土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(1)
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(1)一、研究背景和意义土壤中的细菌群落对于土壤生态系统的基本功能起着至关重要的作用。
其中，土壤微生物的代表——细菌在土壤有机质的分解中是不可或缺的，其中包括尿素的分解。
尿素是一种有机氮化合物，很多植物都会把尿素当作氮素的主要来源。
但是，尿素很容易被细菌分解成为氨气，因此，如果过量的尿素进入土壤，细菌可能会分解尿素而产生氨气，而氨气毒性较强，可能对于周围的生态产生较大的负面影响。
因此，研究土壤中分解尿素的细菌的分离与计数，有助于深入了解尿素分解的生态机理，从而为保护土壤生态环境提供理论基础和技术支持。
二、实验目的1.利用培养基筛选土壤中分解尿素的细菌，并分离单种菌株。
2.利用计数法确定土壤中分解尿素的细菌群落的数量。
3.了解土壤中分解尿素的细菌群落的形态特征和特点。
三、实验步骤1.尿素培养基制备:将1000ml蒸馏水与20g尿素、0.5g葡萄糖、0.1g磷酸氢二钾、0.2g酵母提取物、0.1g镁硫酸钾、0.5g氯化钠、0.5g硫酸铵、15g琼脂、适量pH指示剂溶解在一起，灭菌后即可得到尿素培养基。
2.样品制备：取10g土壤样品加入稀溶液后混合均匀，再经过过滤器过滤掉大颗粒，得到土壤浸液样品。
3.单种菌株筛选：将土壤浸液样品接种到尿素培养基中，在28℃下培养2-3天。
筛选到单种菌株后，通过高倍显微镜观察菌落的形态和特点，然后进行相应的鉴定。
4.计数法：将稀溶液进行逐步稀释，然后取稀释液的适量体积接种在尿素培养基上，在28℃下培养2-3天，根据菌落数确定土壤中细菌的数量。
四、实验结果及分析通过尿素培养基的筛选，共分离出5种分解尿素的细菌，并进行了表征与鉴定。
通过计数法，成功地计算出了土壤中的分解尿素的细菌数量。
土壤中分解尿素的细菌群落种类多样，数量较多，这对于土壤中尿素分解的生态机理研究具有重要的意义。
同时，该实验的操作简单，成本低廉，适用于在实验室环境下大规模进行。
2.2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
课堂合作探究
问题导学
一、研究思路
活动与探究 1 1.寻找目的菌株的思路是什么? 提示:根据目的菌株对生存环境的要求,到相应的环境中去寻找。
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2.阅读教材第 22 页第一段旁栏中的相关内容,并思考回答下列问 题。
(1)在培养基的配方中,为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是 什么物质?琼脂的作用是什么?
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•9、要学生做的事，教职员躬亲共做；要学生学的知识，教职员躬亲共学；要学生守的规则，教职员躬亲共守。2021/9/172021/9/17Friday, September 17, 2021 •10、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。2021/9/172021/9/172021/9/179/17/2021 11:29:17 PM •11、只有让学生不把全部时间都用在学习上，而留下许多自由支配的时间，他才能顺利地学习……（这）是教育过程的逻辑。2021/9/172021/9/172021/9/17Sep-2117-Sep-21 •12、要记住，你不仅是教课的教师，也是学生的教育者，生活的导师和道德的引路人。2021/9/172021/9/172021/9/17Friday, September 17, 2021
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迁移与应用 1 用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数,在对应稀释倍 数为 106 的培养基中,得到以下几种统计结果,正确的是( )。 A.涂布了一个平板,统计的菌落数是 230 B.涂布了两个平板,统计的菌落数是 215 和 260,取平均值 238 C.涂布了三个平板,统计的菌落数分别是 21、212 和 256,取平均值 163 D.涂布了三个平板,统计的菌落数分别是 210、240 和 250,取平均 值 233
2.2 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
是
分离 只生长 尿素 尿素细
养基
细菌 菌
对照组
牛肉膏蛋 白胨培养
基
判断该培 生长多
是
养基有无 种微生 选择性 物
㈡.统计菌落数目：
1、显微镜直接计数：
利用血球计数板(血细胞计数板），在显微镜下计算一定 容积里样品中微生物的数量。
优点： 设备简单、能观察微生物的形态特征
缺点： 不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察；
DNA多聚酶链式反应（PCR）是一种在体外将少量DNA大量复制 的技术，而此项技术的实施必须使用耐高温（93℃）的DNA聚合酶。
or ?
