蛋白-蛋白相互作用
研究蛋白质相互作用的九种方法，写标书用得上
研究蛋白质相互作用的九种方法，写标书用得上寒风凛冽，又到了一年一度写标书的季节，你开始准备了么？在分子机制的研究中，蛋白和蛋白之间的互作研究可以说是非常经典了，研究蛋白互作的方法有很多，今天我们来介绍九种。
1、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）CoIP其实就是两个蛋白相互的IP（免疫沉淀反应）实验，在已知蛋白B和C之间有相互作用的前提下，这种前提一般需要有一个酵母双杂实验或者Pulldown实验来作为支持。
IP就是用来验证蛋白C和蛋白B之间相互作用的。
如果在Agarose珠上的Protean A/G所结合的抗体，可以结合并拉下蛋白B，那用Western Blot即可检测出蛋白C的表达，反之亦然，通过这种相互间免疫共沉淀的实验，就可以明确地验证出，B与C之间的相互作用了。
比如这份标书：PYK2促进肝癌细胞迁移的一个新的分子机制研究：结合并磷酸化E-cadherin？（百度检索题目可查到全文）2、Pull-down实验这个实验跟免疫共沉淀实验很像，不同的是免疫共沉淀是在细胞里进行的，在众多的蛋白里，拉住A蛋白的同时,把B蛋白也给拉出来了，这还不能证明是直接的结合，很有可能是A 拉住了C，而C拉住了B，这样拉住A蛋白的同时也能把B蛋白也给拉出来。
要证明直接的结合就是Pull-down实验。
提纯所要研究的两个蛋白（一般是在BL21等菌种表达提纯），这两个蛋白带上不同的标签（提纯蛋白一般带GST或者HIIS标签），然后将他们放在同一个体系里，使用GST-beads或者NI-beads,把其中一个蛋白拉下来，用WB检测另一个蛋白的存在。
比如这份标书：恶性肿瘤的发生、发展的细胞表观遗传学机制。
（同样可以百度检索到全文）3、免疫荧光（Immunofluorescence，IF）——共定位将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。
由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。
第十一章 蛋白质的相互作用(Protein-Protein Interactions)
第十一章蛋白质的相互作用(Protein-Protein Interactions)1. 概况随着人类基因组测序工作的完成，生命科学进入到后基因组和蛋白组的时代。
因此，蛋白质的相互作用研究就显得越来越重要。
生命活动过程与蛋白质的相互作用是密不可分的，如DNA合成、基因转录激活、蛋白质翻译、细胞周期调控、信号转导等重要的生命过程均涉及到蛋白质复合体的作用。
下面以Wnt 信号通路为例对此加以说明。
Wnt信号通路是一条保守性很强的信号通路，该通路调节控制许多的生命过程，如细胞形态与功能的分化及维持、免疫、应激、细胞癌变与凋亡等等。
Wnt信号通路的作用分子包括：Wnt蛋白家族成员、卷曲(frizzled) 蛋白、Dishevelled蛋白、β-联蛋白(β-catenin)、轴蛋白(axin)、结肠癌抑制因子(APC)、糖原合酶激酶(GSK3β)、β-TrCP蛋白、淋巴增强因子(LEF)/T细胞因子(TCF) 等。
当没有Wnt信号时，GSK3β、APC、axin组成破坏复合体，使β-联蛋白被磷酸化，最终泛肽化而降解。
细胞核内，转录抑制因子Groucho家族成员与转录因子TCF形成复合物，通过HMG框结合在靶基因上，抑制靶基因的转录。
当有Wnt信号传入时，通路中的下游分子Dsh抑制了破坏复合体的作用，β-联蛋白在胞质中积累进入核内，TCF与入核的β-联蛋白结合，导致其与Groucho的结合下降，从而去除抑制作用，激活了靶基因的转录。
从上面可以看出，蛋白质的相互作用包括三个方面：⑴多亚基蛋白质的形成：即分离纯化后可形成两个或多个不同蛋白质，如血红素、色氨酸合成酶、大肠杆菌DNA合成复合酶等。
⑵多成分的蛋白质相互作用，如核孔复合体、剪接体、纺锤体等。
⑶瞬时的蛋白质相互作用，控制着一些重要的生命活动。
所有的蛋白质修饰过程都需要这类相互作用。
这类相互作用几乎参与调节细胞内基本生命活动的所有形式，如细胞生长、细胞周期、代谢途径、信号转导等。
蛋白质蛋白质相互作用
• Zheng et al. 2002
– 更多的基因组能够获得更多的功能相关蛋白结果 – 对于系统发育方法预测蛋白功能的准确性可能有基因组数量上限。
Discussion
• 参考基因组的数量确实能够影响预测能力
– 数量较少的基因组:18 or 35 – 多一些的基因组 :86 – 更多的基因组 :162
种的基因组。
这些选定的参考基因组用于其后的计算
系统发育谱的局限
➢ 仅能预测拥有全基因组序列的物种. ➢ 对于一些关键蛋白和共有蛋白中，由于在
多数物种中没有系统发育树差别，而无法 判断蛋白之间的相关性。
电子预测蛋白质相互作用方法 的评估
评估PPI 数据的重要性
• 假阴性和假阳性
– 蛋白质相互作用的动力学本质. 蛋白表达和相互作用模式在不同生 物学条件下是不同的,而目前所有的实验方法或计算方法都不能做 到动态检测或预测, 因此只能对真实存在的蛋白质相互作用, 得到 一个粗略的描述
– 把一个配体通过化学交联的方法结合在固相载 体上，让蛋白混合液流过固相载体，能够与配 体结合的分子具有较高的亲和力，通过适当的 洗脱条件将亲和力弱的分子洗脱掉，这样与配 体亲和力较高的分子就被纯化了出来。
– 纯化出的分子随后用凝胶电泳的方法分离，用 质谱的方法鉴定是什么蛋白。
Eur. J. Biochem. 270, 570-578 (2003)
Mirror Trees Method
该方法的假设前提是：相互作用的蛋白可能是共进化的。方法是：计算包含 不同物种的蛋白质家族间的进化距离，构建各自相应的进化树，在进化树之间相 似性距离的基础上，构建镜像树，然后由镜像树之间的相似性距离和蛋白质在镜 像树上的位置确定蛋白质之间的两两相互作用。
蛋白质相互作用
荧光共振能量转移 (FRET)
