细胞龛的空间位置是干细胞命运的一个决定因素

Spatial organization within a niche as adeterminant of stem cell fateSummary哺乳动物组织中的干细胞龛往往是异质的，并且是有划分的，但是截然不同的龛位置是否会决定不同的细胞命运呢？这一点尚不清楚。

为了验证这一假设，我们采用了小鼠毛囊龛，并设计出一种新的方法：将活体内显微观察与基因谱系追踪联合起来，to re-visit the same stem cell lineages, from their exact place of origin, throughout regeneration in live mice. 利用这一方法，我们直接展示了通过毛囊龛内干细胞的位置可以预估其是否会保持未定型状态，是产生前体细胞还是定型到某个分化命运中去。

甚至，利用激光烧灼，我们揭示了毛囊干细胞对再生是可有可无的，而一般来说不参与毛发生长的表皮细胞，可以重新填充失去的干细胞群区室（compartment）并维持毛发再生。

本研究提供了关于成年组织中龛诱导性命运决定的一个总体思维模式。

在成熟组织中，干细胞龛构成了一个在空间上截然不同的微环境，包括邻近细胞，信号分子以及胞外物质（1，2）。

在哺乳动物不同组织之间的干细胞龛都表现出了解剖上的异质性和分子上的异质性（3~6）。

但是尚不清楚一个定居在龛内的干细胞，其特殊的位置是否能影响其功能。

造血干细胞在造血过程中和病理生理过程中起不同的作用，这被认为与不同的龛区室有关，比如说中央骨髓中的内皮，或脉管系统；这可能会影响它们的功能，还可能影响其长期的细胞命运（7~13）。

此外，在小肠腺中，短周期干细胞以及静止期的祖细胞群分别位于腺底部的完全不同的位置，而腺的壁上衬着前体细胞的短期扩增池，随着这些细胞到达（小肠）绒毛的表面，它们逐渐分化（14~17）。

有人提出了一个小肠龛长期动态平衡的中性竞争模型（18，19）；但是，小肠腺底部不同位置干细胞个体的短期行为尚未被确定。

皮肤中的毛囊代表着另一种高度分隔的龛，在这种龛中干细胞位于凸出部分（bulge），而被称为毛芽的一个祖细胞聚集池，正好聚集在其下方的一处不同的龛位置中（20~24）。

上述例子中这种细胞龛分隔的普遍情况产生了一个问题：在这些区室中的干细胞在功能上是否一致。

特别是，干细胞能在组织中随机地产生所有的谱系吗？龛内的精确位置是否可以产生不同的细胞命运？这些问题尚不清楚。

小鼠毛囊是一个独立自给（self-contained）的微器官，代表着在活体中检测龛行为的一个独特的系统，因为其中干细胞和分化细胞类型的位置在解剖学上截然不同，在分子上十分易于确定（20~22，25~31）（Extend Data Fig.1a,b）。

毛囊正常情况下会经历固定的再生周期，在年轻小鼠中，这个周期在大片皮肤区域中都是高度同步的，因此其静息，生长及回归期的准确时间可以被精确地预言（32）（Extended Data Fig.1c）。

在毛发生长期间，毛囊龛基底部的间质-表皮的相互交流诱导了同心七层分化层（seven concentric differentiated layers）的形成和向上扩张。

这些在里面的分化层组成了毛发的柄（hair shaft），以及支撑性的内根鞘（IRS），而被称为外根鞘（ORS）的相对不分化的外层细胞向下生长，完全包住不断延长的毛囊（29，31，33~37）（Extended Data Fig.1b）。

利用皮肤毛囊易于进入的优势，我们之前建立了能够在活体中非侵入性地观察这些过程的能力（24）。

这里，我们发展了一种新的方法，在活体小鼠的细胞龛内标记不同位置的单个干细胞，并在经过数周到数月的一段时间后，再次访问（re-visit）同样的谱系。

此外，我们利用激光诱导的细胞烧灼，测试了毛发再生是否需要毛囊干细胞，并探索了由损伤诱导的不同细胞龛之间的细胞动员是如何影响其细胞命运的。

龛的位置预测干细胞的命运为了探究龛的特定位置对干细胞命运的意义，我们利用活体成像，在单细胞精度水平上做了一个活体谱系追踪（Extended Data, Fig.2）。

为了在基因上标记凸出部分及毛芽区室的毛囊干细胞，我们使用了含有（harboring）K19-CreER，或Lgr5-CreER的小鼠，再加上Rosa-stop-tdTomato报导等位基因（16，38~41）（Extended Data Fig.2a）。

我们如前所述，使（Extended Data Fig.1a,3a）。

用K14H2BGFP和Lef1RFP作为一般的上皮及间质荧光标志物（24）小鼠在毛发周期的第一个静止期受到诱导（1st Telogen, ~P20），三天后在活体中可以观察到干细胞（~P23），而毛囊仍然是静止的（Extended Data Fig.3a）。

我们证明了龛内被标记的细胞不会离开它们的初始位置，并且没有发生因Cre重组酶漏出所致的Cre报道基因额外表达，而毛囊仍然是静止的（Extended Data Fig.3b）。

随之毛发再生的开始，我们在不同的成像期中再次访问了同样的毛囊，并记录了之前识别出的单个干细胞的谱系发展（Fig.1）。

活体谱系追踪数据分析显示在这一过程中，干细胞个体命运遵从高度刻板的形式，即与其在再生周期开始时，在龛内的起始位置相关（Fig.1b-d）。

特别是，大多数位于凸出部分的干细胞对第二个毛发周期没有贡献，或者丢失，只有一小部分凸出部分干细胞会仅在相对不那么分化的外层（ORS）中产生谱系细胞。

反过来，位于毛芽的细胞对毛囊生长有持续地贡献，它们会持续产生分化的谱系细胞（Fig.1b,c; Extended Data Fig.4, 6; Video S1）。

