALDI－TOF MS病原体检测的实验室需在风险评估基础上建立有效的安全防护策略，包括设备的使用、化学试剂的安全使用和处理丢弃、感染性病原体和被污染材料的处置等。
风险评估包含确定工作流程和鉴定步骤中可能发生的化学和生物危害，以及降低风险的方法。
2．安全防护：任何操作临床病原体样本或病原体的实验活动至少需要在二级生物安全实验室(BSL－2)中进行。
MALDI－TOF MS应安置在二级生物安全实验室内，同时使用MALDI－TOF MS检测临床病原体样本时除了需考虑生物危害的风险外还要注意化学试剂的潜在风险。
人员培训与能力评估各实验室应具备MALDI－TOF MS检测过程中涉及的所有操作人员的初次培训和定期能力评估的程序文件，对涉及的所有操作人员应进行初次和定期(至少6个月一次)的培训以及能力评估，培训考核需遵循制造商的使用手册或实验室的标准操作规程，培训的内容包括原理方法、信息技术、仪器维护、结果报告与解释等方面。
此外，还应采用一组形态和生化特征典型的菌株对培训者进行人员比对和/或考核，以确保所有操作者鉴定结果的一致性。
MALDI—TOFMS在食品微生物中的应用数分钟内确认和鉴定微生物
MALDI—TOFMS在食品微生物中的应用数分钟内确认和鉴定微生物一系列的微生物都可能对食物造成污染，如细菌、酵母菌、霉菌和寄生虫等。
常见的食源性致病菌包括沙门氏菌属、克罗诺杆菌属、弯曲杆菌属，以及单核细胞增生李斯特菌等。
如未能及时检测食品中的微生物含量，食源性致病菌将会通过受污染的食物进行传播扩散，进而爆发严重的疾病。
通过监测大肠杆菌、李斯特菌、酵母菌和霉菌等质量指标，可对食品工艺卫生情况和质量进行评价。
如今，用于识别食品中微生物的技术种类繁多，包括传统的基于培养的方法、使用聚合酶链反应（PCR）试验的分子检测方法，以及日益复杂的分析技术，如质谱法（MS）。
然而，研究人员和测试制造商仍试图寻找更为先进的方法，希望以更高的准确性和灵敏度进行更快速的测试。
质谱的发展历经多年发展，食品工业已经习惯于使用经AOAC或ISO16140认可的快速检测方法——这些定性或定量方法被食品安全管理机构所接受，且区域法规也对其予以认可，并鼓励将它们应用于各种各样的食品。
新技术的发展，如基质辅助激光解吸/电离（MALDI）飞行时间（TOF）质谱或测序技术凭借其更快速、更可靠的结果被大范围应用，促使食品微生物检测技术进入新的纪元。
检测时间的长短往往是考量食品微生物实验室合格与否的关键因素之一，因此，MALDI-TOFMS快速准确地确认与鉴定微生物的能力在常规测试中具有极高价值。
对比研究表明，在准确鉴定细菌和真菌方面，MALDI-TOFMS（100%）与传统鉴定板（94%～97%）存在差异——MALDI-TOFMS在速度及试剂成本方面拥有较大优势。
Q实验室（美国俄亥俄州辛辛那提市）自1966年就服务于食品、化妆品、制药、保健美容和膳食补充剂行业，可以提供全面的微生物学、化学实验室及研发服务。
作为一家将先进的技术与个人服务和关注相结合的独立实验室，Q实验室致力于提供满足所有测试和质量保证需求的服务。
近期，Q实验室的微生物食品实验室采用MALDI-TOFMS进行日常食品微生物测试及研发（R&D）工作。
中医医院感染管理重点-718-2019年华医网继续教育答案
2019年华医网继续教育答案-718-中医医院感染管理
重点
备注:红色选项或后方标记“[正确答案]”为正确选项
(一)MALDI-TOF MS病原体鉴定质量保证专家共识
1、MALLDI-TOF操作人员的定期培训与能力评估需多长时间开展一次（）
A、至少1个月
B、至少3个月
C、至少6个月[正确答案]
D、至少1年
2、关于校准的描述正确的是（）
A、仪器是否能正确鉴定大肠埃希菌
B、调试仪器质量和时间的线性关系[正确答案]
C、改善漂移的质量
D、每次上机进行
3、MALDI-TOF的室内质控中做阴性对照目的是（）
A、排除可能由试剂污染或重复性靶板清洗不当造成的假阳性结果[正确答案]
B、确认阳性菌株
C、确定基质溶液是否存在污染
D、排除其他菌株的污染
4、MALDI-TOF鉴定以下病原体，哪些需要通过相应的补充实验进一步鉴别（）
A、肺炎克雷伯菌
B、沙门菌属[正确答案]
C、大肠埃希菌
D、化脓性链球菌
5、建立质谱数据库的菌株要求，用于临床至少___株，用于科研至少___株（）
A、5，2[正确答案]。
MALDI-TOF MS微生物鉴定的室内质量控制体系建立
maldi-tof-m 鉴定菌株的流程
maldi-tof-m 鉴定菌株的流程
MALDI-TOF-MS（Matrix-assisted laser desorption/ionization
time-of-flight mass spectrometry）是一种常用的菌株鉴定技术，其流程通常包括以下步骤：
1. 菌落的制备：从纯培养菌株中挑取单个菌落，并在培养基上培养。
2. 提取蛋白质：利用酸性有机溶剂或氯仿/甲醇溶剂将菌落中
的蛋白质提取出来。
3. 涂片制备：将提取得到的蛋白质溶液加载到MALDI-TOF靶板上的目标位置，加上适量的基质（通常为辅助吸附样品分析的物质，如小麦胰蛋白酶），使其干燥。
4. 质谱仪测定：将靶板放入MALDI-TOF-MS仪器中，通过激
光照射样品，产生离子化的蛋白质分子。
离子化的蛋白质经由电场加速，射入一个含有相同电荷量的电场管道中，从而通过电场加速分子，使其以不同离子所受到的电荷量比例有所差别，进而测得离子质量比时间。
5. 数据分析：通过质谱仪测得的质谱图，利用质谱数据库进行匹配和比对，确定菌株的鉴定结果。
比对的过程通常通过计算相似性分数或利用专用软件进行评估。
6. 结果解读：根据数据库匹配的结果，确定菌株的鉴定结果，并进行相应的记录和报告。
MALDI-TOF_质谱技术对猪肠道菌群中携带mcr_-1_细菌的鉴定与聚类分型
·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报摘 要：为了解多粘菌素耐药基因mcr -1在猪肠道微生物群落中的分布特征，本研究采集分离同一猪肠道样品中的多粘菌素耐药菌，利用PCR 进行mcr -1基因检测，采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS ）技术对mcr -1阳性菌株进行种属鉴定与亲缘关系分析。
结果显示，在收集获得的325株多粘菌素耐药菌中，136株（41.8%）含有mcr -1基因，包括大肠杆菌70株，肺炎克雷伯菌19株，放线杆菌47株。
细菌蛋白指纹图谱进行聚类分析显示，70株mcr -1阳性大肠杆菌被划分为13个亚型，19株肺炎克雷伯菌被分为3个亚型，其中有17株菌属于同一亚型（占89.5%），47株放线杆菌均为同一克隆。
上述结果表明mcr -1在肠道菌群中存在克隆传播现象，细菌指纹图谱的多样性也提示可能存在质粒或者其他转移元件介导的mcr -1水平传播。
MALDI-TOF-MS 作为一种新的技术，不仅能够实现细菌的快速鉴定，而且可基于细菌蛋白指纹图谱对菌株进行初步的亲缘关系分析。