原理：FRET在蛋白质相互作用研究的 基本原理是分别将bait蛋白、prey蛋 白与相应的供体荧光基团(如ECFP)和 受体荧光基团(如 EYFP)融合
优点：能检测到瞬时、较弱的蛋白质 相互作用；能同时检测到两蛋白的细 胞分布和作用位点。 缺点：光谱可能存在重叠，影响实验 结果
Interaction Domain-Structral basis for protein interaction
相互作用区域是蛋白质相互作用的结构基础
1. PDZ结构域
2. LIM结构域
Interaction Domain-Structral basis for protein interaction
免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation, Co-IP)
原理：利用抗体和抗原之间 特异性的识别和结合，通过亲 和纯化，分离出抗原蛋白和单 克隆抗体。 优点：保留蛋白质的修饰 和结合状态，同时所需的样本 量较少。 缺点：Co-IP特异性较低
双分子荧光互补 ( BiFC)
原理 ：将荧光蛋白分成两个无独 立功能的片段，分别与 bait 蛋白和 prey 蛋白融合表达。 优点：能简单方便地通过观察荧 光鉴定蛋白质相互作用 缺点：不能实时反应蛋白质的结 合和分离情况。
临界值内。如果两个结构域中至少有五个原子的距离在 5 Å 之内，那么这两个结构域之间存在相互作用。
Full Atom Contact (FAC) PSIMAP 方法 Sampled Atom Contact (SAC) PSIMAP
最精确
节约时间和搜索空间
Bounding Box Contact (BBC) PSIMAP
9
蛋白质相互作用范文
蛋白质相互作用范文蛋白质相互作用有多种形式，包括蛋白质与蛋白质的结合、蛋白质与其他生物分子（如DNA、RNA和小分子化合物）的结合等。
这些相互作用通常通过非共价键（如氢键、范德华力和离子键）进行，这些键的形成和打破可以调控蛋白质的结构和功能。
蛋白质与蛋白质的相互作用是细胞内许多生物过程的核心，例如酶反应、膜传导、细胞信号转导、基因转录和翻译等。
通过相互作用，蛋白质可以形成复合物或蛋白质网络，从而协调和调控细胞内生物过程的进行。
蛋白质相互作用研究的方法有很多，包括结构生物学、蛋白质组学、生物物理学、生化学和细胞生物学等。
其中，结构生物学是其中的重要方法之一，可以通过解析蛋白质的三维结构来揭示蛋白质之间的相互作用。
结构生物学方法包括X射线晶体学、核磁共振（NMR）和电子显微镜等。
通过这些方法，研究人员可以了解蛋白质之间的空间构型和相互作用界面，从而揭示蛋白质相互作用的机制。
蛋白质相互作用的研究对于理解疾病发生和发展具有重要意义。
一些疾病的发生往往与蛋白质相互作用的失调有关，例如癌症、神经退行性疾病和免疫系统疾病等。
通过研究蛋白质相互作用在疾病中的作用，研究人员可以发现新的治疗靶点和方法，为疾病治疗提供新的思路和策略。
除了研究蛋白质相互作用在疾病中的作用外，还有一些研究致力于利用蛋白质相互作用来设计新的药物和治疗方法。
蛋白质相互作用在药物设计和开发中起着重要的作用，可以用于开发新的药物靶点、设计小分子化合物和肽类药物等。
这些方法可以高效地发现具有特定生物活性的分子，并有望成为未来创新药物研发的重要手段之一总之，蛋白质相互作用是生物学中重要的研究领域，对于理解生物过程的调控机制、疾病发生和发展以及药物研发有着重要的意义。
随着技术的不断发展，相信蛋白质相互作用的研究将为生命科学领域的进展带来更多的突破。
检测蛋白质与蛋白质之间相互作用的实验技术
一、检测蛋白质与蛋白质相互作用①技术（），，即荧光共振能量转移技术。
该技术的原理是用一种波长的光激发某种荧光蛋白后，它释放的荧光刚好又能激发另一种荧光蛋白，使其释放另一波长的荧光，如下图所示：以下图为例，若要利用检测两种蛋白是否有相互作用，需将两种蛋白的基因分别与这两种荧光蛋白的基因融合，并在细胞内表达出两种融合蛋白。
然后只需用紫外光对进行激发，并检测是否放出绿色荧光。
如果能检测到绿色荧光，那么可以说明这两种蛋白可能有相互作用；反之，则是这两种蛋白没有相互作用。
②酵母双、三杂交技术（）酵母双杂交系统主要用于考察两种蛋白是否有相互作用，其原理是典型的真核生长转录因子，如4、4等都含有二个不同的结构域，即和。
这些转录因子只有同时具有这两个结构域时才能起始转录。
由此，设计不同的两个载体，一个含有基因（假设为A载体），另一个含有基因（假设为B载体）。
一般将一个已知蛋白的基因连在B载体上，作为诱饵()，将未知蛋白的基因连在A载体上，将这两个载体都转到特定的酵母细胞内，看未知蛋白与已知蛋白是否有相互作用。
如果两者有相互作用，那么就可以启动报告基因的转录，从而使这个酵母细胞能在选择培养基上显现出来或者生存下来；如果两者无相互作用，那么报告基因就无法表达，那么这个酵母细胞就无法在择培养基上显现出来或者生存下来，如下图所示：由于酵母双杂交系统不能鉴定膜蛋白间的相互作用，因此又发展出了分离泛素酵母双杂交系统。
该系统的原理如下图所示：如图所示，将泛素蛋白拆分为两个片段，即C端段()和N端段()，并在C端段的N端接上一个16转录因子，此时它并不能激活基因转录（因为它被限制在了C端段上，不能进入细胞核发挥作用）。
将该C端段连到一个膜蛋白上，将N端段连接到另一个膜蛋白上。
若两个膜蛋白有相互作用，那么两个膜蛋白在相互靠近时会使泛素蛋白的N端段和C端段靠近结合，形成一个完整的泛素蛋白。
此时泛素蛋白酶体会将这一段被泛素标记的片段降解，那么连接C端段的16转录因子掉落，即可进入细胞核启动标记基因的表达。
蛋白-蛋白相互作用研究方法的原理
Capturing these momentary contacts to study which proteins are involved and how they interact is a significant goal of proteomics research today.
