DNA复制

DNA复制可能的三种方式
由Meselson和Stahl设计证明半保留复制的实验被誉为生物学最美丽的实验
Meselson 和Stahl的证明DNA半保留复制的实验流程
Meselson 和Stahl的实验结果
Meselson 与Stalh在 42年以后在 最初他们相 遇的一颗树 下重逢时的 合影
大肠杆菌DnaB蛋白的解链酶活性
单链DNA结合蛋白（SSB）
是一种专门与DNA单链区域结合的蛋白质，为 DNA复制、修复和重组所必需的成分。SSB本 身并没有任何酶的活性，但通过与DNA单链区 段的结合在DNA复制、修复和重组中发挥以下 几个方面的作用：（1）暂时维持DNA的单链 状态，防止互补的单链在作为复制模板之前重 新退火成双螺旋；（2）防止DNA的单链区域 自发形成链内二级结构（如链内双螺旋），以 消除它们对DNA聚合酶进行性的影响；（3） 包被DNA的单链区段，防止核酸酶对DNA单链 区域的水解；（4）刺激某些酶的活性。
参与DNA复制的主要酶 和蛋白质的结构与功能
① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ DNA聚合酶 DNA解链酶 单链结合蛋白 DNA引发酶 DNA拓扑异构酶 DNA连接酶 端聚酶（真核生物特有）
DNA聚合酶
DNA聚合酶的全名是依赖于DNA的DNA 聚合酶，就是以DNA为模板，催化DNA 合成的聚合酶。 DNA聚合酶是参与DNA复制的主要酶， 该酶的许多性质直接决定了DNA复制的 一些基本特征。
Cairns证明大肠杆菌DNA双向复制的实验
Reiji Okazaki的实验
脉冲标记——目的在于即时标记在特定 时段内合成的DNA。 脉冲追踪——目的则是要弄清那些被标 记上的DNA片段后来的去向。
Okazaki的脉冲标记和脉冲追踪的实验
Okazaki的脉冲标记和脉冲追踪的实验结果分析
在复制叉中不连续合成的DNA片段称 为冈崎片段，连续合成的DNA子链被 称为前导链，不连续合成的DNA子链 被称为后随链或滞后链。
2~5 中等 中等 × × 低
104 低 低 × × 高
0.5 高 高 √ × 高
2~4 低 高 √ × 低 高 高 √ × 中等
对阿拉伯糖CTP的敏 感性
对四环双萜的敏感性 生物功能
高
高 细胞核 DNA复制
低
低 细胞核 DNA修复
低
低 线粒体 DNA复制
高
高 细胞核 DNA复制
高
高 细胞核DNA 复制和修复
Taylor以蚕豆根尖细胞为材料、使用放射性同位 素证明真核细胞DNA也是半保留复制的实验。
某些生物DNA复制的引物序列
证明DNA复制的方向始终是5′→3′的末端终止实验
DNA复制起始区的特征
① 由多个短的重复序列组成； ② 能够被多亚基的复制起始区结合蛋白识别； ③ 通常富含AT碱基对，这有利于DNA复制起动 时的解链，因为AT碱基对含有的氢键数目低 于GC碱基对。
DNA聚合酶I的功能究竟是什么？
- 在多种需要短DNA合成的过程中起作用 - 在DNA修复中起主要作用 - 在DNA复制中，去除RNA引物，并填补随后留 下的空缺。
对DNA聚合酶I更多的认识
为什么具有3′→5′外切核酸酶?
充当校对的功能 去除复制中错配的核苷酸，然聚合酶 有机会重新合成正确配对的核苷酸


DNAP IV: 在DNA修复中起作用（在1999年发现） DNAP V:在DNA修复中起作用（在1999年发现）
DNA聚合酶III
“真正”的大肠杆菌DNA复制酶
快：1 000nt/秒/酶 进行性高： >500 000nt 酶量合适 精确 温度敏感型突变体——只能生存在允许温度（30℃）下， 当温度上升到限制温度（45℃）时，大肠杆菌难以生存。 究其原因，是因为编码聚合酶III α亚基的polC基因发生 了突变，致使该酶对温度变化极为敏感。当环境温度超 过30℃以后，就很容易变性而丧失活性，这时DNA复制 不能正常进行；而在允许温度下，该酶的活性是正常的， DNA复制也很正常。
DNA聚合酶
反应通式：
Mg2+ DNA + 引物-OH + dNTP DNA/引物-dNMP + PPi
5′ 3′ 随后的 PPi迅速水解驱动反应的进行
原核生物DNA 聚合酶 DNA pol I,II,III,IV和V 真核生物DNA 聚合酶 DNA pol α,β,γ,δ和ε以及更多
Arthur Kornberg (1957)
DNA复制
DNA复制的一般特征
① 以原来的DNA两条链作为模板，四种dNTP为 前体，还需要Mg2＋ ② 作为模板的DNA需要解链 ③ 半保留复制 ④ 需要引物——主要是RNA，少数是蛋白质 ⑤ 复制的方向始终是5′→3′ ⑥ 具有固定的起点 ⑦ 多为双向复制，少数为单向复制 ⑧ 半不连续性 ⑨ 具有高度的忠实性和进行性
DNA复制起始区的特征
电镜下真核生物DNA的多个复制叉结构
当DNA复 制从起始区 起动的时候， 起始区的 DNA双链 因发生解链 而形成叉状 结构，这样 的结构被称 为复制叉
复制叉的结构
真核生物DNA复制子
Cairns的实验
复制开始时，将大肠杆菌放在含低剂量的 [3H]-dT的培养基中培养几分钟；随后，将 细菌转移到含高剂量的[3H]-dT的培养基中 继续培养一段时间；最后，收集细胞，小 心地裂解以抽取其中的染色体DNA进行放 射自显影。如果是单向复制，自显影图谱 上银颗粒的密度应该是一端高、一端低； 如果是双向复制，则应该中间是一段低密 度的银颗粒，两侧是高密度的银颗粒。低 密度银颗粒意味着这一段DNA属于复制起 始区，高密度颗粒代表的是后来合成的。