关键词：mcr -1基因；基质辅助激光解析电离飞行时间质谱；聚类分型；猪；肠道菌群中图分类号：S852.61文献标志码：A文章编号：1674-6422（2023）03-0127-07Identifi cation and Typing of mcr -1-Carrying Bacterial Strains Isolated from PigGut Flora by MALDI-TOF Mass SpectrometryGAO Yun 1, XUAN Huiyong 1, YAO Xiaohui 1, WEI Jianchao 2, LIU Ke 2, SHAO Donghua 2, QIU Yafeng 2,MA Zhiyong 2, LI Beibei 2, XIA Lining 1(1. College of V eterinary Medicine, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, China;2. Shanghai V eterinary Research Institute, CAAS,Shanghai 200241, China)收稿日期：2021-01-20基金项目：国家自然科学基金（31860714）；上海市青年科技启明星计划（19QA1411200）作者简介：高芸，女，硕士研究生，基础兽医学专业通信作者：夏利宁，E-mail：*****************；李蓓蓓，E-mail：************.cnMALDI-TOF 质谱技术对猪肠道菌群中携带mcr -1细菌的鉴定与聚类分型高 芸1，轩慧勇1，姚晓慧1，魏建超2，刘 珂2，邵东华2，邱亚峰2，马志永2，李蓓蓓2，夏利宁1（1.新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐830052；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241）2023,31(3):127-133Abstract: The aim of this study is to understand the distribution of colistin resistance gene mcr -1 in pig gut fl ora. Colistin-resistant bacteria strains were collected from one single swine feces sample and the mcr -1 gene was detected by PCR. MALDI-TOF mass spectrometry was used for bacterial identification and typing of the mcr -1-positive isolates. In the collected 325 colistin-resistant strains, 136(41.8%) were positive for the mcr -1 PCR, including 70 Escherichia coli strains, 19 Klebsiella pneumoniae strains and 47Actinobacillus sp. strains. MALDI-TOF MS-based typing showed that 70 E. coli strains were divided into 13 types; 19 K . pneumoniae strains were grouped into 3 types, of which 17 isolates belonged to one type; the 47 Actinobacillus sp. strains belonged to one clone. These results demonstrated that the distribution of the mcr -1 gene in pig gut fl ora could be mediated by clone spread. The diversity of the bacteria typing based on MALDI-TOF MS implied the existence of horizontal transmission of mcr -1 gene in the intestinal microbiota. Key words: mcr -1 gene; matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry; dendrogram ; pig; gut fl ora· 128 ·中国动物传染病学报2023年6月随着抗生素的广泛应用，细菌耐药已经成为21世纪人类健康的最大威胁之一[1]。
MALDI-TOF_MS技术在真菌鉴定和药敏试验中的影响因素研究
ә通信作者,E -m a i l :g u o y o n g32@126.c o m ㊂㊃综 述㊃D O I :10.3969/j.i s s n .1672-9455.2023.14.027MA L D I -T O F M S 技术在真菌鉴定和药敏试验中的影响因素研究李家政,缪杨阳综述,郭 勇ә审校南京中医药大学附属苏州市中医医院检验科,江苏苏州215000摘 要:基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MA L D I -T O F M S )是一种具有经济㊁快速㊁准确㊁高通量等特点的新技术,广泛应用于临床微生物的常规鉴定㊂近年来,随着MA L D I -T O F M S 技术的不断发展,其在临床感染性真菌的快速鉴定㊁药敏试验㊁分型等实验室诊断中在一定程度上弥补了传统形态学鉴定的不足,展现出巨大的应用潜力㊂由于真菌种类繁多㊁结构复杂㊁耐药谱多样及表型可变,在MA L D I -T O F M S 技术分析真菌的过程中,影响因素相对来说比较复杂,该文就不同培养条件㊁蛋白质提取方法和蛋白图谱数据库等条件对MA L D I -T O F M S 技术鉴定真菌的影响作一综述㊂关键词:基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术; 真菌鉴定; 真菌药敏试验; 真菌分型中图法分类号:R 978.5文献标志码:A文章编号:1672-9455(2023)14-2104-04I n f l u e n c i n g f a c t o r s o f M A L D I -T O F M S t e c h n o l o g y i n f u n ga l i d e n t i f i c a t i o n a n d d r u g s u s c e p t ib i l i t yt e s t r e s e a r c h L I J i a z h e n g ,M I A O Y a n g y a n g ,G U O Y o n gәD e p a r t m e n t o f C l i n i c a l L a b o r a t o r y ,S u z h o u T r a d i t i o n a l C h i n e s e M e d i c i n e H o s p i t a l A f fi l i a t e d t o N a n j i n g U n i v e r s i t y o f C h i n e s e M e d i c i n e ,S u z h o u ,J i a n g s u 215000,C h i n a A b s t r a c t :M a t r i x -a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n i o n i z a t i o n t i m e -o f -f l i g h t m a s s s p e c t r o m e t r y (MA L D I -T O F M S )i s a n e w t e c h n i q u e w i t h e c o n o m i c a l ,r a p i d ,a c c u r a t e a n d h i g h -t h r o u g h p u t c h a r a c t e r i s t i c s ,w h i c h i s w i d e l y us e d i n t h e r o u t i n e i d e n t i f i c a t i o n o f c l i n i c a l m i c r o o r g a n i s m s .I n r e c e n t y e a r s ,w i t h t h e c o n t i n u o u s d e v e l o pm e n t o f MA L D I -T O F M S t e c h n o l o g y ,i t h a s m a d e u p f o r t h e s h o r t c o m i n g s o f t r a d i t i o n a l m o r p h o l o gi c a l i d e n t i f i c a t i o n t o a c e r t a i n e x t e n t i n t h e l a b o r a t o r y d i a g n o s i s o f c l i n i c a l i n f e c t i o u s f u n g i ,s u c h a s r a p i d i d e n t i f i c a t i o n ,d r u g se n -s i t i v i t y t e s t a n d t y p i n g ,a n d h a s s h o w n g r e a t a p p l i c a t i o n p o t e n t i a l .D u e t o t h e w i d e v a r i e t y ,c o m pl e x s t r u c t u r e ,d i v e r s e d r u g r e s i s t a n c e s p e c t r u m a n d v a r i a b l e p h e n o t y p e o f f u n g i ,t h e i n f l u e n c i n g f a c t o r s a r e r e l a t i v e l y c o m pl e x i n t h e p r o c e s s o f f u n g i a n a l y s i s b y MA L D I -T O F M S .T h i s a r t i c l e r e v i e w s t h e i n f l u e n c i n g f a c t o r s o f f u n gi i d e n -t i f i c a t i o n b y MA L D I -T O F M S u n d e r d i f f e r e n t c u l t u r e c o n d i t i o n s ,p r o t e i n e x t r a c t i o n m e t h o d s a n d p r o t e i n m a pd a t a b a se s .K e y wo r d s :m a t r i x -a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n i o n i z a t i o n t i m e -o f -f l i g h t m a s s s p e c t r o m e t r y ; i d e n t i f i c a t i o n o f f u n g i ; f u n g a l s u s c e p t i b i l i t y t e s t i n g ; c l a s s i f i c a t i o n o f f u n gi 近年来,由于恶性肿瘤的高发病率及化疗药物㊁广谱抗菌药物和免疫抑制剂等在临床的广泛应用,侵袭性真菌感染的发生率和病死率呈明显上升趋势[1]㊂真菌感染的临床表现复杂,顽固难治愈,易误诊误治,早期抗真菌治疗对患者生存至关重要㊂抗真菌治疗不充分㊁延迟开始治疗时间均会增加患者的病死率[2]㊂传统的真菌鉴定方式,尤其是丝状真菌的鉴定,主要依赖形态学方法㊂由于检验人员专业水平和经验参差不齐,其准确性和时效性较差,鉴定困难和鉴定错误的情况时有发生,进而导致治疗失败㊁病情延误㊂虽然分子测序技术是真菌鉴定的 金标准 ,但其操作复杂㊁价格昂贵且对实验条件和人员要求较高,难以在临床实验室常规开展㊂基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MA L D I -T O F M S)是一种跨学科的检测新技术,具有适应范围广㊁快速㊁准确㊁高通量㊁经济㊁操作方便等优势[3]㊂近几十年来,科研人员对MA L D I -T O F M S 技术在临床真菌的快速鉴定㊁药敏试验等方面不断探索和实践,在一定程度上弥补了传统形态学和分子测序技术上的不足㊂影响质谱鉴定真菌的因素比较复杂,尤其是丝状真菌,在培养条件㊁蛋白质提取方法㊁蛋白图谱数据库均不同的条件下,鉴定结果具有较大差异,仍需进行改进和完善[4]㊂本㊃4012㊃检验医学与临床2023年7月第20卷第14期 L a b M e d C l i n ,J u l y 2023,V o l .20,N o .14Copyright ©博看网. All Rights Reserved.文基于近几年来MA L D I-T O F M S技术在临床真菌鉴定和诊断中的应用进展,总结出不同检测条件对鉴定结果的影响,旨在为临床实验室实施MA L D I-T O F M S技术鉴定真菌提供相应信息㊂1培养条件对MA L D I-T O F M S技术鉴定真菌的影响丝状真菌受生长条件和真菌菌丝体区域的影响,呈现出可变的表型㊂菌龄㊁培养基种类㊁培养条件等均可能会导致蛋白质谱差异,干扰样品的正确鉴定㊂有研究显示,来源相同的尖孢镰刀菌株,在两种不同琼脂培养基平板温度为25ħ的环境下生长1周,蛋白质谱具有明显差异,随着时间的推移,即使在含有相同培养基的琼脂平板上,也会对蛋白质谱产生影响,特别是蛋白质峰的相对高度[5]㊂丝状真菌的孢子和菌丝体具有不同的生物相和蛋白质图谱,在采集固体培养基上的丝状真菌样品时,二者往往被同时采集,进而影响鉴定结果㊂布鲁克系统建议用液体培养基培养丝状真菌,因为液体培养基中丝状真菌分离物主要是菌丝体,可以提高蛋白质谱质量㊂但由于液体培养基存在雾化孢子污染风险和无法可视化宏观和微观表型特征的缺点,临床实验室仍然以直接从固体培养基中收集真菌样品为主,以简化样品制备过程并节省时间㊂对于酵母菌,使用不同的培养基同样会对MA L-D I-T O F M S技术的鉴定对数评分值有明显影响[6]㊂一般而言,采用MA L D I-T O F M S技术分析的菌落,应选择已经经过所用检测系统制造商验证的培养基,以提高鉴定结果与数据库的匹配度,保证鉴定质量㊂总之,用户应了解制造商推荐的培养基优㊁缺点及其孵育条件,以提高MA L D I-T O F M S技术鉴定真菌的性能㊂2标本制备对MA L D I-T O F M S技术鉴定真菌的影响对MA L D I-T O F M S技术来说,标本制备及合适的蛋白质提取方法是影响鉴定灵敏度㊁分辨率和再现性的关键步骤㊂标本制备不当会导致较低的峰分辨率,影响鉴定结果㊂基于MA L D I-T O F M S技术的丝状真菌鉴定在过去几年受到限制,主要原因是缺乏高效的样品制备方法来保证高质量的蛋白质谱㊂与细菌不同,真菌可以通过简单的预处理方法快速准确地获得鉴定结果,而真菌的传统预处理方法,特别是丝状真菌则更为复杂,涉及乙醇㊁甲酸㊁乙腈等试剂和离心等提取过程,不同丝状真菌蛋白质提取方法对质谱鉴定结果的影响差异较大㊂HO N S I G等[7]根据MA L D I-T O F M S技术制造商提供的3种不同标本制备方法,比较各自在鉴定丝状真菌物种水平的识别率,结果显示,液体培养有效识别率最高(76.1%),优于细胞裂解法(62.0%)和完整细胞法(48.9%)㊂除制造商推荐的样本制备方法外,在临床工作中,广大科研人员也不断探索和开发出了许多新的样本制备方法㊂P E N G等[8]描述了一种更方便㊁省时㊁省试剂㊁灵敏的预处理方法:甲酸夹层法㊂使用安图生物质谱仪的A u t o f M