蛋白质-蛋白质相互作用 研究法的原理简介
张海燕 20101102
Why study protein interaction?
¾ Genome sequences identify tens of thousands of genes: linking these to 200-300 core biological processes will make their study manageable.
饰） ¾ Certain cofactors or additional proteins needed, and etc.（需有额外蛋白或
共因子才能结合的蛋白）
Technique Extention 1
yeast mating type
Transformation is improved by using a and αhaploid.
¾ Recently developed and/or improved technologies and methodologies make studies of large complexes more feasible and informative.
蛋白 蛋白 互作 tag 质粒 重组
蛋白蛋白互作tag 质粒重组全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：蛋白蛋白互作是生物学研究中的一个重要课题，它涉及到细胞内蛋白质相互作用的机制，对于理解细胞内信号传导、蛋白功能及疾病机制都具有重要意义。
在细胞内，蛋白质之间的相互作用能够调控细胞的生理功能，包括信号传导、细胞增殖和凋亡等过程。
了解蛋白蛋白互作机制不仅有助于揭示细胞功能的调控网络，也为开发新型药物靶点提供了重要线索。
本文将介绍蛋白蛋白互作的基本原理，以及在研究中常用的技术手段，包括蛋白互作tag和重组质粒等。
蛋白蛋白互作是指两个蛋白质在细胞内相互结合形成复合物的过程。
这种互作关系可以通过多种方式实现，主要包括蛋白质域之间的相互作用、磷酸化修饰引起的结合以及蛋白质与核酸的结合等。
通过蛋白蛋白互作，细胞可以调控蛋白质的活性、位置及功能，从而实现细胞内信号传导和调控。
为了研究蛋白蛋白互作，科研人员通常借助于各种技术手段来分析蛋白质相互作用的情况。
蛋白互作tag是一种常用的方法。
蛋白互作tag是指通过在目标蛋白质上加入一个外部标签，如荧光蛋白或抗原标记，来追踪目标蛋白质与其他蛋白质的相互作用。
通过这种方式，科研人员可以轻松地检测和定位蛋白蛋白互作的情况，为后续的研究提供了便利。
重组质粒也是研究蛋白蛋白互作的重要工具之一。
重组质粒是指将目标蛋白质的编码序列克隆到一个质粒载体中，并通过转染等方式将其导入宿主细胞中，从而表达目标蛋白质。
通过构建携带不同标签的重组质粒，科研人员可以研究蛋白质在细胞内的相互作用情况，揭示蛋白质之间的互作机制。
第二篇示例：蛋白-蛋白互作是生命科学领域中一个重要的研究方向，研究人员通过研究不同蛋白质之间的相互作用，可以更深入地了解蛋白质的功能以及细胞内各种生物学过程的调控机制。
在这个过程中，tag质粒和重组技术起到了非常重要的作用。
所谓tag质粒，就是在蛋白质基因中加入特定的tag序列，以便在后续的实验中对蛋白质进行标记、纯化或检测。
蛋白质互作
SH2结构域
约100个氨基酸序列，识别磷酸化的酪氨 酸及相邻的3-6个氨基酸残基。
SH3结构域
由50个氨基酸残基组成，存在于各种蛋 白激酶和衔接蛋白中，识别富含脯氨酸 的序列R/KXXPXXP或PXXPXR/K，其亲和力 与脯氨酸残基及相邻氨基酸残基组成相 关。
PH结构域
100-120个氨基酸残基组成，存在于多种 细胞骨架蛋白，蛋白激酶、PLC超家族中。
兼具结合脂类和蛋白质的能力，参与细 胞信号转导。
WW结构域
30-40个氨基酸残基组成的三股反平行β 片层结构域，含两个高度保守的色氨酸 WW而得名，识别富含脯氨酸的序列XPPXY， 参与非受体信号转导、转录调节和蛋白 质降解等过程。
PDZ结构域
由80-100个氨基酸残基组成，包含2个 α-螺旋和6个β-折叠，常以串联重复拷 贝存在，是构成支架蛋白的重要结构， 在细胞膜蛋白质的聚集中发挥重要作用。
结构域是蛋白质中折叠较为紧密且具有 一定功能的球状和纤维状的结构，以模 块方式具有多种不同功能的分子。
蛋白质相互作用结构域专指那些可以识 别其他蛋白质的特殊结构，从而介导两 个蛋白之间发生相互作用的结构域，一 般由50-100个氨基酸组成。
结构域结构域相互作用 结构域-肽段模体相互作用
protein2) SH3-SH2-SH3 NCK(noncatalytic region of tyrosine
kinase) SH3-SH3-SH3-SH2 Scaffold protein JIP-1(JNK-interacting protein1)
PPI 研究的医学意义
PPI异常可导致细胞活动失控
相互作用能力的丧失可丧失原有的正常调节。 突变也可产生新的相互作用。
蛋白质相互作用研究方法