其结构十分复杂!!!
DNA聚合酶III全酶的滑动钳夹住双螺旋DNA
DNA聚合酶I、II和III的性质和功能
性质 结构基因 分子量（kDa） 分子数/细胞 Vmax (参入的nt/秒) 3′-外切酶活性 5′-外切酶活性 进行性（nt） 突变体表现型 DNA聚合酶I polA 103 400 16~20 √ √ 3~200 UV敏感、硫酸二甲酯敏感 DNA聚合酶II polB 90 100 2~5 √ × 10 000 无 DNA聚合酶III polC 130 10 250~1000 √ × 500 000 DNA复制温度敏感型

DNA聚合酶I所具有的5′→3′聚合酶和5′→3′外切酶活性的联 合使用可导致一个具有切口的DNA分子发生切口平移。如果在 切口平移反应中加入放射性标记的dNTP，则放射性标记的核 苷酸会参入到重新合成的DNA链上，从而使DNA的一条链带 上同位素标记。
Klenow酶的晶体结构模型
DNA 聚合酶I是不错，然而….
真核细胞DNA聚合酶α、β、γ、δ和ε的性质和功能
性质 亚细胞定位 引发酶活性 亚基数目 催化亚基的相对分子 质量（kDa） 对dNTPs的Km值(κM) 内在的进行性 在PCNA存在时的进 行性 3′-外切酶活性 5′-外切酶活性 对3′,5′-ddNTP的敏感 性 DNA 聚合酶α 细胞核 有 4 160~185 DNA 聚合酶β 细胞核 无 1 40 DNA 聚合酶γ 线粒体基质 无 4 125 DNA 聚合酶δ 细胞核 无 2 125 DNA 聚合酶ε 细胞核 无 ≥4 210~230 或125~140
1969年，John Cairns和 Paula deLucia -分离到一种大肠杆菌突变株，其DNA聚合酶I活性 只有野生型的1% (polA基因突变) - 突变体对UV辐射极为敏感 - 其他一切正常 - 细胞能够分裂 结论: DNA聚合酶I不是大肠杆菌DNA复制的主要聚合酶
其他线索….

DNA复制过程中形成的正超螺旋
I型DNA拓扑异构酶的作用机理
DNA拓扑异构酶的催化的转酯反应
II型DNA拓扑异构酶的作用机制
DNA引发酶
☺是一种专门用来起动或引发DNA合成 的酶。由于DNA聚合酶本身不能起动 多聚物的合成，只能延伸已经被起动 的多聚物，因此，引发酶是DNA复制 所必需的。因为DNA复制的半不连续 性，故引发酶在前导链上只需引发一 次，而在后随链上则需用引发多次。
不可思议!!!
3′→5′外切核酸酶 5′→3′DNA聚合酶
5′→3′外切核酸酶
DNA聚合酶折叠成几个不同的结构域

Hans Klenow 使用枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶处理DNA聚 合酶I，结果得到大小两个片段，其中大片段被称为Klenow 片段或Klenow酶，它含有大小两个结构域，其中小结构域 具有3′→5′外切酶活性，大结构域具有5′→3′聚合酶活性，小 片段只有5′→3′外切酶活性。 Tom Steitz等得到了Klenow酶的晶体结构

对DNA聚合酶I的3′→5′外切酶 更多的认识
新合成的链如何在聚合酶的活性中心和3′-外 切酶活性中心切换？添加碱基还是切除碱基 ？
DNA聚合酶的聚合和校对
Klenow酶的三维结构
DNA聚合酶家族
已在大肠杆菌中发现5种不同的DNA聚合酶

DNAP I: 占聚合酶总活性的90% DNAP II: 在DNA修复中起作用(1999年得到证明) DNAP III: 主要的DNA复制酶
真核细胞DNA聚合酶
真核DNA聚合酶ζ和η在跨损伤合成中的作用
真核细胞DNA聚合酶δ由PCNA三个亚基构成的滑动钳结构
DNA解链酶
DNA解链酶是一类催化DNA双螺旋解链的酶。它几乎 参与和DNA有关的一切代谢过程，包括DNA复制、转 录、修复和重组。 任何一种DNA解链酶都能够结合DNA，这种结合与 DNA序列无关，这是解链酶作用的前提。大多数解链 酶优先结合DNA的单链区域，少数解链酶，优先结合 DNA的双链。 解链酶除了能够结合DNA以外，还能够结合NTP，并 同时具有内在的依赖于DNA的NTP酶活性。 所有的DNA解链酶都具有移位酶活性。其移位酶活性 使得它沿着被结合的DNA链单向移动，以不断地解开 DNA双链区域。