S系统时,甲酸夹层法能够实现93.9%的物种级鉴定;当临床库㊁科研库㊁内部数据库结合使用时,使用梅里埃公司的V I T E K M S系统能实现97.3%的物种级鉴定㊂N I N G等[9]创建了两种快速提取丝状真菌蛋白质的方法:氧化锆-二氧化硅磁珠法(Z S B)和聚焦超声法(F U S),并使用V I T E K M S系统评估了两种方法的识别精度㊂按制造商推荐的常规蛋白质提取方法, V I T E K M S系统物种级正确鉴定率为76.42%,Z S B 和F U S物种级正确鉴定率分别为79.67%和76.42%㊂按制造商推荐的常规蛋白质提取程序,每个丝状真菌预处理时间至少需要30m i n,而Z S B和F U S分别将每份标本的操作时间减少至7m i n或5m i n,每个额外的菌株只需多出几秒,从而节省了大量时间㊂通常,实验技术人员采用的预处理方法和策略基于他们的经验或实验室标准操作规程,但这种模式可能会导致反复鉴定,给日常工作带来负担,造成时间㊁人员㊁耗材等成本的浪费㊂因此,实验人员需开拓思维,根据情况选择适当的分析前预处理方法,提高MA L D I-T O F M S技术的鉴定效率和准确率㊂3数据库对MA L D I-T O F M S技术鉴定真菌的影响微生物数据库是MA L D I-T O F M S技术鉴定的关键组成部分,菌株识别的准确率主要依靠菌株数据库的功能,尤其是新物种的鉴定对其依赖性更强㊂目前,在临床实验室主要的数据库有布鲁克公司的B i o-t y p e r系统㊁梅里埃公司的V I T E K M S系统和安图生物公司的A u t o f M S系统等㊂现有的数据库均不够完善,临床真菌的鉴定准确率在不同系统之间存在一定差异㊂有研究对各数据库中存在的菌株进行了评价,对于丝状真菌,B i o t y p e r系统进行种㊁属或复合物的鉴定准确率为76.7%,高于V I T E K M S系统的50.0%;对于酵母菌,B i o t y p e r系统的鉴定准确率为82.9%,低于V I T E K M S系统的93.3%㊂对于数据库中不存在的真菌,V I T E K M S系统比B i o t y p e r系统给出了更多的错误识别[10]㊂还有相似的研究也显示,B i o t y p e r系统对酵母菌株物种水平的鉴定率稍逊于V I T E K M S系统[11]㊂最近有研究评估了3种不同的MA L D I-T O F M S系统在鉴定临床丝状真菌方面㊃5012㊃检验医学与临床2023年7月第20卷第14期 L a b M e d C l i n,J u l y2023,V o l.20,N o.14Copyright©博看网. All Rights Reserved.的表现,V I T E K M S系统最具有优势,96.0%菌株鉴定到物种水平,98.4%到属水平;B i o t y p e r系统42.1%菌株鉴定到物种水平,42.9%到属水平;A u t o f M S系统58.7%菌株鉴定到物种水平,60.3%到属水平[12]㊂在鉴定不同物种复合物内的酵母分离物方面, A u t o f M S系统比V I T E K M S系统具有更高的鉴定准确性,在系统密切相关的物种复合物中鉴定不太常见的物种方面,V I T E K M S系统的鉴定能力仍有待提高[13]㊂性能识别方面,A u t o f M S系统与B i o t y p e r系统相当,但A u t o f M S系统在数据库中提供了更多的真菌物种级结果,测试时间大约是B i o t y p e r系统的一半[14],在临床微生物实验室中,能够提供更高的通量㊂在数据库的构建过程中,其覆盖范围㊁类型等至关重要㊂目前有很多机构致力于构建内部参考数据库,以提高MA L D I-T O F M S技术对罕见的㊁新兴的或地方性真菌的识别率㊂MA L D I-T O F M S技术自建库的构建需用数据库中没有的真菌分离株或物种不断扩展和更新,并用其他数据库或者方法相互验证㊂目前由于各实验室相对独立,不同自建库不能够共享,因此,开发可在线获取的参考频谱数据库十分必要㊂在线获取的参考频谱数据库的开发,能促进不同实验室间进行相互验证和补充,达到资源优化和共享,提高MA L D I-T O F M S技术的诊断效率和拓宽应用范围㊂4MA L D I-T O F M S技术在检测抗真菌药敏试验(A F S T)方面的应用现阶段,根据美国临床和实验室标准协会(C L S I)和欧洲抗菌药物敏感试验委员会的指南,A F S T的参考方法为肉汤稀释法,但这种方法需要较长的时间,会延误患者及时抗真菌治疗的时间㊂基于MA L D I-T O F M S技术,对A F S T进行了两种相对较新的尝试:第一种是基于暴露在不同浓度抗真菌药物时真菌图谱的变化,根据得到的复合相关指数(C C I)作出推断[15]㊂第二种是基于MA L D I B i o t y-p e r系统快速测定抗菌药物敏感性试验(M B T A S-T R A),针对不同浓度的抗真菌剂确定感染因子的生长状况,并与提供相对生长比(R G)的无药物对照组比较,通过定义临界值且根据相应抗真菌浓度的R G,将病原体的生长量分类为易感或耐药[16]㊂基于MA L D I-T O F M S技术的A F S T,目前没有广泛应用于临床真菌性疾病的诊断,各实验室仍处于探索研究阶段,一些研究通过C C I获得了很高的诊断值,但这些结果具有一定差异[17-18]㊂V A T A N S H-E N A S S A N等[16]通过采用M B T A S T R A和C L S I指南推荐的肉汤稀释法,比较分析了对卡泊芬净耐药的白色念珠菌和光滑念珠菌的检测数据,验证了M B T A S T R A方法,结果显示,与肉汤稀释法比较,白色念珠菌M B T A S T R A检测的灵敏度和特异度均为100.0%;光滑念珠菌M B T A S T R A检测的灵敏度㊁特异度和有效性分别为94.0%㊁80.0%和95.0%[16]㊂K N O L L等[19]通过M e t a分析,系统评价了基于MA L D I-T O F M S技术检测酵母菌和丝状真菌对唑类和棘白菌素类抗真菌药物的耐药性,与肉汤稀释法比较,基于MA L D I-T O F M S技术的耐药性检测具有91.1%的灵敏度和95.1%的特异度㊂M B T A S T R A 方法的总体灵敏度达到96.0%,优于C C I的85.3%,两种方法的特异度相似,分别为93.2%和94.2%[19]㊂A F S T模式在物种之间可能有较大差异,因此,快速㊁可靠地鉴定真菌耐药性对患者管理及改善预后至关重要[20]㊂A F S T常用方法的周转时间为24~ 48h,M B T A S T R A周转时间在8h以内[19]㊂因此,基于MA L D I-T O F M S技术的A F S T,有望成为临床实验室快速准确检测真菌耐药性的一种方法㊂5展望尽管MA L D I-T O F M S技术在临床真菌诊断领域存在一定局限,但在过去几年中,MA L D I-T O F M S 技术具有的易用性㊁低耗时㊁低成本及高通量等特点改变了临床实践,为临床实验室诊断真菌感染做出了贡献㊂由于新病原体的出现及不断变化的微生物分类学的推动,未来的研究需进一步改进和扩展真菌参考数据库,优化培养和提取蛋白质的标准化操作程序,加强MA L D I-T O F M S技术在真菌药敏试验㊁真菌菌株分型等方面的应用,实时探索临床真菌物种的演变多样性㊂总之,MA L D I-T O F M S技术的发展为真菌病的临床和治疗管理提供了新方向,为个性化医疗提供了巨大潜力㊂参考文献[1]G O N Z A L E Z-V I C E N T M,R AMO S-AMA D O R J T.F u n-g a l i n f e c t i o n i n i mm u n o c o m p r o m i s e d c h i l d r e n[J].R e vI b e r o a m M i c o l,2021,38(2):75-83.