_皮革奶_检测方法研究进展_许晔

2 检测铬（ Ⅵ） 的方法
乌尼尔采用石墨炉原子吸收法［7］ 检测劣质奶粉中的铬 来确定奶粉中是否含有动物水解蛋白。部分劣质奶粉用动物
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江苏农业科学 2013 年第 41 卷第 2 期
水解蛋白来替代乳蛋白，该原料中铬含量较高，因此是造成婴 幼儿伤害的重要 原 因 之 一［15］ 。 测 定 铬 常 见 的 方 法 有 分 光 光 度法、原子吸收法和电化学分析法等。其中传统的分光光度 法灵敏度不够，若用火焰原子吸收，含量低时不能准确进行测 定［16］。因此，用石墨炉原子吸收分光光度法测定乳与乳制品 中的总铬，方便快捷，回收率提高，重复性好，时间缩短。而笔 者曾用 光 度 法 通 过 检 测 乳 制 品 中 的 铬 （ Ⅵ） ，用 显 色 剂 在 540 nm 中显色来确定样品中是否含有皮革水解蛋白时发现， 试验过程中遇到了很大的困难： 第一，皮革水解蛋白难以完全 溶于水； 第二，考虑到铬（ Ⅵ） 会与某些蛋白质络合，含量过低 难以检测； 第三，水解蛋白自身在 540 nm 中有吸收。如要测 定含量极低的铬离子建议可以尝试催化动力光度法［17 － 18］进 行探索。
基于比色法建立的方法用于乳及乳中 L － 羟脯氨酸含量 的测定［32］，检出限为 2． 1 μg / g，与氨基酸自动分析仪、液相色 谱仪方法相比，不需要衍生，简单有效，并且检测成本低。 3． 2 色谱法
传统的氨基酸分析技术用阳离子交换树脂分离氨基酸， 柱后茚三酮衍生化分光光度检测方法，现已逐步发展成为柱 前衍生氨基酸反相高效液相色谱分析方法。柱前衍生化高效 液相色谱法一般采用 C18 键合硅胶为固定相、极性溶剂 / 弱酸 盐缓冲液为流动 相［22］ 。 常 用 的 液 相 色 谱 柱 前 衍 生 试 剂 一 般 为 2，4 － 二硝基氯苯（ NBD － C1） 、异硫氰酸苯酯（ PITC） 、芴 甲基氯甲酸酯（ FMOC） 等［21］。 3． 2． 1 2，4 － 二硝基氟苯柱前衍生反相高效液相法 2，4 － 二硝基氟苯（ DNFB） 柱前衍生反相高效液相法［21］是检测牛乳 中掺胶原水解蛋白比较常用的方法。由于胶原水解蛋白中含 有高比例的的羟脯氨酸，由测得的羟脯氨酸的含量可以较容 易得到牛乳中掺加的胶原水解蛋白的量。又因为羟脯氨酸可 以与 DNFB 直接反应，采用柱前衍生的反相色谱法，操作简 便，而且不需要增加柱后反应系统。该法的精密度较好，回收 率较高。其缺 点 是 需 要 进 行 衍 生 处 理，并 且 水 解 时 间 长 （ 20 ～ 24 h） ，故 该 法 不 适 用 于 现 场 检 测，只 适 用 于 一 般 实 验室。 3． 2． 2 高效液相 AQC 试剂法 高效液相 AccQ － Tag 法［4］测 定 L － 羟脯氨酸尚末多见，采用新发展起来的氨基酸衍生试 剂 AQC 试剂［22］（ 6 － 氨基喹啉基 － N － 羟基琥珀酰亚氨基甲 酸酯） 柱前衍生水解样品中的 L － 羟脯氨酸，以磷酸盐缓冲溶 液、乙腈、水梯度洗脱，通过 Symmetry C18 柱，将 L － 羟脯氨酸 反应生成在 248 nm 有紫外吸收的高稳定性的脲、6 － 氨基喹 啉（ AMQ） 和 N － 羟基琥珀酸亚酰胺（ NHS） 。AQC 试剂法适 合复杂样品中的氨基酸分析，具有灵敏度高、衍生物稳定等优 点。