水生栖热菌Taq
Taq酶
因为热泉温度为70～800C，淘汰了绝大多数微生物只有
Taq细菌被筛选出来。
1.启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境要求，到相应的 环境中去寻找。
每隔24h统计一次菌落数目。 选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培 养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
菌落的特征：形状、大小、隆起程度和颜色等。
三、操作提示
[一]无菌操作 1、取土用的小铁铲和盛土样的信封在使用前都需要灭菌。 2、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。 3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。 [二]做好标记 注明培养基种类、培养日期、平板培养样品 的稀释度等。 [三]规划时间
石油分解菌
纤维素分解菌 尿素分解菌
2、实验室中微生物的筛选原理：
人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，
同时抑制或阻止其他微生物生长。
3.选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微 生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培 养基。
高中生物二 微生物的培养与用 课题2 土壤中分
角顿市安康阳光实验学校课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数一、选择题1．关于土壤取样的叙述错误的是( C )A．土壤取样，应选取肥沃湿润的土壤B．先铲去表层土3 cm左右，再取样C．取样用的小铁铲和信封在使用前不用灭菌D．应在火焰旁称取土壤[解析] 取样用的小铁铲和信封在使用前需要进行灭菌处理，C错误。
2．在分解尿素菌的分离和鉴定中，对先后用到的两种培养基，叙述正确的是( B )A．加入酚红指示剂作为选择培养基，再加入唯一碳源作为鉴别培养基B．加入唯一氮源作为选择培养基，再加入酚红指示剂作为鉴别培养基C．加入唯一氮源作为鉴别培养基，再加入酚红指示剂作为选择培养基D．加入唯一碳源作为选择培养基，再加入酚酞指示剂作为鉴别培养基[解析] 在分解尿素菌的分离和鉴定中，应该先加入尿素作为分解尿素菌的唯一氮源，分解尿素菌合成的脲酶，能分解尿素，产生氨，氨呈碱性；然后加入酚红指示剂培养细菌，指示剂将变为红色。
3．需要在火焰旁操作的有( D )①土壤取样②称取土壤③稀释土壤④涂布平板⑤微生物的培养A．①②③④⑤B．②③④⑤C．③④⑤D．②③④[解析] 土壤中尿素分解菌的分离和计数中除土壤取样外，其余均需要无菌操作。
4．分离土壤中分解尿素菌的实验操作中，对于获得纯化的尿素分解菌的单菌落影响最大的是( C )A．制备浸出液的土壤取自土壤的表层B．涂布前涂布器未在酒精灯外焰上灼烧灭菌C．牛肉膏蛋白胨培养基中添加尿素作为氮源D．接种操作者的双手未用酒精棉进行消毒[解析] 制备浸出液的土壤取自土壤的表层与纯化的尿素分解菌的单菌落有关但影响不大，A错误；涂布器未在酒精灯外焰上灼烧灭菌可能会造成污染，与纯化的尿素分解菌的单菌落有关但影响不大，B错误；该培养基必须以尿素为唯一的氮源，不能使用牛肉膏蛋白胨培养基或在其中添加尿素作为氮源，该操作对实验影响最大，C正确；接种操作者的双手未用酒精棉进行消毒，可能会造成污染，但与纯化的尿素分解菌的单菌落有关但影响不大，D错误。
课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
【土壤中分解尿素的细菌的分离和计数】一、研究思路1．筛选菌株尿素是一种重要的肥，农作物不能直接吸收利用，而是首先通过土壤中的细菌将尿素分解为和CO2，才能被植物利用，土壤中的这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成。
可以利用这一特点，将其从土壤中筛选出来。
(1)实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于_____ _生长的条件(包括营养、、pH等)，同时____ _或其他微生物生长。
(2)选择培养基：在微生物学中，将允许的微生物生长，同时和其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。
2．统计菌落数目(1)常用来统计样品中数目的方法是__________ _______。
即当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中。
通过统计平板上的，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
为了保证结果准确，一般选择菌落数在的平板进行计数。
例如每克样品中的菌株数= ,C代表 ,V代表 ,M代表。
通常统计出的菌落数比活菌的实际数目。
这是因为。
因此，统计结果一般用而不是活菌数来表示。
(2) 也是测定微生物数量的常用方法。
(3)细菌的数目还可以通过法来测定。
例如，测定饮水中大肠杆菌的数量，可将的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现色，可以根据培养基上的数目，计算出水样中大肠杆菌的数量。
在该实验中至少应取___个水样。
3．设置对照(1)设置对照的主要目的是排除实验组中___________对实验结果的影响，提高实验结果的。
例如为了排除培养基是否被杂菌污染了，需用______________________________ 作为空白对照。
(2)对照实验是指除了的条件外，其他条件都的实验，其作用是比照实验组，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试的条件引起相应的结果。
二、实验设计实验设计包括对实验方案，所需仪器、材料，用具和药品，具体的以及时间安排等的综合考虑和安排。
关于土壤中某样品细菌的分离与计数的实验操作步骤如下：1．土壤取样土壤微生物约70%～80%为，主要分布在距地表的近性土壤中。
土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
3.重复组的结果是否一致
如果各位同学选取的是同一种土样，统计的结 果应该接近。如果结果相差太远，则需要从各项操 作过程中去分析、寻找可能的原因。
六、课 题 延 伸
能分解尿素的细菌的鉴定
鉴定的原理： 细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，会使培养基