[2]S A V A G E R D,F OW L E R R A,R I S HU A H,e t a l.T h ee f f e c t o f i n a d e q u a t e i n i t i a l e m p i r i c a n t i m i c r o b i a l t r e a t m e n to n m o r t a l i t y i n c r i t i c a l l y i l l p a t i e n t s w i t h b l o o d s t r e a m i n-f e c t i o n s:a m u l t i-c e n t r e r e t r o s p e c t i v e c o h o r t s t u d y[J].P L o S O n e,2016,11(5):e0154944.[3]HO U T Y,C H I A N G-N I C,T E N G S H.C u r r e n t s t a t u s o fMA L D I-T O F m a s s s p e c t r o m e t r y i n c l i n i c a l m i c r o b i o l o g y[J].J F o o d D r u g A n a l,2019,27(2):404-414. 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All Rights Reserved.t o u s f u n g a l g r o w t h a n d s a m p l e p r e p a r a t i o n a i m e d a t m o r e c o n s i s t e n t MA L D I-T O F M S s p e c t r a d e s p i t e v a r i a t i o n s i ng r o w t h r a t e s a n d/o r i n c u b a t i o n t i m e s[J].B i o l M e t h o d sP r o t o c,2019,4(1):b p z003.[6]WA N G H,L I Y,F A N X,e t a l.E v a l u a t i o n o f b r u k e r b i o-t y p e r a n d v i t e k M S f o r t h e i d e n t i f i c a t i o n o f c a n d i d a t r o p i-c a l i s o n d i f f e r e n t s o l i d c u l t u r e m e d i a[J].J M i c r o b i o l I m-m u n o l I n f e c t,2019,52(4):604-611.[7]H O N S I G C,S E L I T S C H B,H O L L E N S T E I N M,e t a l.I d e n-t i f i c a t i o n o f f i l a m e n t o u s f u n g i b y M A L D I-T O F m a s s s p e c-t r o m e t r y:e v a l u a t i o n o f t h r e e d i f f e r e n t s a m p l e p r e p a r a t i o n m e t h o d s a n d v a l i d a t i o n o f a n i n-h o u s e s p e c i e s c u t o f f[J].JF u n g i,2022,8(4):383.[8]P E N G D,Z HU X,L I U Y,e t a l.E v a l u a t i o n o f f o r m i c a c i d s a n d w i c h(F A-s a n d w i c h):a p r e t r e a t m e n t m e t h o d f o r f i l a-m e n t o u s f u n g i,f o r t h e i d e n t i f i c a t i o n o f c l i n i c a l l y r e l e v a n t f i l a m e n t o u s f u n g i b y t w o MA L D I-T O F M S s y s t e m s[J].M e d M y c o l,2022,60(4):m y a c018.[9]N I N G Y T,Y A N G W H,Z HA N G W,e t a l.D e v e l o p i n g t w o r a p i d p r o t e i n e x t r a c t i o n m e t h o d s u s i n g f o c u s e d-u l t r a-s o n i c a t i o n a n d z i r c o n i a-s i l i c a b e a d s f o r f i l a m e n t o u s f u n g i i d e n t i f i c a t i o n b y MA L D I-T O F M S[J].F r o n t C e l l I n f e c tM i c r o b i o l,2021,11:687240.[10]L E V E S Q U E S,D U F R E S N E P J,S O U A L H I N E H,e t a l.A s i d e b y s i d e c o m p a r i s o n o f b r u k e r b i o t y p e r a n d V I T E KM S:u t i l i t y o f MA L D I-T O F M S t e c h n o l o g y f o r m i c r o o r-g a n i s m i d e n t i f i c a t i o n i n a p u b l i c h e a l t h r e f e r e n c e l a b o r a t o-r y[J].P L o S O n e,2015,10(12):e0144878.[11]P O R T E L,G A R C I A P,B R A U N S,e t a l.H e a d-t o-h e a dc o m p a r i s o n o f M i c r o f l e x L T a nd V i te k M S s y s t e m sf o rr o u t i n e i d e n t i f i c a t i o n o f m i c r o o r g a n i s m s b y MA L D I-T O Fm a s s s p e c t r o m e t r y i n c h i l e[J].P L o S O n e,2017,12(5): e0177929.[12]S U N Y,G U O J,C H E N R,e t a l.M u l t i c e n t e r e v a l u a t i o n o f t h r e e d i f f e r e n t MA L D I-T O F M S s y s t e m s f o r i d e n t i f i c a-t i o n o f c l i n i c a l l y r e l e v a n t f i l a m e n t o u s f u n g i[J].M e d M y-c o l,2021,59(1):81-86.