该法不仅具有能与离子交换色谱法相媲美的精密度、准 确度，而且还不受样品基质、大量电解质、维生素和微量元素 的干扰，特别适于天然生物样品、食品及饲料中氨基酸的分 析，可作为奶 粉 及 其 他 乳 制 品 中 L － 羟 脯 氨 酸 含 量 的 检 测 方法。 3． 2． 3 离子交换色谱 － 积分脉冲安培法 由于胶原水解蛋 白中含有高比例的羟脯氨酸，由测得的羟脯氨酸含量易得到 牛乳中掺加的胶 原 水 解 蛋 白 量［24］ 。 该 方 法 是 基 于 阴 离 子 交 换分离机理，在 pH 值 12 ～ 13 条件下，氨基酸与阴离子之间 的静电吸引大小顺序是酸性氨基酸 ＞ 中性氨基酸 ＞ 碱性氨基 酸，因此洗脱顺序大体是碱性氨基酸、中性氨基酸、酸性氨基 酸，氨基酸于碱性条件下在金电极表面氧化是实现积分脉冲 安培检测的必须条件。采用离子交换色谱 － 积分脉冲安培 法［10］ 的优点是无需衍 生 处 理 可 以 直 接 分 析 牛 乳 中 掺 加 的 胶 原水解蛋白。此法的检出限为 1． 0 μg / mL，检测精度高，分析 可在 42 min 内完成，适用于一般实验室及检测部门使用。 3． 2． 4 高效液相色谱 － 质谱联用法 柱前衍生高效液相色
该方法操作简便，试剂便宜，但由于该方法用时长（ ＞ 10 h） ， 并且采用冷冻后的奶样做试验，则白色环状现象不太明显； 并 且由于目视法观察沉淀层，所以准确性差、精密度低，较适用 于大剂量定性检测，不可用于微量皮革水解蛋白的测定和定 量测定。同时试 剂 硝 酸 汞 有 毒，对 人 体 健 康 有 害，对 环 境 不 利。有待研究出另一种新型试剂代替硝酸汞沉淀乳酪蛋白， 如赵天珍等比较了 4 种蛋白质沉淀剂对奶粉和乳饮料中蛋白 质的沉淀效果［14］。 1． 2 超声乳成分分析法
乳及乳制品中含有许多促进人类生长发育及维持健康水 平所必需的营养成分，乳品工业在我国得到迅速发展。但是 一些企业为谋取暴利，在乳及乳制品中添加有机化工原料、不 合法的动植物蛋白等以提高蛋白质含量。2008 年的“三聚氰 胺”事件、2009 年国内某企业向奶粉中添加皮革水解蛋白的 事件、2011 年“皮革奶死灰复燃”消息的传出，一次次地让濒 临崩溃的乳 品 产 业 受 到 重 创［1］ 。 掺 假 乳 不 但 降 低 了 乳 产 品 的营养价值，还会引起食品安全问题，直接影响奶农、生产厂 家和消费者 的 利 益［2］ 。 添 加 皮 革 水 解 蛋 白 与 三 聚 氰 胺 都 可 以增加含氮量，但皮革水解蛋白与三聚氰胺不同，三聚氰胺并 非蛋白质，只能提高添加物的含氮量，而不能提高蛋白质含 量； 而皮革水解蛋白是蛋白质，经化学、生物技术处理，水解出 皮革中原有的蛋白（ 胶原蛋白） ，而在常规检测中，试验结果 是乳制品中总蛋白质含量，而不是乳制品中乳蛋白的实际含 量［2］ 。所以，皮革 水 解 蛋 白 添 加 在 乳 及 乳 制 品 中 更 为 隐 蔽， 检测难度更大。
在选择水解方法时，需采用安瓿真空封口，115 ℃ 、24 h 水 解处理［26］，但安瓿瓶抽真空再充氮气且需要 110 ℃ 密封水解， 操作复杂且危险。张 强 等 人 对 试 样 的 水 解 方 法 进 行 了 改 进［27］，新方法是在常压条件下在 105 ℃ 干燥箱内用 3 mol / L 硫酸溶液水解试样 16 h［28］。该方法不仅准确、操作简单、安 全，而且具有良好的准确度、精密度、检测限和定量限低等优