的pH升高。 鉴定方法：
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指 示剂，利用此培养基进行细菌培养，观察培养基 的颜色变化。
三、设置对照
设置对照的主要目的是排除实验组中非测试 因素对实验结果的影响
A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。 一是由于土样不同，二是由于培养基污染或培养基混有 其它氮源。究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。实 验方案有两种。一种方案是可以接种其它菌种，看是否 有菌落的出现，验证培养基是否混有其它氮源。另一种 方案是将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培 养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。
1.培养物中是否有杂菌污染以及选择 培养基是否筛选出菌落
对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长， 说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的 菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选 择培养基已筛选出一些菌落。Leabharlann 2.样品的稀释操作是否成功
如果得到了2个或2个以上菌落数目在 30～300的平板，则说明稀释操作比较成 功，并能够进行菌落的计数。
碳源是葡萄糖，氮源是尿素。
2.分析该配方的培养基对微生物是否具有筛选 作用？如果有，又是如何进行筛选的？
有筛选作用，它的氮源只含有尿素，只有能合 成分解尿素的脲酶的细菌才能生长。
二、 统计菌落数目
原理
运用稀释涂布平板法来统计样品中的活 菌数。
统计菌落数目的理论依据是：当样品的稀释 度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源 于样品稀释液中的一个活菌。因此，恰当的稀释 度是成功地统计菌落数目的关键。为了保证结果 准确，通常将几个稀释度下的菌液都涂布在平板 上，培养后再选择菌落数在30 ～300的平板进行 计数。
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
一、研究思路
自然界中目的菌株筛选的依据： 根据目的菌株对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
为什么Taq细菌能从泉中被筛选出来呢？ 热泉70-80℃的高温条件淘汰了绝大多数微生物，而使耐热的 Taq细菌脱颖而出。
实验室中微生物的筛选原理：
人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH 等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。
【选择培养基】
允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其
他种类微生物生长的培养基。
【 分 析 培 养 基 】
下面是本课题将用到的培养基配方，请根据下表回答下面的问题。 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000 mL (1)在该培养基的配方中，为微生物提供碳源的是________，提供氮源的是 ________。 (2)绝大多数微生物都能利用________，但是，只有能合成脲酶的微生物才能分 解________。 (3)分析该培养基的配方，该培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，又是 如何进行选择的？ 具有。以尿素为唯一氮源的培养基可以分离到产生脲酶的微生物 _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________。
放线菌： 25∼28℃， 5∼7 d ；
霉菌：25∼28℃， 3∼4 d。 2．观察：每24h统计一次菌落数目；以“稳定菌落”为观察对象。
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
(4)计数：当菌落数目稳定时，取同一 稀释度 下的3个平 板进行计数，求出 平均值 ，并根据所对应的 稀释度计算出 样品中细菌的数目
2．菌种鉴定 (1)原理：分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解为氨， 使培养基的碱性 增强。 (2)方法：在以 尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示 剂培养细菌，若指示剂变 红 ，可确定该种细菌能够分解尿
圆褐固氮菌生活于土壤中，能以氮气作为氮源。请探 讨、交流实验室分离圆褐固氮菌的方法。
提示：配制无氮培养基作为选择培养基。
[跟随名师·解疑难] 1．选择培养基的类型及作用 (1)在培养基中加入某种化学物质。如加入青霉素可以 分离出酵母菌和霉菌；加入高浓度的食盐可得到金黄色葡 萄球菌。这里的加入指的是在培养基的培养成分的基础上 加入。 (2)改变培养基中的营养成分。如培养基中缺乏氮源时， 可以分离固氮微生物，因为非固氮微生物不能在此培养基 上生存。当培养基的某种营养成分为特定化学成分时，也 具有分离效果。 (3)改变微生物的培养条件。如将培养基放在高温环境 中培养只能得到耐高温的微生物。
[自读教材·夯基础]
1．实验设计流程
1土壤①土壤要求：富含有机质，pH接近中性且潮湿
取样
②取样部位：距地表约3～8
cm的土壤层
①稀释原因：样品的稀释程度直接影响
平板上生长的菌落数目
2样品稀释②稀释标准：选用一定稀释范围的样品
液进行培养，保证获得菌落数在 30～300 之间便于计数
①培养：不同种类的微生物，往往需要 3培养与观察不②同观的察培：养每温隔度24和h统培计养一时次间菌落数
1.测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平 板法和显微镜直接计数法。
2．稀释涂布平板法常用来统计活菌的数目， 但统计结果往往比活菌数目低。
实验03土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
专题03土壤中分解尿素的细菌的分离与计数一、实验原理：（1）土壤中的细菌之所以能分解尿素是因为它们能合成尿酶。
（2）配置以尿素为唯一氮源的培养基，能够在这个培养基上生长的细菌就是能分解尿素的细菌。
二、操作步骤：(1)土壤取样①土壤要求：酸碱度接近中性且潮湿。