[13]Y I Q,X I A O M,F A N X,e t a l.E v a l u a t i o n o f A u t o f M S 1000a nd V i te k M S MA L D I-T O F M S s y s t e m i n i d e n t if i-c a t i o n o f c l o s e l y-r e l a t ed ye a s t s c a u s i n g i n v a s i v ef u ng a ld i se a s e s[J].F r o n t C e l l I nf e c t M i c r o b i o l,2021,11: 628828.[14]P A R K J H,J A N G Y,Y O O N I,e t a l.C o m p a r i s o n o f A u-t o f m s1000a n d b r u k e r b i o t y p e r MA L D I-T O F M S p l a t-f o r m s f o r r o u t i n e i d e n t i f i c a t i o n o f c l i n i c a l m i c r o o r g a n i s m s[J].B i o m e d R e s I n t,2021,2021:6667623.[15]P A U L S,S I N G H P,A S S,e t a l.R a p i d d e t e c t i o n o f f l u-c o n a z o l e r e s i s t a n c e i n c a nd i d a t r o p i c a l i s b y MA L D I-T O FM S[J].M e d M y c o l,2018,56(2):234-241. 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MALDI-TOF MS在人工关节置换术后病原菌快速鉴定中的价值
文章编号：1673-8640（2021）06-0656-06 中图分类号：R446.5 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2021.06.017 MALDI-TOF MS在人工关节置换术后病原菌快速鉴定中的价值丁毅伟，韩志海（解放军总医院第六医学中心呼吸与危重症医学科，北京 100084）摘要：目的了解基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）联合HB&L微生物培养系统（简称HB&L系统）在人工关节置换术后病原菌快速鉴定中的价值。
方法收集104例人工关节置换术后患者关节液样本，分别接种于血培养瓶及常规培养琼脂平板，将阳性培养物分别进行2种直接MALDI-TOF MS 鉴定、常规MALDI-TOF MS鉴定和平板培养鉴定，比较4种方法鉴定结果及鉴定时间。
结果直接和常规MALDI-TOF MS均检测到84.8%（84/99）的阳性结果，但平板培养仅检测到60.6%（60/99）的阳性结果。
HB&L系统处理后直接MALDI-TOF MS鉴定革兰阳性菌和革兰阴性菌，检出率分别为86.9%和91.9%，高于分离胶富集细菌后直接MALDI-TOF MS（78.3%和83.8%）和平板培养（70.1%和67.6%）。
HB&L系统处理后直接MALDI-TOF MS鉴定的阳性结果中，金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌检出率较高。
HB&L系统处理后直接MALDI-TOF MS的鉴定时间为5～14 h，低于常规MALDI-TOF MS（45.2 h）和平板培养（54.3 h）。
结论与常规培养比较，HB&L系统处理后直接MALDI-TOF MS鉴定病原菌用时短，且具有一定的准确率，对人工关节置换术后病原菌的快速诊断有一定价值。
关键词：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱；人工关节置换；关节液；病原菌；快速鉴定Identification of MALDI-TOF MS in determining the bacteria from artificial joint replacement infection DING Yiwei，HAN Zhihai.（Department of Respiratory and Critical Care Medicine，the Sixth Medical Center of Chinese People's Liberation Army General Hospital，Beijing 100084，China）Abstract：Objective To study the role of matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry（MALDI-TOF MS） combined with HB&L system to rapidly determine the bacteria from artificial joint replacement infection. Methods The synovial fluid samples of 104 patients with artificial joint replacement infection were collected and inoculated into blood culture flasks and conventional culture agar plates. Positive blood cultures were directly or routinely identified by MALDI-TOF MS，and the type and time of identification were recorded.Results Both direct and conventional MALDI-TOF MS determined a positive result of 84.8%（84/99），but only60.6%（60/99） was isolated by plate culture. The determination rates of Gram-positive and Gram-negative bacteriaby HB&L direct MALDI-TOF MS were 86.9% and 91.9%，respectively，which were higher than those by gel direct MALDI-TOF MS（78.3% and 83.8%） and plate culture（70.1% and 67.6%）. Among the positive results of HB&L direct MALDI-TOF MS group，the determination rates of Staphylococcus aureus，Staphylococcus epidermidis，Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae were high. The identification time of HB&L direct MALDI-TOF MS was shortened to 5-14 h，which was different from 45.2 h of conventional MALDI-TOF MS or 54.3 h of conventional culture. Conclusions Compared with conventional culture，HB&L direct MALDI-TOF MS shortens the time for microbial identification and has an accuracy rate，which provides a reference for the rapid diagnosis of pathogens in artificial joint replacement.Key words：Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry；Artificial joint replacement；Synovial fluid；Rapid identification基金项目：军队后勤科研面上项目（CLB20J019）；解放军总医院第六医学中心创新培育基金项目（CXPY201915）作者简介：丁毅伟，女，1981年生，学士，主管技师，主要从事病原微生物学研究。