•免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation, Co-IP)
•双分子荧光互补(Bimolecular fluorescence
complementation, BiFC)
•荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy
transfer, FRET)
荧光共振能量转移(FRET)
BD
UAS
AD
lacZ
两种待检测蛋白(X、Y)分别和AD、BD 融合表达, X与Y之间的相互 作用就可以将BD和AD在空间结构上重新联结为一个整体而与报告 基因的上游激活序列（upstream activation sequence）结合，进 而发挥激活转录的功能，使受调控的报告基因得到表达。
UAS
且易出现假阴性。
谢 谢
•免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation, Co-IP)
•双分子荧光互补(Bimolecular fluorescence
complementation, BiFC)
•荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy
transfer, FRET)
免疫共沉淀
两种蛋白在细胞内发生相互 作用时会形成两种蛋白的复 合物，这样就可以先用一种 蛋白的抗体把免疫复合物沉 淀下来，然后用另一种蛋白 的抗体进行Western blotting 检测。
免疫共沉淀
优点：可以保留蛋白质的修饰和结合状态，同时所需
的样本量较少,实验成本较低，减少了纯化步骤，能检
测到瞬时和较弱的蛋白相互作用； 缺点：Co-IP特异性较低，洗脱混合物中往往含有较多 的非特异结合蛋白。 因此，Co-IP 检测到的潜在相互作用蛋白需要通 过BiFC、FRET 等其他方法进一步验证。
蛋白质相互作用
免疫共沉淀：
基于免疫共沉淀中非特异性的实验设计考虑（类型I） 1.抗体的质量：抗体的特异性； 2.尽可能的设置多种阴性对照； 一般采用兔子免疫前的血清(pre-immune serum) 同时进行免疫沉淀及后续分析; 3.使用目标蛋白的多种抗体进行免疫沉淀并比较； 4.采用不表达目标蛋白的细胞裂解物同时进行免疫 沉淀并比较； 5.增强细胞裂解液的严谨性，降低非特异性； 6.检测两种蛋白质的相互作用时，同时用两个蛋白质 的抗体进行实验；
Interaction Domain - Structural basis for protein interaction 相互作用区域是蛋白质相互作用的结构基础
*SH2 domain: phosphotyrosine-containing peptides recognition domain。 SH2 分布最为广泛，识别特定的含有磷酸化Tyr的多肽模 块。
Principle: Affinity purification Affinity between Interaction motif /polypeptide and its interaction proteins;
Advantage: Direct interaction / In vitro
Techniques：
免疫沉淀（非变性）
• 免疫沉淀的灵敏度取决于Protein A (or G) 与 IgG的Kd、IgG与 抗原的Kd值。所以增加抗原或抗体的浓度、使用与抗体直接共 价偶联的珠子进行免疫沉淀可以提高灵敏度；
*
Protein A
Bead
Kd
IgG
Kd
Antigen
*
IgG
Kd
Antigen
蛋白质与蛋白质的相互作用
蛋白质与蛋白质的相互作用蛋白质是由@-氨基酸按一定顺序结合形成一条多肽链，再由一条或一条以上的多肽链按照其特定方式结合而成高分子化合物。
蛋白质在酸性、碱性、酶等发生水解，在水解的过程中生成多肽，但水解的最终产物都是氨基酸。
蛋白质还有盐析、变性等性质。
蛋白质与蛋白质的相互作用是功能复合物的基础（如线粒体内膜呼吸链)。
蛋白质的表达水平、存在方式及相互作用等直接与生物功能相关，在所有生命活动中，蛋白质之间的相互作用是必不可少的，它是细胞进行一切代谢活动的基础。
蛋白质的相互作用能产生许多效应，例如它可以改变蛋白质的动力学特性、形成特异底物作用通道、生成新的结合位点、使蛋白质失活、改变蛋白质对其作用底物的专一性等等。
蛋白质与蛋白质相互作用的研究方法较多，目前比较成熟的，有酵母双杂交技术（Y2H）、噬菌体展示技术（PDT）、融合蛋白沉降技术、亚细胞共定定位、免疫共沉淀技术、荧光共振能量转移技术、表面等离子共振、蛋白芯片技术（抗体与蛋白质整列技术）以及融合蛋白亲和色谱法等。
目前，应用于蛋白质的相互作用的研究方法有生物物理学、分子生物学、遗传学等方式。
一、酵母双杂交系统酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。
其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。