②取样部位：距地表约3～8 cm的土壤层。
(2)样品的稀释测定土壤中细菌的数量，一般选用1×104、1×105和1×106倍稀释的稀释液进行平板培养，当第一次做这个实验时可以将稀释的范围放宽一点。
(3)微生物的培养与观察①培养：根据不同微生物的需要，控制适宜的培养温度和培养时间。
细菌一般在30～37 ℃的温度下培养1～2 d。
②观察a．观察方法：每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
b．记录菌落的特征：包括菌落的形状、大小和颜色等。
2、灭菌培养基：高压蒸汽灭菌法3、培养皿灭菌：干热灭菌法三、操作提示(1)无菌操作①取土样的用具在使用前都需要灭菌。
②实验操作均应在酒精灯火焰旁进行。
(2)做好标记：本实验使用的平板和试管较多，为避免混淆，最好在使用前做好标记。
例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。
(3)制定计划：对于耗时较长的生物实验，需要事先规划时间，以便提高实验效率，在操作时有条不紊。
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数操作中需注意的问题(1)为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
(2)恰当的稀释度是成功统计菌落数目的关键。
(3)为增强实验说服力与准确性，设计实验时，需要涂布至少三个平板作为重复组，目的是排除实验中偶然因素对实验结果的影响。
(4)分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近，如果相差太大，意味着操作有误，需重新实验。
(5)为防止培养时间不足导致菌落遗漏，在菌落计数时，每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
基础知பைடு நூலகம்：
（一）筛选菌株
KH2PO4
1.4g
NaH2PO4
2.1g
MgSO4`7H2O 葡萄糖
0.2g 10.0g
尿素 琼脂
选择培养基
1.0g 15.0g
培养基配方
思 考：该培养基对微生物具有选择作用吗？如果 具有，是如何进行选择的？
只有能够以尿素作为氮源的微生物才能在该培养基上生长
选择培养基：在微生物学中，将允许特定种
• 2.提示：反刍动物的瘤胃中含有大量的微生 物，其中也包括分解尿素的微生物。由于 瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后 会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生 物除了需要准备选择培养基外，还应参照 厌氧菌的培养方法进行实验设计。
分析P22实例:
你认为哪个同学的结果更接近真实值？你认 为这两位同学的实验需要改进吗？如果需要，如 何改进？
第一位同学没有重复实验(至少涂布3个平板)，结 果不具有说服力。
第二位同学有重复实验，但结果不一致（误差较 大），说明在操作过程中可能出现错误，需要重 新实验。
【例1】为了计数微生物的数量，一位同学在4
1、酚红培养基： 鉴定分解尿素的细菌。 原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增
强，PH升高→酚红指示剂，变红 2、伊红—美蓝培养基： 鉴定大肠杆菌。 原理：代谢产物与伊红-美蓝结合→菌落呈黑
色。
大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征
大肠杆菌呈黑色中心 ,有或无金属光泽
本课题知识小结:
课后练习
——利用血球计数板在显微镜下直接计数。
（2）活菌计数法——统计菌落数目
方法： 稀释涂布平板法。 原理：
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长 的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
2.2 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
（一）筛选菌株
3、选择培养基
根据微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性不
同，配制的允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他
种类微生物生长的培养基。
本课题使用的选择培养基
物理特性：固体培养基 功能特性：选择培养基
例：用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应 稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确的是
(D )
A．涂布了一个平板，统计的菌落数是230
B．涂布了两个平板，统计的菌落数是215和261，取平均值238
C．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平 均值163
【解析】稀释倍数为106，0.1 mL稀释液的菌落数的平均值为234，则每 毫升样品中菌落数就为234/0.1×106=2.34×109。
（二）统计菌落数目
2.间接计数法→活菌计数法
（1）原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一 个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
（2）常用Байду номын сангаас法：稀释涂布平板法。
葡萄糖
10.0g
不缺能乏分氮解源尿的素培，养缺基乏—氮—源分而离不固能氮生微长生物
尿素 琼脂
1.0g 15.0g
发在育无繁氧殖条，件而下受的到普抑通制培，养所基以—用—此分培离厌氧型将和上兼述性物质厌溶氧解型后微，用生蒸物馏水
养基就能够选择出分解尿素的微生物。
定容到1000mL。
例：下列能筛选出分解尿素的细菌的培养基是( A )
但A同学认为自己选用土壤样品不同导致结果不同，但是A同学没 有设计对照，拿不出让同学信服的证据。你能通过设置对照，帮助A同 学排除上述两个可能影响因素吗？
人教版高中生物选修一专题2课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数教学案含解析
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数一、研究思路1．筛选菌株(1)实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH 等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。