1 检测皮革水解蛋白的方法
1． 1 显色环法 该方法是利用蛋白质的溶解度差异检测牛奶蛋白质掺
假。硝酸汞可以沉淀除去乳酪蛋白，但水解蛋白不会被除去， 能与饱和的苦味酸溶液产生沉淀反应，并形成环状沉淀层。 正常原乳的滤液清亮，加苦味酸试剂后接触面无变化； 掺水解 蛋白粉的原乳，滤液呈半透明，略带乳青色，加苦味酸试剂后 接触面呈白色环状。掺水解蛋白粉越多，滤液越不透明，白色 沉淀越明显。最低检出量为 1 g / L［5］。
3 检测皮革水解蛋白中特有氨基酸的方法
L － 羟脯氨酸（ hydroxyproline，Hyp） 是皮革水解蛋白所特 有的氨基酸。羟脯氨酸同其他氨基酸一样，是难挥发的，在紫 外区有微弱的吸收，没有荧光基团。L － 羟脯氨酸在正常动 物水解蛋白氨基酸中的含量约 13． 4% ，在弹性蛋白中含量极 少，而在其他蛋白中则不存在。可以说胶原蛋白中含有大量 的 L － 羟脯氨酸是这类蛋白特有的性质［19］，由测定 L － 羟脯 氨酸的质量浓度再乘以相应的系数就可以得到皮革水解蛋白 的含量。测定 L － 羟 脯 氨 酸 的 方 法 主 要 有 比 色 法［20］、色 谱 法［21 － 22］、氨基酸分析仪法［23］ 等，其中以比色法最为常用，并 且操作简单，较为经济。 3． 1 比色法
超生乳成分分析仪是浙江大学研究出的一种快速乳成分 分析仪，对掺水乳成分分析的准确性比较好。掺加了水解动 物蛋白粉的乳制品的蛋白、脂肪与正常乳不同，所以可用 Foss 红外分析仪、国标法和超声乳成分分析仪进行鉴定。在蛋白 测定中，国标法与 Foss 红外法之间无显著差异，但它们与超 声法间有显著差异。随着添加蛋白粉含量的增加，3 种方法 检测的蛋白含量数据均逐渐上升，且升幅为国标法 ＞ Foss 红 外分析仪 ＞ 超声分析仪； 脂肪测定中，3 种方法间均无显著性 差异。所以超声乳成分分析仪更能显示真实的乳蛋白含量， 更为简便易行［6］。
收稿日期： 2012 － 07 － 10 基金项目： 江苏省高校自然科学基金（ 编号： 11KJB210002） 。 作者简介： 许 晔（ 1980—） ，男，江苏常州人，博士，讲师，研究方向为
食品安全。E － mail： cukexu@ gmail． com。
是检测皮革 水 解 蛋 白 中 特 有 的 L － 羟 脯 氨 酸，主 要 有 比 色 法［8］、高效液 相 色 谱 法［9］、离 子 交 换 色 谱 － 积 分 脉 冲 安 培 法［10］、高效液相色谱 － 质谱联法［11］、高效液相色谱 － 蒸发光 散射法［12］和氨基酸自动分析仪法［13］。
点。尽管这样，传统的湿法水解［28］仍然耗时较长。近几年随 着微波化学［29］ 的发展，一些研究者将目光转移至运用微波 法［30］处理实际样品，丁毅等将微波辅助水解技术运用于比色 法测定动物水解蛋白中的羟脯氨酸，将样品水解时间从 16 h 缩短到 4 ～ 8 min，实现了快速、简便、定量的目的［31］。
摘要： 在乳及乳制品中添加皮革水解蛋白，对乳品的生产和消费产生很大负面响。对乳制品中添加皮革水解 蛋白的各种不同检测分析方法进行了系统分析，以期为今后食品安全与检测提供参考。
关键词： 皮革奶； 皮革水解蛋白； 乳制品 中图分类号： TS201． 6 文献标志码： A 文章编号： 1002 － 1302（ 2013） 02 － 0251 － 03