将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。
在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。
Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。
可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。
此外，酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。
二、噬茵体展示技术在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。
蛋白质与蛋白质相互作用的技术
蛋白质与蛋白质相互作用的技术
蛋白质与蛋白质相互作用的技术主要包括酵母双杂交技术、免疫共沉淀技术、荧光能量转移技术、噬菌体展示技术等。
这些技术可用于研究蛋白质之间的相互作用，从而深入了解生命活动的机制。
1.酵母双杂交技术：这是一种有效的筛选蛋白质相互作用的方法，尤其适用
于大规模蛋白质之间相互作用的研究。
通过将目标蛋白与报告基因连接，在酵母细胞中检测报告基因的表达，可以确定目标蛋白与其他蛋白的相互作用。
2.免疫共沉淀技术：利用抗体与抗原之间的特异性结合，将目标蛋白与其他
相关蛋白一起沉淀下来，然后通过Western blot等技术对沉淀的蛋白质进行分析。
通过这种方法可以检测到目标蛋白与其他蛋白质的直接相互作用或者间接相互作用。
3.荧光能量转移技术：一种高灵敏度的检测蛋白质相互作用的方法。
该技术
利用荧光物质标记目标蛋白，通过检测荧光物质之间的能量转移，来间接检测蛋白质之间的相互作用。
4.噬菌体展示技术：将外源基因插入噬菌体外壳蛋白基因的技术，使外源基
因编码的蛋白质与噬菌体外壳蛋白融合，并在噬菌体表面展示出来。
通过该技术可以筛选与目标蛋白相互作用的蛋白质，并对相互作用进行定量分析。
pymol显示蛋白与蛋白之间的相互作用的命令
pymol显示蛋白与蛋白之间的相互作用的命令Pymol是一款常用的分子可视化软件，可以用于展示和分析蛋白质的三维结构以及蛋白质之间的相互作用。
本文将介绍一些常用的Pymol 命令，帮助读者快速了解如何使用Pymol显示蛋白与蛋白之间的相互作用。
首先，我们需要了解如何导入蛋白质的结构文件到Pymol中。
Pymol支持多种结构文件格式，如PDB、PQR等。
可以通过以下命令将蛋白质的结构文件导入到Pymol中：```pythonload protein.pdb其中，"protein.pdb"为蛋白质的结构文件名。
导入后，我们可以在Pymol窗口中看到蛋白质的三维结构。
接下来，我们可以使用Pymol的选择命令来选择特定的蛋白质链或氨基酸残基。
例如，如果我们希望选择蛋白质中的链A，可以使用以下命令：```pythonselect chain_A, chain A如果我们希望选择特定的氨基酸残基，可以使用以下命令：```pythonselect res_100, resi 100其中，"100"为氨基酸残基的编号。
选择完特定的链或残基后，我们可以通过显示命令来显示选中的部分：```pythonshow sticks, chain_A上述命令将链A显示为球棍模型。
接下来，我们可以使用颜色命令来给不同的蛋白质部分着色，以突出蛋白质之间的相互作用。
例如，我们可以将链A着为红色，链B着为绿色：```pythoncolor red, chain_Acolor green, chain_B此时，链A将显示为红色，链B将显示为绿色。
除了着色，我们还可以使用距离命令来计算和显示蛋白质之间的距离。
例如，我们可以计算并显示链A中第100号残基与链B中第200号残基之间的距离：```pythondistance dist, res_100, chain_B and resi 200show distance, dist上述命令将显示链A中第100号残基与链B中第200号残基之间的距离。
蛋白质在细胞膜上的运动方式
蛋白质在细胞膜上的运动方式
蛋白质在细胞膜上的运动方式：扩散运动、跳跃运动、疏水扩张和收缩、脂质筏上的浮动、蛋白质-蛋白质相互作用。
1、扩散运动：膜蛋白通过扩散运动在细胞膜上移动。
这种运动方式是由于膜脂的液态特性，使得蛋白质可以在膜表面自由扩散。
2、跳跃运动：某些膜蛋白可以通过跳跃运动在细胞膜上移动。
这种运动方式意味着蛋白质在膜中间位置或者从一个脂质颗粒跳跃到另一个脂质颗粒。
3、疏水扩张和收缩：疏水性膜蛋白可以通过疏水作用与脂质层相互作用，使其在细胞膜上发生扩张或收缩的运动。
4、脂质筏上的浮动：某些膜蛋白倾向于在脂质筏上进行浮动运动。
脂质筏是由富含特定脂质和蛋白质的微区域组成的，蛋白质可以在这些区域中进行无序的运动。
5、蛋白质-蛋白质相互作用：膜蛋白可以通过与其他膜蛋白的相互作用，如结合、解离和转运，而改变其在细胞膜上的位置和运动。
免疫共沉淀样本要求