(2)选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。
2．统计菌落数目(1)活菌计数法：常用稀释涂布平板法。
①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
②计算公式：每克样品中的菌株数＝(C ÷V )×M 。
C ：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数。
V ：代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)。
M ：代表稀释倍数。
③统计方法：为了保证结果准确，一般设置3～5个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取其平均值。
.1.实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH 等)同时抑制或阻止其他微生物的生长。
2．在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。
3．测定微生物数量的常用方法有活菌计数法和显微镜直接计数法。
稀释涂布平板法常用来统计活菌的数目，但统计结果往往比活菌的实际数目低。
4．只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，因此可用尿素作为唯一氮源的选择培养基分离能分解尿素的细菌。
5．鉴定分解尿素细菌的方法是在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，依据是否变红进行判断。
(2)显微镜直接计数法：在显微镜下直接观察和计数微生物的数量。
3．设置对照(1)对照实验：指除了被测试的条件外，其他条件都相同的实验。
(2)主要目的：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。
二、实验设计1．土壤取样从富含有机质、酸碱度接近中性且潮湿的土壤取样。
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数在我们生活的地球上，土壤是一个极其复杂而又充满生机的生态系统。
在这个生态系统中，存在着各种各样的微生物，它们在物质循环和能量流动中发挥着至关重要的作用。
其中，分解尿素的细菌就是一类非常特殊且具有重要功能的微生物。
尿素是一种常见的含氮化合物，广泛应用于农业生产中作为氮肥。
然而，植物并不能直接吸收和利用尿素，需要经过分解尿素的细菌将其转化为氨等植物能够吸收的形式。
因此，研究土壤中分解尿素的细菌对于提高氮肥的利用率、减少环境污染以及深入了解土壤生态系统的功能都具有重要意义。
要分离和计数土壤中分解尿素的细菌，首先需要采集合适的土壤样本。
我们通常会选择那些长期施用尿素肥料的农田、花园或者草地的土壤。
在采样时，需要使用无菌的工具，如无菌铲或者无菌勺，从不同的地点和深度采集土壤，以确保样本的代表性和多样性。
将采集到的土壤放入无菌的塑料袋中，并尽快带回实验室进行处理。
回到实验室后，第一步是制备培养基。
用于分离分解尿素的细菌的培养基通常是选择培养基，其中含有尿素作为唯一的氮源。
除此之外，还需要添加碳源（如葡萄糖）、无机盐、生长因子等营养物质，以及琼脂作为凝固剂。
在制备培养基的过程中，要严格遵守无菌操作，防止杂菌的污染。
接下来，将土壤样本进行稀释。
这是一个关键的步骤，目的是将土壤中的微生物分散开来，以便能够在培养基上形成单个的菌落。
我们可以使用无菌水对土壤样本进行一系列的梯度稀释，比如 10 倍、100 倍、1000 倍等。
稀释的程度要根据土壤中微生物的数量和实验的要求来确定。
然后，将稀释后的土壤溶液涂布在制备好的培养基上。
使用无菌的涂布棒，将溶液均匀地涂布在培养基的表面。
涂布完成后，将培养基倒置放入恒温培养箱中进行培养。
培养的温度和时间要根据所分离的细菌的特性来确定，一般来说，温度在 30℃至 37℃之间，培养时间为2 至 3 天。
在培养的过程中，分解尿素的细菌会在培养基上生长并形成菌落。
土壤中分解尿素的细菌的分离与记数
尿素分解细菌的纯培养
尿素分解细菌的纯培养是分离尿素分解细菌的关键步骤， 通过选择性培养基，将土壤中的尿素分解细菌分离出来， 获得单一菌落。
培养基中添加尿素作为唯一氮源，以筛选出能够分解尿素 的细菌。同时，培养基中还应添加适量的其他营养成分， 以满足尿素分解细菌的生长需求。
尿素分解细菌的计数方法
尿素分解细菌的计数可以采用菌落计数法或细胞计数法。菌落计数法是通过培养 基上形成的菌落数量来计算尿素分解细菌的数量，而细胞计数法则采用显微镜直 接观察和计数细胞。
菌落计数法操作简便，但可能存在菌落重叠和无法区分死菌和活菌的问题。细胞 计数法虽然准确度高，但操作较为复杂，需要使用显微镜和专业的细胞计数器。
尿素分解细菌的计数实验步骤
将土壤样品稀释后涂布在含有尿素的 培养基上，然后进行培养。
对筛选出的尿素分解细菌进行纯培养， 并进行进一步的生理生化实验和分子 生物学鉴定，以确定其种类和特性。
采集时间
采样方法
选择适宜的时间采集土壤样品，通常 在春季或秋季进行，此时土壤中的微 生物活性较高。
采用多点采样法，在不同地点和深度 采集土壤样品，以获得更全面的土壤 信息。
采样地点
选择具有代表性的土壤区域进行采样， 如农田、森林、草地等，确保采集的 土壤样品具有广泛性和代表性。
分离尿素分解细菌的方法
生长特性
这些细菌在尿素培养基上 生长良好，表现出对尿素 的良好分解能力。
尿素分解细菌的记数结果
菌落计数
通过菌落计数法，对分离 出的尿素分解细菌进行数 量统计。
数量分布
在土壤的不同区域，尿素 分解细菌的数量分布存在 差异。
生长条件
部分尿素分解细菌对生长 条件较为敏感，如温度、 pH值等。
人教版高中生物选修1-2.2教材解读：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数教材内容解读要点1 筛选菌株（1）实验室中微生物的筛选应用的原理人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。
（2）选择性培养基在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。
（3）配制选择培养基的依据根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。
例如，培养基中不加入有机物可以选择培养自养微生物；培养基中不加入氮元素，可以选择培养能固氮的微生物；加入高浓度的食盐可选择培养金黄色葡萄球菌等。
要点2 统计菌落数目（1）测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法和显微镜直接计数。
