蓝靛果忍冬转录组SSR信息分析及其分子标记开发

园艺学报，2016，43 (3)：557–563.Acta Horticulturae Sinicadoi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0659；http：//www. ahs. ac. cn 557蓝靛果忍冬转录组SSR信息分析及其分子标记开发张庆田，李晓艳，杨义明，范书田，艾军*（中国农业科学院特产研究所，长春 130112）摘 要：利用MISA软件筛选蓝靛果忍冬（Lonicera caerulea L.）转录组测序获得的45 656条Unigene，共检测出14 841个SSR位点，分布于11 251条Unigene中，出现频率为32.51%，平均分布距离为2.58 kb。

优势重复基序为单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸，分别占总SSR位点的34.81%，42.79%和20.64%。

二核苷酸重复基元中以AG/CT为优势重复基元，占总位点27.2%，三核苷酸重复基元以AAG/CTT为主，占6.18%。

利用 Primer 3.0 共设计出 21 867 对SSR引物。

随机选择20对引物进行PCR扩增，其中8对扩增出清晰可重复的条带，5对在16个蓝靛果忍冬材料中表现出多态性。

利用UPGMA作图，将16份供试材料分为3类。

丰富的SSR多态性为蓝靛果忍冬遗传多样性分析和遗传图谱构建提供更加丰富可靠的标记选择。

关键词：蓝靛果忍冬；SSR；转录组；多态性中图分类号：S 663 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2016）03-0557-07 Analysis on SSR Information in Transcriptome and Development of Molecular Markers in Lonicera caeruleaZHANG Qing-tian，LI Xiao-yan，YANG Yi-ming，FAN Shu-tian，and AI Jun*（Institute of Special Wild Economic Animals and Plants，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Changchun 130112，China）Abstract：Forty-five thousand six hundred and fifty-six unigenes from fruit transcriptome of Lonicera caerulea L. were screened using MISA software. A total of 14 841 SSRs that occurred in 11 251 unigenes were identified，and the frequency of these SSRs was 32.51% and mean distance was 2.58 kb in the unigenes. Mononucleotide，dinucleotide and trinucleotide were major types，accounting for 34.81%，42.79% and 20.64%，respectively. The dinucleotide repeat motifs of AG/CT were the predominant repeat types（27.2%）. The trinucleotide repeat motifs of AAG/CTT were the predominant repeat types（6.18%）. Twenty-one thousand eight hundred and sixty-seven pairs of SSR primers were designed using Primer 3.0. Randomly 20 pairs of primers were selected for PCR amplification，8 amplified on clear and reproducible bands，5 in 16 different types showed polymorphism in materials. Sixteen plants were divided into 3 groups by UPGMA. Abundant SSR polymorphisms provide more reliable markers for Lonicera caerulea L.收稿日期：2015–11–09；修回日期：2016–03–04基金项目：吉林省科技发展计划项目（20100249）* 通信作者Author for correspondence（E-mail：aijun1005@）Zhang Qing-tian，Li Xiao-yan，Yang Yi-ming，Fan Shu-tian，Ai Jun.Analysis on SSR information in transcriptome and development of molecular markers in Lonicera caerulea. 558Acta Horticulturae Sinica，2016，43 (3)：557–563. fruit genetic diversity analysis and genetic map construction.Key words：Lonicera caerulea；SSR；transcriptome；polymorphism蓝靛果忍冬（Lonicera caerulea L.）别称蓝靛果、山茄子、黑瞎子果等（张启昌等，2014）。

在植物分类学上属于忍冬科（Caprifoliaceae）忍冬属（Lonicera Linn.）忍冬亚属（Subgen. Lonicera）囊管组（Sect Isika DC.）蓝果亚组（Subsect caerulea Rehd.），为落叶灌木（徐炳声和王汉津，1988），主要分布在俄罗斯、中国、日本和朝鲜，其果实富含花青素、氨基酸、儿茶酸、槲皮苷等生理活性物质，营养成分与越橘极为相似，具有很高的经济价值和营养保健价值（霍俊伟和睢薇，2009），成为继越橘、黑穗醋栗、醋栗、树莓、沙棘等之后的又一新兴小浆果树种，在俄罗斯、日本及美国等国家栽培比较普遍（霍俊伟等，2005）。