甚至在每个龛区室内，精确的位置也预言了不同的细胞行为。

举例来说，在凸出部分内，位于区室下半部分的干细胞更可能增殖并产生ORS谱系，相比之下位于区室上半部分的干细胞要么静止，要么产生受限的克隆，这些克隆株停留在凸出部分中（Fig.1d）。

这些数据显示特定的龛位置与干细胞的命运有直接的关联。

为了检测毛囊干细胞的长期命运，我们在两个连续的毛发周期中追踪了凸出部分的谱系。

存留在凸出部分区室的较上端部分的干细胞，在第一个细胞周期后第二个细胞周期期间仍然存留在那里（Extended Data Fig.7）。

但是，较下端部分的子代细胞则获得了ORS命运，这种细胞常常在毛囊退行并进入下一个静止期后于毛芽中发现（2nd, Telogen; Fig.1e; Extended Data Fig.8）。

这类ORS克隆在第二个细胞周期中更常产生分化的谱系，与它们在毛芽中的新位置相符合（Fig.1f）。

因此，凸出部分干细胞经过中间的ORS命运，逐步过渡到分化状态，以这种方式参与毛发的生长（Fig.1g）。

这类数据也强化了一个观念，即细胞的命运在新的再生周期开始时即已确定，取决于干细胞在龛中的特定位置。

ORS的扩张是受空间调控的我们的数据显示ORS代表了静止期凸出部分干细胞与毛芽细胞之间的一个阶段。

有趣的是，谱系追踪提示ORS克隆常常向球部（bulb, 即毛囊的最下部分，译者注）不连续扩张（Fig.2a; Extended Data Fig.8; Video S2）。

为了理解龛是如何影响ORS这种扩张模式的，我们收集了晚期生长阶段许多毛囊的时滞记录（Anagen Ⅲ-Ⅳ; Video S3 and S4）。

对这个生长阶段细胞行为的分析发现ORS经历的是一个空间上受到调控的扩张模式。

特别是，细胞的增殖被限制在一个狭窄的区域，该区域位于凸出部分下部与球部之间（Fig.2b; Video S3 and S4）。

这一“增殖区”内细胞分裂有很高的方向性，有丝分裂的纺锤体与生长长轴垂直（Fig.2b）。

这些有方向的细胞分裂可能不直接参与ORS的纵向扩张，作为其结果，这一“增殖区”与其它区域相比，细胞密度更高（Fig.2c,d; Video S3 and S4）。

对时滞影像的深入分析发现“增殖区”远侧边缘的细胞变得可以移动，并迅速向球部迁移，因此直接参与ORS向下的扩张。

这一关于细胞迁移的模式之前没有被描述过，这一模式提示细胞与细胞间高度动态的接触，并可能部分解释通过谱系追踪所观察到的ORS克隆的不连续出现（Fig.2e,f; Video S5）。

ORS 生长的这一双峰类型，以及在空间上很明确的增殖与迁移区域突出了生长期间龛对细胞的区域控制。

凸出部分细胞是可有可无的我们的谱系追踪实验提示龛是有一种功能区隔的，其中位于凸出部分下部的干细胞可能特化成ORS，而位于毛芽下部的细胞形成已分化的毛发谱系。

为了严格检验龛施加的走向毛发再生的细胞命运，我们使用了激光诱导的细胞烧灼，在毛发生长开始时（1st Telogen,~P20; Fig.3a）专门移除掉凸出部分或毛芽。

为了识别出每个目标区室，我们使用的是可以信赖的关于细胞龛的解剖学特征（24）（Extended Data Fig.1a），因为可用的基因标志物会标记那些重叠细胞群，这种细胞群横跨凸出部分及毛芽（28，40，41）。

引人注目的是，在烧灼掉凸出部分或毛芽后，细胞龛总是会恢复丢失的细胞群，重获其解剖特征，并进行毛发的再生（Fig.3b,c）。

为了确认烧灼过程的有效程度，我们在烧灼后，再次短暂访问了被烧灼的毛囊。

凸出部分或毛芽烧灼损伤毛发再生的情况是损伤范围过大所致的，损伤了整个龛及/或基质（DP），这与之前的报导相符（24，29，42）（Fig.3c）。

但是，一些这类例子提供了表皮与间质之间动态情况的关键信息。

举例来说，当表皮和间质由于激光烧灼而从物理上被分开时，龛的完全恢复与毛发的再生都受到了损伤，即使是下面还留有几微米的间质DP（Fig.3d）。

反过来，在某些毛囊中，凸出部分被烧灼掉了，毛芽可以开始生长，在凸出部分完全恢复之前环绕DP（Fig.3e）。

总之，我们的数据显示对于毛发再生而言，凸出部分及毛芽细胞群是互相可有可无的，只要表皮与间质真皮乳头之间功能上的相互作用一直维持着就可以了（Fig.3f）。

此外，这些数据提示毛芽有能力启动毛发生长，这种能力可能是独立于凸出部分输入的。

龛损伤时细胞命运改变为了探究龛恢复的细胞机制，我们在烧灼凸出部分后短暂地进行了时滞记录。

毛芽成为增生性，这一点与之前的实验相符合，之前实验发现在去掉干细胞后毛芽参与了细胞龛（恢复）（23）。

令人惊奇的是，我们观察到位于凸出部分上方（漏斗部）的远端表皮细胞也成为增生性，有些细胞迅速降入龛内（Video S6 and S7）。

这些发现唤起了一种可能性，即位于凸出部分上方的邻近表皮细胞可能参与了龛的恢复。