（2）稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目的原理当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活细菌。
为了保证结果准确，一般设置3～5个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取平均值。
统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。
要点3 设置对照设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。
要点4 实验设计实验设计包括实验方案，所需仪器、材料、用具和药品，具体的实施步骤以及时间安排等的综合考虑和安排。
（1）土壤取样从富含有机物、潮湿、pH≈7的土壤中取样。
铲去表层土，在距地表约3～8cm的土壤层取样。
（2）制备培养基准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基。
牛肉膏蛋白胨培养基作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。
（3）微生物的培养与观察将土样以1、101、102……依次等比稀释至107稀释度，按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。
注明培养基种类、培养日期以及平板培养样品的稀释度。
将涂布好的培养皿放在30℃温度下培养。
22土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
举一反三
（1）将土壤中的固氮菌分离出来 （2）将土壤中自养微生物分离出
㈡.统计菌落数目：
1、显微镜直接计数：
利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里 样品中微生物的数量。
计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定 的面积（1 mm2）和高（0.1 mm）的计数室，在 1 mm2的面积里又被划分成25个（或16个）中格， 每个中格进一步划分成16个（或者25个）小格， 但计数室都是由400个小格组成。
计数室
②操作：将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再将 稀释的样品滴在计数板上，然后在显微镜下统计4～5 个中格中的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均 数，再按下面公式求出每毫升样品中所含的细菌数。 ③计算公式：每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细 菌数×400×10000×稀释倍数。
㈡.统计菌落数目：
二.实验的具体操作
㈠.土壤取样
从富含有机物、潮湿、 pH≈7的土壤中取 样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装 入事先准备好的信封中。 ◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用
前都要灭菌。
㈡.制备培养基：
制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。
[三]样品的稀释
◆应在火焰旁称取土壤10g。 ◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行
如果得到了如果得到了22个或个或22个以上菌落数目在个以上菌落数目在3030300300的平板的平板则说明稀释操作比较成功并能够进行菌落的计数如则说明稀释操作比较成功并能够进行菌落的计数如果果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大表明试同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大表明试验不精确验不精确需要重新实验
一、课题背景
1、尿素的利用 尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农 作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才 能被植物利用。 2、细菌利用尿素的原因
人教版生物选修一第二章第二节-土壤中分解尿素细菌的分离与计数
2、实验室中目的菌株的筛选 （1）原理：人为提供有利于目的菌株__生__长___的__条__件__，同时 __抑__制__或___阻__止___其他微生物生长。例如，加高盐，青霉素等条件。 （2）方法：利用_选___择__培养基。 概念：允许__特__定__种__类___的微生物生长，同时抑制或阻止其他种
√D.培养基中若加入氨基酸，则它可充当碳源、氮源和生长因子
2．下表是某培养基的配方，有关叙述正确的是（ ）
MgSO4·
成分 NaNO3 K2HPO4 FeSO4
琼脂 葡萄糖 H2O 青霉素
7H2O
100 0.1万
含量 3g
1g
0.01g 0.5g 15g 30g
mL 单位
A．葡萄糖能为微生物提供碳源，该微生物为自养型微生物
2、三位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀 释倍数为106的培养基中，涂布时的体积为0.1ml，得到以下两种统计结果。 ①甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。 ②乙同学在该浓度下涂布了三个平板，统计的菌落数分别为21、 212和 256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。 ③丙同学在该浓度下涂布了三个平板，统计的菌落数分别为235、 236和 237，该同学以这三个平板上菌落数的平均值236作为统计结果。 你认为哪位同学的结果更接近真实值？其他的为什么不行？
第二章 微生物的培养与应用 第2节 土壤中分解尿素细菌的分离与计数
一、课题背景
尿素[CO（NH2）2]是一种重要的农业氮肥。但是，尿素并不能 直接被农作物吸收。
只有当土壤中的细菌将尿素分解成_氨___之后，才能被植物利用。 土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成__脲__酶____。
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（一）筛选菌株
水生耐热细菌Taq
启示?