蓝靛果忍冬是一个多变异的种，关于其分类一直存在着争议。

运用RAPD 技术研究发现，蓝果亚组内存在着比较丰富的遗传多样性（霍俊伟和睢薇，2009），利用SRAP技术研究表明中国东北地区蓝靛果忍冬具有较高的遗传变异，是蓝靛果忍冬遗传多样性中心之一（孙丰，2011）。

SSR标记因其位点特异、复等位、呈共显性，在基因组序列中分布广泛等优点已经成为最为广泛的分子标记手段（Kumar et al.，2015）。

本研究中利用转录组测序获得的数据进行SSR标记的搜索，分析其分布、组成特征，并进行初步的可用性评价，以期为蓝靛果忍冬的鉴定、亲缘关系研究、核心种质的建立及种质资源利用提供参考依据。

1 材料与方法1.1转录组数据来源蓝靛果忍冬转录组数据来源于本课题组2014年对果实进行Illumina高通量深度测序的结果。

测序时采取4个发育时期（花后5、10、15和20 d）的蓝靛果忍冬果实，液氮速冻，–80 ℃保存。

RNA 提取采用改良CTAB法（宗晓娟等，2012），检测合格后委托诺禾致源生物信息科技有限公司经Illumina HiSeq TM 2500 PE125系统进行RNA-Seq转录组测序（无参），经过滤获得6.26 G的有效数据，并通过De Novo方法（Grabherr et al.，2011）组装得到45 656条Unigene，作为分析背景数据。

1.2植物材料及其DNA提取用于对所设计的引物进行筛选和可用性评价的材料为中国农业科学院特产研究所蓝靛果忍冬资源圃的16份野生优选种质资源，其中来自长白山7份（L1 ~ L7）、黑龙江勃利县7份（L8 ~ L14）和吉林汪清县2份（L15、L16）。

基因组DNA提取采用天根生化科技有限公司植物基因组DNA提取试剂盒（DP305）进行。

1.3 转录组SSR位点鉴别及SSR引物设计使用MISA程序（http：//pgrc. ikp-gatersleben. de/misa）进行SSR位点搜索，搜索标准为：二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸最少重复次数分别为6、4、3、3和3次。

用 Primer 3.0软件对SSR重复单元前后的序列进行引物设计及评价，每条SSR产生5条引物。

引物序列长度12 ~ 25 bp，预计扩增产物长度80 ~ 300 bp，GC含量40% ~ 70%，退火温度55 ~ 65 ℃，上、下游引物的退火温度值相差不大于5 ℃。

尽量避免出现发卡结构、二聚体、错配和引物二聚体等。

张庆田，李晓艳，杨义明，范书田，艾 军.蓝靛果忍冬转录组SSR 信息分析及其分子标记开发.园艺学报，2016，43 (3)：557–563. 5591.4 EST-SSR 引物筛选扩增程序为94 ℃预变性3 min ；然后进行35个循环，每个循环包括94 ℃变性40 s ，55 ℃退火40 s （退火温度因不同引物而异），72 ℃延伸1 min ；最后72 ℃延伸10 min 。

扩增产物利用8%变性聚丙烯酰胺凝胶于70 W 恒定功率电压下电泳90 min ，银染显色。

1.5 数据统计用SSR 出现频率和SSR 平均分布距离来描述EST-SSR 。

SSR 出现频率，fc （%）= c/n × 100，c 为搜索到的SSR 数量，n 为无冗余EST 数量；SSR 平均分布距离，fN = N/c ，N 为无冗余EST 数量的总碱基数。

人工读带，将电泳图上可重复的清晰条带记为“1”，同一位置无带或不易分辨的弱带计为“0”，建立原始数据矩阵。

利用软件NTsys 2.10e 对16份蓝靛果忍冬进行UPGMA 聚类分析。

2 结果与分析2.1 转录组中SSR 的分布及结构特点通过对蓝靛果忍冬转录组的45 656条Unigene （序列总长约38 210 925 bp ）序列进行搜索，发现其中11 251条Unigene 序列中含有14 841个SSR 位点，其中2 764条Unigene 含有两个或两个以上EST-SSR 位点。

总体上，SSR 发生频率为32.51%，平均每2.58 kb 出现1个SSR 。