免疫共沉淀样本要求
免疫共沉淀是一种用于检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法。
为了保证实验的准确性和可重复性，免疫共沉淀样本需要满足以下要求：
1. 细胞提取物：样品应具有足够的细胞数量和蛋白质浓度，以便免疫共沉淀实验能够成功检测并鉴定目标蛋白与其他蛋白的相互作用。
提取物可以通过细胞匀浆或细胞裂解溶液等方法获取。
2. 交联剂：为了固定和稳定蛋白-蛋白相互作用，可以在样本中加入特定的交联剂，如二氧化铤（DTSSP），以避免在免疫共沉淀过程中蛋白质相互作用的解离。
3. 非特异性结合对照：除了目标蛋白的抗体，还需要添加非特异性抗体，作为背景控制。
非特异性抗体不与目标蛋白结合，用来评估免疫共沉淀实验中的假阳性结果。
4. 阻断剂：为了减少非特异性蛋白质-蛋白质相互作用，可以添加蛋白质结合抑制剂，如牛血清白蛋白（BSA），乳清蛋白或鱼精蛋白。
这些阻断剂可以降低非特异性相互作用的水平，增加目标蛋白与其特异性结合的可能性。
5. 控制组：为了确保免疫共沉淀实验的准确性和可靠性，应包括阳性对照和阴性对照组。
阳性对照是已知与目标蛋白相互作用的蛋白或复合物，用于验证免疫共沉淀实验的有效性。
阴性对照是不与目标蛋白相互作用的蛋白或复合物，用于排除背景
干扰和非特异性结合。
总之，免疫共沉淀样本的要求包括细胞提取物的充分和合适的浓度，适当的交联剂，非特异性结合对照，蛋白质结合抑制剂以及阳性和阴性对照组。
这些要求可以确保实验结果的准确性和可靠性。
nanobret原理
nanobret原理引言nanobret（NanoBioluminescence Resonance Energy Transfer）是一种新颖的荧光共振能量转移技术，主要用于研究蛋白质-蛋白质相互作用。
它结合了生物发光和共振能量转移的原理，在生物学和医学研究中具有广泛的应用前景。
本文将深入探讨nanobret原理及其在生物科学中的应用。
nanobret原理nanobret基于两种基本的生物物理现象：生物发光和共振能量转移。
首先，让我们对这两个概念进行一些基本介绍。
生物发光生物发光是一种生物化学过程，某些生物体能够通过内源的酶在没有外部光源的情况下产生可见光。
生物发光的机制可以追溯到一种叫做荧光素酶的酶，它可以催化荧光素与氧气反应，产生光和氧化产物。
许多生物体，比如萤火虫和一些海洋生物，都拥有这种能力。
共振能量转移共振能量转移（Resonance Energy Transfer, RET）是一种非辐射能量传递的过程，其中能量从一个分子传递到另一个分子，而不需要通过电磁辐射。
共振能量转移通常发生在两个分子之间，一个处于发射态，一个处于吸收态。
它的效率取决于分子之间的距离、构象和取向。
nanobret利用了这两种现象来实现对蛋白质-蛋白质相互作用的研究。
nanobret的实验步骤nanobret实验一般包括以下几个步骤：1.蛋白质标记：将目标蛋白和荧光标记物结合，通常使用强荧光素酶作为标记物；2.共振能量转移：将标记的蛋白质与助体蛋白质结合，形成复合物；3.激发和发射：用激发光源激发复合物，荧光素酶发射可见光；4.信号检测：测量发射的光信号，用于判断目标蛋白和助体蛋白质之间的相互作用强度。
通过这些步骤，nanobret技术可以帮助研究者了解蛋白质之间的相互作用和信号传递机制，从而揭示生物学和疾病发展的内在规律。
nanobret在生物科学中的应用nanobret技术具有广泛的应用前景，在生物科学领域已经有了很多成功的应用案例。
蛋白互作分析
蛋白互作分析蛋白互作分析是对蛋白质的相互作用进行分析，在互作分析完成后常常结合质谱等技术对互作蛋白进行鉴定。
百泰派克生物科技提供质谱鉴定的服务。
蛋白相互作用是指两个或两个以上的蛋白质分子结合形成蛋白质复合体的一个过程。
一般情况下，蛋白质都是由多个蛋白质分子相互协调共同实现复杂的细胞功能。
因此研究蛋白相互作用有利于探索生命体的细胞功能、了解疾病的发生发展、找寻特定的疾病预测和治疗方法，并且为新药研发提供新的思路。
蛋白质互作分析的方法较多，这里简单的介绍一下免疫共沉淀法（CO-IP）结合质谱联用的蛋白互作分析、GST融合蛋白Pull-down技术结合质谱联用的蛋白互作分析以及SILAC与免疫共沉淀结合质谱联用的蛋白互作分析。
免疫共沉淀法（CO-IP）结合质谱联用的蛋白互作分析免疫共沉淀法（CO-IP）是利用抗原抗体之间的特异性来检测蛋白质之间的生理性相互作用的一种方式。
实验中使用非离子变性剂来裂解细胞，细胞内的蛋白相互作用被保存下来，在其中加入相应的抗体，使抗体与细胞中的特异蛋白质结合，再加入蛋白A/G形成抗体蛋白复合物，进行离心、分离，使抗体蛋白复合物沉淀，弃去上清液，最后用质谱技术鉴定沉淀下来的蛋白质，进而证明两者间的相互作用。
蛋白互作分析。
GST融合蛋白Pull-down技术结合质谱联用的蛋白互作分析GST融合蛋白pull-down沉降技术，利用基因重组将GST标签插入到目标蛋白上，谷胱甘肽包裹的磁珠与目标融合蛋白结合，加入细胞裂解液后，具有相互作用的蛋白被融合蛋白吸附，加入过量的谷胱甘肽进行洗脱，最后用MS技术分析。