耐高温的Taq DNA聚合酶
选择培养基
在微生物学中，将允许特定种类的微生
物生长，同时抑制或阻止其他种类微生 物生长的培养基。
思考：
KH2PO4 NaH2PO4 MgSO4`7H2O 葡萄糖 尿素 琼脂 1.4g 2.1g 0.2g 10.0g 1.0g 15.0g
方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验
结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误； 如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养 基的配制有问题。 方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情 况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是 否受到污染。 小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有 说服力，对照的设置是必不可少的。
说明设置重复组的重要性。
思考书 本22页 第一位同学只涂布了一个平板，没有设臵重复组，因此 问题：
结果不具有说服力。第二位同学考虑到设臵重复组的问 题，涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与
另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误 这个实例启示学生，在设计实验时，一定要涂布至
实验设计步骤：
1、土壤取样 2、制备培养基： 3、样品的稀释 4、取样涂布 5、微生物的培养与观察
微生物的培养与观察
三.结果分析与评价
对照的培养皿在培养中无菌落 1、结合对照，分析培养物中是否有杂菌污染 生长，说明培养基没有被杂菌 以及选择培养基是否筛选出一些菌落。 污染。 牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数 2 、 是否获 得 了某 一 稀释 度 下 ， 菌 落数 目在 目明显大于选择培养基，说明 30——300的平板。在这稀释度下，是否至少 选择培养基具有选择作用。 有两个平板的菌落数相近？ 3、你统计的每克土壤中含有能分解尿素的细 菌的菌落数是多少？与其他同学的结果接近吗？ 如果差异很大，可能是什么原因引起的？
大肠杆菌呈 黑色中心 ,有或无金属光泽
本课题知识小结:
例2．在微生物群体生长规律的测定中，种内 斗争最显著最激烈的时期是 答案：C A．调整期 B．对数期 C．稳定期 D．衰亡期
解析：种内斗争是一种生态因素。种内斗争反应了种内生物 对生存空间和生活资源的争夺。在生活空间充裕，营养充足的时 候，种内斗争的程度是比较低的。随着微生物个体数目的增加， 每个个体的生存空间越来越少，营养物质也越来越少，每个个体 对生存空间和资源的争夺也越来越激烈，种内斗争就越来越激烈。 由此可知，在稳定期的种内斗争最激烈。在衰亡期，微生物的数 目已经开始减少，pH已经极度不适于微生物的生存，次级代谢产 物积累到很高的程度，这时的微生物的生存斗争主要是与无机环 境的斗争。
㈡.统计菌落数目：
1.间接计数法（活菌计数法） ⑴原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培 养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖 而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。
每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M
其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平 均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液 的体积(ml)，M代表稀释倍数。 2、显微镜直接计数：
预期结果及结论：
结果 1 有菌落 有菌落 2 有菌落 无菌落 3 无菌落 有菌落 质粒上有两种抗性基因 结果 2 结论
1
3
结论
质粒上有抗青霉素基因 质粒上有抗四环素基因
有菌落 有菌落 有菌落
选C。将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培 养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的 数目，因此，应选牛肉膏蛋白胨培养基作为对照。 对照遵循的是单一变量原则，所以与选择培养基一 样接种、培养。
分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是 ( ) ①加尿素 ②不加尿素 ③加琼脂 ④不加琼脂 ⑤加葡萄糖 ⑥不加葡萄糖 ⑦加硝酸盐 ⑧不 加硝酸盐 A．①③⑤⑦ B．②④⑥⑧ C．①③⑤⑧ D．①④⑥⑦
③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。
直接计数法、 活菌平板计数法、
比浊法（原理是在一定范围内，菌的 计数法
悬液中细胞浓度与混浊度成正比，即与光 密度成正比，菌越多，光密度越大。因此 可以借助于分光光度计，在一定波长下， 测定菌悬液的光密度，以光密度表示菌 量。）
膜过滤法（当样品中菌数很低时，可
以将一定体积的湖水海水或饮用水等样品 通过膜过滤器。然后将滤膜干燥、染色， 并经处理使膜透明，再在显微镜下计算膜 上 ( 或一定面积中 ) 的细菌数 ）
少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服 力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设臵
的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有 误，需要重新实验。
注意事项
①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30— —300的平板上进行计数。 ②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三 个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出 菌落平均数。