(完整版)MALDI-TOFMS病原体鉴定质量保证专家共识
MALDI－TOF MS病原体鉴定质量保证专家共识基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption ionization time－of－flight mass spectrometry, MALDI－TOF MS)作为一种新兴的软电离质谱技术，由于其具有快速、准确、灵敏、自动化及高通量等检测特点，已成为一项革命性病原体快速鉴定技术被用于临床微生物实验室，并将逐步取代常规病原体生化鉴定方法。
任何新兴技术应用于临床都需要建立规范的质量保证体系，以确保检测质量。
本专家共识将对开展MALDI－TOF MS用于病原体鉴定的设施与安全要求、人员培训与能力评估、MALDI－TOF MS病原体鉴定过程的质量控制、检验程序性能验证等进行建议。
设施与安全要求1．风险评估：拟开展MALDI－TOF MS病原体检测的实验室需在风险评估基础上建立有效的安全防护策略，包括设备的使用、化学试剂的安全使用和处理丢弃、感染性病原体和被污染材料的处置等。
风险评估包含确定工作流程和鉴定步骤中可能发生的化学和生物危害，以及降低风险的方法。
2．安全防护：任何操作临床病原体样本或病原体的实验活动至少需要在二级生物安全实验室(BSL－2)中进行。
MALDI－TOF MS应安置在二级生物安全实验室内，同时使用MALDI－TOF MS检测临床病原体样本时除了需考虑生物危害的风险外还要注意化学试剂的潜在风险。
人员培训与能力评估各实验室应具备MALDI－TOF MS检测过程中涉及的所有操作人员的初次培训和定期能力评估的程序文件，对涉及的所有操作人员应进行初次和定期(至少6个月一次)的培训以及能力评估，培训考核需遵循制造商的使用手册或实验室的标准操作规程，培训的内容包括原理方法、信息技术、仪器维护、结果报告与解释等方面。
此外，还应采用一组形态和生化特征典型的菌株对培训者进行人员比对和/或考核，以确保所有操作者鉴定结果的一致性。
质谱技术在临床微生物实验室的应用进展
质谱技术在临床微生物实验室的应用进展韩志勇;刘媛媛【摘要】基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）技术是一项能够分析多种组分（如蛋白质、脂类、脂多糖等）的技术，其以操作简便、自动化、快速和高通量的优点成为临床微生物检验的新方法。
MALDI-TOF-MS技术在细菌、真菌和厌氧菌鉴定中较其他常用微生物检验方法的准确率高，且均可鉴定到种。
但在亲缘关系较近的链球菌属和嗜麦芽窄食单胞菌中的鉴定准确性较低，仍需进一步探索研究。
MALDI-TOF-MS技术对金黄色葡萄球菌、产碳青霉烯酶细菌和鲍曼不动杆菌等的耐药性筛查具有较高的准确率，但对肠杆菌科耐药性的检测效果较差，仍需深入研究。
随着细菌数据库及标准菌株图谱的完善，MALDI-TOF-MS技术必将在微生物鉴定、分型和耐药监测等方面发挥更大作用。
【期刊名称】《实用检验医师杂志》【年(卷),期】2015(000)003【总页数】5页(P182-186)【关键词】基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱;细菌;真菌;厌氧菌;耐药性;菌种【作者】韩志勇;刘媛媛【作者单位】300280 天津市，天津海滨人民医院检验科;300280 天津市，天津海滨人民医院检验科【正文语种】中文目前，在医院临床微生物实验室鉴定细菌主要依赖于传统的生物化学反应、分子生物学和形态学等方法，培养分纯出单个细菌菌落的鉴定耗时长，即使使用自动化细菌鉴定仪器，在时间上还是不能满足临床对检测结果时效性的要求；而基于分子生物学方法进行微生物鉴定大大地提高了灵敏度和时效性，但对工作人员技术要求高，检测成本高，只能针对某些特定菌株，还是难以满足临床常规要求。
自80年代初，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption ionization－time of flight－mass spectrometry，MALDI－TOF－MS）技术就已经成为一个用于研究与分析蛋白质特征的有利工具，以其操作简便、自动化、快速、高通量等优势受到青睐，并开始应用于医院微生物实验室，成为了一种新的微生物鉴定方法。
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MALDI－TOF MS病原体鉴定质量保证专家共识基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption ionization time－of－flight mass spectrometry, MALDI－TOF MS)作为一种新兴的软电离质谱技术，由于其具有快速、准确、灵敏、自动化及高通量等检测特点，已成为一项革命性病原体快速鉴定技术被用于临床微生物实验室，并将逐步取代常规病原体生化鉴定方法。
任何新兴技术应用于临床都需要建立规范的质量保证体系，以确保检测质量。
本专家共识将对开展MALDI－TOF MS用于病原体鉴定的设施与安全要求、人员培训与能力评估、MALDI－TOF MS病原体鉴定过程的质量控制、检验程序性能验证等进行建议。
设施与安全要求1．风险评估：拟开展MALDI－TOF MS病原体检测的实验室需在风险评估基础上建立有效的安全防护策略，包括设备的使用、化学试剂的安全使用和处理丢弃、感染性病原体和被污染材料的处置等。
风险评估包含确定工作流程和鉴定步骤中可能发生的化学和生物危害，以及降低风险的方法。
2．安全防护：任何操作临床病原体样本或病原体的实验活动至少需要在二级生物安全实验室(BSL－2)中进行。
MALDI－TOF MS应安置在二级生物安全实验室内，同时使用MALDI－TOF MS检测临床病原体样本时除了需考虑生物危害的风险外还要注意化学试剂的潜在风险。
人员培训与能力评估各实验室应具备MALDI－TOF MS检测过程中涉及的所有操作人员的初次培训和定期能力评估的程序文件，对涉及的所有操作人员应进行初次和定期(至少6个月一次)的培训以及能力评估，培训考核需遵循制造商的使用手册或实验室的标准操作规程，培训的内容包括原理方法、信息技术、仪器维护、结果报告与解释等方面。
此外，还应采用一组形态和生化特征典型的菌株对培训者进行人员比对和/或考核，以确保所有操作者鉴定结果的一致性。
通过培训，要求每位操作人员对每种病原体的鉴定结果必须达到本实验室设定的每种病原体的最小结果阈值。
保存所有培训、考核和能力评估记录。
建议1 对于临床常见细菌(非高致病)，操作人员的个人防护应按标准预防要求，其病原体分离培养、蛋白提取及靶板点样时应在生物安全柜内进行，点样后的靶板转移至MALDI－TOF MS，分析过程中也需注意生物安全防护；对潜在的含生物危害二类及以上的高致病病原体如布鲁菌、炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌等的临床样本，实验室人员应请示医院感染管理部门并尽量避免培养检测，必要情况下需要在生物安全柜内采用经灭活程序灭活后再进行质谱分析。