SILAC与免疫共沉淀结合质谱联用的蛋白互作分析利用SILAC方法分别标记实验组和对照组细胞后进行Co-IP实验，依靠抗原与抗体之间的专一性反应分离得到免疫复合物；再通过LC-MS/MS来定性/定量检测免疫复合物中的蛋白；当实验组与对照组中某个蛋白质的含量达到统计学差异时，判定这个蛋白质与研究的蛋白具有相互作用，可极大降低蛋白质互作假阳性结果可能性。
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1.药品标准中鉴别试验的意义在于（ B ）A.检查已知药物的纯度B.验证已知药物与名称的一致性C.确定已知药物的含量D. 考察已知药物的稳定性E.确证未知药物的结构2.中国药典规定：恒重，除另有规定外，系指供试品连续两次干燥或炽灼后的重量差异在（ C ）A. 0.01 mgB. 0.03 mgC. 0.3 mgD.0.1 mgE.0.5 mg3.盐酸溶液（1 → 1000）系指（ A ）A.盐酸1.0 mL加水使成1000 mL的溶液B.盐酸1.0 mL加甲醇使成1000 mL的溶液C.盐酸1.0 g加水使成1000 mL的溶液D.盐酸1.0 g加水1000 mL制成的溶液E.盐酸1.0 mL加水1000 mL制成的溶液4. ChP中收载的残留溶剂检查法是（ C ）A. HPLC法B. TLC法C. GC法D. TGA法E. DSC法5.下列试液中，用作ChP重金属检查法中的显色剂的是（B ）A.硫酸铁铵试液B.硫化钠试液C.氰化钾试液D. 重铬酸钾试液E.硫酸铜试液6.采用硫代乙酰胺法检查重金属时，供试品如有微量高铁盐存在，需加入的是（ E ）A.碘试液B.重铬酸钾溶液C.高锰酸钾溶液D.过硫酸铵E.抗坏血酸7.下列药物中，能采用重氮化-偶合反应进行鉴别的是（ D ）A.阿司匹林B.美洛昔康C.尼美舒利D. 对乙酰氨基酚E. 吲哚美辛8.下列药物中，可显双缩脲反应的是（ B ）A.硫酸多巴胺B.盐酸麻黄碱C.苯佐卡因D. 对氨基苯甲酸E. 氧烯洛尔9.具芳伯氨基或经水解生成芳伯氨基的药物可用亚硝酸钠滴定，其反应条件是第1页（共17页）（ A ）A.适量强酸环境，加适量溴化钾，室温下进行B.弱酸酸性环境，40℃以上加速进行C.酸浓度高，反应完全，宜采用高浓度酸D. 酸度高反应加速，宜采用高酸度E. 酸性条件下，室温即可，避免副反应10.下列药物中，不属于对氨基苯甲酸酯类的是（ C ）A.盐酸普鲁卡因B.苯佐卡因C.盐酸利多卡因D. 盐酸丁卡因E. 盐酸氯普鲁卡因11.下列巴比妥类药物中，可与铜盐吡啶试剂生成绿色配合物，又与铅盐生成白色沉淀的是（ C ）A.巴比妥B.异戊巴比妥C.硫喷妥钠D. 环己烯巴比妥E. 苯巴比妥12.能够与盐酸氯丙嗪反应生成沉淀的试剂是（A ）A.三硝基苯酚B.三氯化铁C.茜素锆D. 碱性酒石酸铜E. 氯化钡13.莨菪烷类生物碱的特征反应是（ E ）A.与三氯化铁反应B.与生物碱沉淀剂反应C.重氮化-偶合反应D. 丙二酰脲反应E. Vitali反应14.采用酸性染料比色法测定药物含量，如果溶液pH过低对测定造成的影响是（ A ）A.使In-浓度太低，而影响离子对的形成B.有机碱药物呈游离状态C.使In-浓度太高D. 没有影响E. 有利于离子对的形成15.硫色素反应为下列哪个药物的专属鉴别反应（ B ）A.维生素AB.维生素B1C.维生素CD.维生素DE.维生素E16. 需检查游离生育酚杂质的药物是（ C ）A.地西泮B.异烟肼C.维生素ED.丙黄舒E.甲芬那酸第2页（共17页）17.具有β-内酰胺环结构的药物是（ E ）A.阿司匹林B.奎宁C.四环素D.庆大霉素E.阿莫西林18. 链霉素具有的特征反应是（ A ）A.坂口反应B.柯柏反应C.硫色素反应D.差向异构反应E.戊烯二醛反应19.平均片重0.30 g以下片剂重量差异限度为（ D ）A.±1.0%B.±3.0%C.±5.0%D.±7.5%E.±10%20.以淀粉、糊精等作为稀释剂时，对片剂的主药进行含量测定，最有可能受到干扰的测定方法是（ B ）A. EDTA滴定法B.氧化还原滴定法C. HPLC法D. GC法E.酸碱滴定法A. SFDAB. ChPC. GCPD. GLPE. GMP下列管理规范的英文缩写是D21.药品非临床研究质量管理规范E22.药品生产质量管理规范[23-26]A.对氨基酚B.酮体C.游离水杨酸D.二聚体E.对氨基苯甲酸中国药典规定下列药物需检查的特殊杂质是C23.阿司匹林E24.盐酸普鲁卡因A25.对乙酰氨基酚B26.肾上腺素[27-30]A.加酸水解，在酸性条件下，与亚硝酸钠、碱性β-萘酚反应，显红色B.在三氯醋酸存在下水解、脱羧、失水，再加入吡咯加热至50℃产生蓝色C.取供试品溶液，滴加氯化钡试液，即生成白色沉淀；分离，沉淀在盐酸或硝酸中均不溶解第3页（共17页）第4页（共17页）D . 与碳酸钠试液加热水解，再加过量稀硫酸酸化后生成白色沉淀，并发生醋酸的臭气E . 与硫酸铜和氢氧化钠试液反应即显蓝紫色以下药物的鉴别反应是D27. 