3.使用选择培养基的目的是（ ） C A.培养细菌 B.培养真菌 C.使需要的微生物大量繁殖 D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别 4.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是 ( ) A.CO2和N2 B.葡萄糖和NH3 D C.CO2和尿素 D.葡萄糖和尿素
5.下列说法不正确的是（ B ） A.科学家从70－80度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚 合酶 B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、 M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值 C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因 素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度 D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大， 种类最多。
思考：为什么分离不同的微生物要采用不同的稀 释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分 解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？ 是不同的。 结论：为获得不同类型的微生物，就需要按不 同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地 提供选择培养的条件。
原因：土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）
㈣.取样涂布
C
土壤中分解尿素的细菌能够合成脲酶，将尿素分解生成氨，利 用尿素中的氮合成自身有机物。培养基中只加尿素，分解尿素 的细菌能生长，其他微生物不能生长；分离微生物要用固体培 养基；土壤中分解尿素的细菌属于异养微生物，需要加葡萄糖 作为碳源。
根据实验原理和材料用具，设计实验确定细菌质粒的抗菌素 基因所抗的抗菌素的类别。 实验原理：作为运载体的质粒带有标记基因，这一标记基因 是抗菌素抗性基因，即有抗性基因的质粒可用做运载体。 材料用具：青霉素、四环素各10万单位溶液、菌种试管、灭 菌的含细菌培养基的培养皿、酒精灯、接种环、一次性注 射器、无菌水、恒温箱。 答案：方法步骤： 方法步骤： 第一步：取三个含培养基的培养皿，分别编号为1、 第一步：分组。 2、3 青霉素液 四环素液 __________________________________________________ 第二步：酒精灯上灼烧 并在酒精灯旁取菌种 ______________________， 用三只注射器分别向3个培养基中注入1 mL无菌水 第三步：接种后的培养基放在37 ℃的恒温箱中培养 __________、__________，并使之均匀分布在整个培养基 24小时 表面。 预期结果及结论： 第二步：接种。将接种环在__________，__________接种于 三个培养基。 第三步：培养。将 __________________________________________________ ______________________。
◆实验时要 对培养皿作 好标记。注 明培养基类 型、培养时 间、稀释度、 培养物等。
◆如果得到了2个或2个以上菌落数目在30——300的平板， 则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如 果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试 验不精确，需要重新实验。
㈤.微生物的培养与观察
培养不同微生物往往需要不同培养温度。 细菌：30～37℃培养1～2d 放线菌：25～28℃培养5～7d 霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。 在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。 选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止 因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
㈢.设置对照：
设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素 对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。 实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数 目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基 中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样 的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因。 原因：⑴土样不同，⑵培养基污染或操作失误(或 者是混入了其他的含氮物质)
6.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中 加入（ C ） A.较多的氮源物质 B.较多的碳源物质 C.青霉素类药物 D.高浓度食盐
C
利用生物工程生产啤酒、味精、胰岛素、酸 奶的常用菌种分别是（ ） A．酵母菌、枯草杆菌、大肠杆菌、乳酸菌 B．酵母菌、大肠杆菌、青霉菌、乳酸菌 C．酵母菌、谷氨酸棒状杆菌、大肠杆菌、乳 酸菌 D．黄色短杆菌、酵母菌、大肠杆菌、乳酸菌
测定土壤中细菌数量一般选用104、105和 106倍的稀释液进行平板培养，而测定真菌 的数量一般选用102、103和104倍稀释， 其原因是( ) C A．细菌个体小，真菌个体大 B．细菌易稀释，真菌不易稀释 C．细菌在土壤中数量比真菌多 D．随机的，没有原因
用来判断选择培养基是否起到了选择作用需要设 置的对照是( ) C A．未接种的选择培养基 B．未接种的牛肉膏蛋白胨培养基 C．接种了的牛肉膏蛋白胨培养基 D．接种了的选择培养基
二.实验的具体操作
㈠.土壤取样 ㈡.制备培养基： 制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。
[三]样品的稀释
◆应在火焰旁称取土壤10g。 ◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行