建议2 前期的样本处理过程中将会使用一些有机溶剂如乙醇、甲酸、乙腈、三氟乙酸和基质液等，这些溶剂具有腐蚀性或可燃性，可引起人体皮肤黏膜腐蚀、呼吸及循环系统功能紊乱、多脏器损伤，因此在实验的过程中使用此类有机溶剂试剂时建议有一个良好的通风环境，同时需加强操作人员的呼吸道、皮肤黏膜尤其是眼面部的个人防护。
MALDI－TOF MS病原体鉴定过程的质量保证质量保证可确保MALDI－TOF MS病原体鉴定结果的准确性和及时性，其内容涵盖分析前、分析中和分析后。
(一)分析前1．菌株准备：所有菌株均采用新鲜培养(16～48 h)的单个菌落，推荐细菌采用血琼脂平板培养，真菌采用沙保罗平板培养，冻存菌株传代两次后使用。
2．靶板点样：先将质控菌株/蛋白标准品点在靶板相应孔位，再点待测菌落。
点样时应注意菌量适当、厚度均匀，不可带有琼脂成分。
3．加基质液：点样后加入基质液，应自然凉干。
4．特殊病原体：如分枝杆菌、丝状真菌和诺卡菌等需要通过蛋白提取法进行提取前处理，包括使用甲酸、乙腈、破壁硅珠管等试剂耗材。
详细处理过程建议参考制造商提供的SOP进行操作。
5．样本准备注意事项：(1)靶板点样加入基质液后，需完全干燥形成结晶方可进行检测。
(2)靶板准备完成后，如为细菌或酵母菌，需在48 h内完成检测；如为分枝杆菌，需在4 h内完成检测；如曲霉菌等丝状真菌，需立刻完成检测。
(二)分析中一般情况下，MALDI－TOF MS检测可以得到以下几种鉴定结果：(1)高置信的鉴定结果；(2)多个鉴定结果，且每个结果的置信度相似；(3)无鉴定结果。
1．结果判断：当MALDI－TOF MS提供了高置信的结果时，无需对图谱进行检查和复核；而当出现多个鉴定结果或无鉴定时，可能出现以下问题：(1)低质量的图谱导致无鉴定结果：需检查菌株和试剂耗材的质量、仪器性能状态以及具体操作环节；(2)图谱质量较好而不符合预期的鉴定、多个鉴定结果或者无鉴定结果：应检查样本是否分纯、是否污染或数据库不包含待检菌种。
2．结果阈值：目前MALDI－TOF MS的结果阈值通常分为两种：一种以置信度为阈值，置信度>90%的单一结果为优质鉴定结果，60%～90%且具有多个鉴定结果为低分辨结果(需要补充实验进行分类)，<60%为不能鉴定；另一种则以分值为阈值，质谱评分>2分(9.5分)的结果可以鉴定到种，1.7至2.0分(9.0～9.5分)之间可以鉴定到属(需要补充实验进行分类)，<1.7分(9.0分)为不能鉴定或可能鉴定到属。
(三)分析后1．结果复核：鉴定结果的复核是分析后质量管理的重要组成部分，是保证检验结果准确的一个重要环节。
MALDI－TOF MS鉴定结果为以下病原体时，需通过相应的补充实验进行进一步鉴别。
2．仪器维护及保养：按照制造商要求定期进行维护及保养。
3．化学试剂：必须使用仪器制造商要求纯度的化学试剂。
质量控制(一)室内质控建议 3 需血清学试验确认的病原体：大肠埃希菌(疑似志贺菌属和大肠埃希菌O157)、沙门菌属等；需要其他确认试验进行鉴定的病原体：烟曲霉复合群、黄曲霉复合群、肺炎链球菌和缓症链球菌群等；需要测序鉴定或报告到群：蜡样芽孢杆菌复合群、洋葱伯克霍尔德菌复合群、鼻疽伯克霍尔德菌和类鼻疽伯克霍尔德菌、无色杆菌属、弗劳地柠檬酸杆菌复合群和阴沟肠杆菌复合群等。
实验室需按照MALDI－TOF MS制造商的推荐及相关管理指南制定质控程序。
按照制造商要求评估质量分析器、相关系统(软件和数据库)、化学试剂、靶板和用户的操作(靶板点样、有条件时萃取)。
1．质控菌株：质控阳性对照菌株种类应根据实验室拟开展的鉴定病原体范围进行选择，质控菌株可采用制造商建议的标准菌株或经实验室测序等方法确认的临床菌株。
所有质控阳性对照菌株进行质控操作时需采用新鲜培养(16～48 h)的单个菌落，推荐细菌采用血琼脂平板培养，真菌采用沙保罗平板培养，冻存菌株传代两次后使用。
2．质控操作及频率：按照制造商的SOP文件要求，在靶板清洗、基质溶液及标准品溶液配制后需每次进行阴性及阳性对照的质量控制，每次病原体鉴定时亦应如此。
3．仪器校准：检测前仪器需进行自身校准，校准通过后方可进行后续鉴定。
4．阳性对照：使用大肠埃希菌标准菌株(ATCC8739)鉴定分值必须达到制造商要求；如使用标准蛋白测试品，在分子量大于12 000以上的区域必须出现校准峰，应明确检测到m/z 13 683和16 952两个峰，确保高分子量端的准确性。
5．阴性对照：检测结果应为"No peak found"或者"无鉴定结果"。
阴性对照需使用空白试剂，用于排除可能由试剂污染或重复性靶板(阴性对照应为任意孔位)清洗不当造成的假阳性结果。
当质控结果失控或校准未通过时，应从各环节分析原因并予以纠正。
常见原因包括：质控菌株/蛋白标准品污染、使用错误的质控菌株/蛋白标准品、使用错误的试剂、操作人员的操作失误等。
记录分析失控原因并归档。
如果未发现上述明显的原因可重复测定质控菌株/蛋白标准品，结果在控，可直接进行后续检测；若不能纠正，应联系制造商采取相应的措施。
(二)室间质评建议4 其他质控菌株(标准菌株或经验证的临床菌株)，包括革兰阴性杆菌(建议采用产气肠杆菌)、革兰阳性球菌(建议采用粪肠球菌)和念珠菌(建议采用光滑念珠菌)。
室间质评：全程参加由组织方提供的室间质评计划。
当出现室间质评不符时，及时找到失控原因并纠正。
保存每次室间质评信息，包括结果反馈、纠正措施等。
无第三方组织的室间质评计划时，实验室应定期自行组织与其他实验室同类检测方法的室间比对。
检验程序性能验证MALDI－TOF MS性能验证包括准确度和精密度。
通过MALDI－TOF MS和现用方法或参考方法(如测序方法)获得的病原体鉴定结果进行比较以实现准确度验证。
准确度验证尽可能包括临床菌株而不限于是质控菌株或标准菌株。
精密度验证应包括所有主要可能存在的变量，如不同的培养基、培养条件和提取技术，通常用标准菌株或质控菌株进行精密度验证，应评估批内、批间，操作者之间以及连续几天的重复性或再现性。
在适用的情况下，还应评估病原体MALDI－TOF MS与LIS或其他仪器系统之间接口的正常运行。
(一)适用范围1．实验室引入SFDA批准的MALDI－TOF MS检测系统时，使用前应进行全面验证。
2．实验室使用MALDI－TOF MS时，若对病原体种类、试剂、数据库、分析软件和硬件等进行更换或升级以及扩大检测范围(即在原有检测病原谱基础上增加新的病原体)后，应进行部分验证。
建议5 性能验证符合要求后投入临床常规使用，在设备状态、环境、检测方法、人员等维持稳定的情况下，可采用文件和数据审核等定期评审分析系统状态，无需每年实施性能验证。
(二)验证方案MALDI－TOF MS验证所用菌株按优先顺序依次选择标准菌株、质控菌株或经参考方法确认的临床菌株，选择的菌种应尽量覆盖MALDI－TOF MS制造商公布的可鉴定菌谱，包括革兰阳性及阴性球菌、革兰阳性及阴性杆菌、厌氧菌、酵母菌、苛养菌、分枝杆菌等，同时还应覆盖验证本地区、本实验室以往检出的特殊病原体种类。
1．全面验证：准确度：常见病原体如革兰阳性及阴性球菌、革兰阳性及阴性杆菌、酵母菌每种类别至少验证30株，厌氧菌、苛养菌、分枝杆菌(如开展)、丝状真菌(如开展)每种至少10株，并覆盖本地区、本实验室检出的重要病原体。
比较MALDI－TOF MS鉴定结果与实验室现用方法或参考方法(如测序方法)之间的符合率。
精密度：选择10株代表性菌株，每天重复检测3次，连续3 d。
2．部分验证：见表1。
(三)可接受标准严格按照制造商使用说明的要求进行结果判读(参考环节控制中的结果阈值)。
1．准确度要求：验证的标准/质控菌株符合率应为100%，临床菌株的符合率应在90%以上。
2．精密度要求：菌株鉴定结果符合率应为100%。
若未能满足上述验证要求，则MALDI－TOF MS不能通过验证。
制造商和/或使用者须采取相应措施，修正后的检测系统应再次进行验证。