阿司匹林E28. 盐酸麻黄碱A29. 对乙酰氨基酚B30. 维生素C31. 药品标准中，“检查”项系检查药物的（ ABCD ）A . 安全性B . 有效性C . 均一性D . 纯度E . 稳定性32. 在固体供试品比旋度计算公式lctD ∂=∂100][中（ ABC ） A . t 为测定时的温度（℃） B . D 为钠光谱的D 线C . α为测得的旋光度D . l 为测定管长度（cm ）E . c 为每1 mL 溶液中含有被测物质的重量（g ）33. 芳香第一胺类药物鉴别试验使用的试剂有（ ACD ）A . 稀盐酸B . 稀醋酸C . 亚硝酸钠D . β-萘酚E . 硝酸银34. 采用硫氰酸盐法检查铁盐时，加入过硫酸铵的作用有（ ABD ）A . 将供试品中Fe 2+氧化成Fe 3+B . 防止光线使硫氰酸铁还原C . 防止Fe 3+水解D . 防止硫氰酸铁分解褪色E . 使溶液色泽梯度明显，易于区别35. 两步滴定法测定阿司匹林片剂含量时，第一步消耗的氢氧化钠的作用有（ABCD ）A . 中和游离水杨酸B . 中和阿司匹林分子中的羧基C . 中和酸性杂质D . 中和辅料中的酸E . 水解酯键36.盐酸普鲁卡因常用的鉴别反应有（AB ）A.重氮化-偶合反应B.水解反应C.氧化反应D.磺化反应E.碘化反应37.吩噻嗪类药物的理化性质有（ABCD E）A.多个吸收峰的紫外光谱特征B.易被氧化C.可以与金属离子络合D.杂环上的氮原子碱性极弱E.侧链上的氮原子碱性较强38.能直接与三氯化铁试液反应生成有色配位化合物的药物有（ACDE ）A.水杨酸B.阿司匹林C.吡罗昔康D.美洛昔康E.对乙酰氨基酚39.能发生羟肟酸铁反应的抗生素类药物有（ACDE）A.青霉素钾B.硫酸链霉素C.氨苄西林钠D.头孢他啶E.阿莫西林钠40.当注射剂中有抗氧剂亚硫酸钠或亚硫酸氢钠时，可被干扰的含量测定方法有（BCDE）A.络合滴定法B.亚硝酸钠滴定法C.铈量法D.碘量法E.氧化还原滴定法41.（√ ）42.（×）43.（×）44.（×）45.（√ ）46.（√ ）47.（×）48.（√ ）49.（×）50.（√ ）41.药品标准是对药品质量、规格及检验方法所作的技术规定。
（√ ）42. 熔点测定中，“全熔”系指供试品在毛细管内开始局部液化出现明显液滴时的温度。
（×）43. 古蔡氏检砷法中需比较供试品砷斑与标准砷斑的面积大小来判断供试品中的砷盐是否符合限量规定。
（×）44. 水杨酸可在碱性下与三氯化铁试液反应生成紫堇色配位化合物。
（×）45. 多数苯乙胺类药物基本结构中存在手性碳原子，具有光学活性。
（√ ）46. 重氮化反应中，加入适量的溴化钾的目的是加快反应速度。
（√ ）47. 为严格控制药物制剂的质量，与盐酸氯丙嗪相比，盐酸氯丙嗪制剂的有关物质检查相应严格了限制。
（×）48. 莨菪烷类抗胆碱药物都具有水解性、碱性和旋光性。
（√ ）第5页（共17页）49. 维生素C显酸性，酸性来源为C2-OH。
（×）50. 当主药与片剂辅料的混合不均匀时，应以含量均匀度检查替代重量差异检查。
（√ ）51.简述古蔡法检查砷的原理以及加入醋酸铅棉花、酸性氯化亚锡和碘化钾的作用。
（1）原理：利用金属锌与酸作用产生新生态的氢，与药物中微量砷盐反应生成具有挥发性的砷化氢，遇溴化汞试纸，产生黄色至棕色的砷斑，（1分）与同等条件下一定量标准砷溶液所生成的砷斑比较，判断药物中砷盐的限量。
（1分）（2）加入醋酸铅棉花作用：吸收供试品及锌粒中可能含有少量的硫化物在酸性条件下产生的硫化氢气体，避免其与溴化汞作用产生硫化汞色斑干扰测定结果。
（1分）（3）加入酸性氯化亚锡和碘化钾作用：①还原As5+为As3+（1分）②抑制SbH3的生成（1分）③形成锌锡齐，加快反应速度（1分）52.简述阿司匹林片两步滴定法的原理与操作要点。
因阿司匹林片剂中除存在其中水解产物水杨酸及醋酸外，在制剂工艺中添加了抑制阿司匹林水解的稳定剂酒石酸或枸橼酸。
为消除片剂中酸性降解产物及稳定剂对阿司匹林测定的干扰，可采用两步滴定法测定阿司匹林的含量。
（2分）两步滴定法系指测定过程分两步进行：第一步中和制剂中的酸性水解产物和酸性稳定剂（同时中和阿司匹林的游离羧基）；第二步水解与滴定，即水解后剩余量滴定法。
（1分）中和：加中性乙醇（对酚酞指示液显中性）振摇，使阿司匹林溶解，加酚酞指示液，用氢氧化钠滴定液滴定至溶液显粉红色。
（1分）水解与滴定：在中和后的供试品溶液中，精密加入定量过量的氢氧化钠滴定液，加热水解后，用硫酸滴定液回滴定。
（1分）第6页（共17页）第7页（共17页）53. 对乙酰氨基酚中硫酸盐的检查取本品2.0 g ，加水100 mL ，加热溶解后，冷却、滤过，取续滤液25 mL ，依法检查（附录Ⅷ B ），与标准硫酸钾溶液1.0 mL （100 μg/mL S O 4）制成的对照液比较，不得更浓。
计算硫酸盐的限量。
53. 解：c = 1×10-4 g/ mL （1分）V = 1 mL （1分） S = 2.0 g×10025=0.5 g （1分）根据=L s cv ×100%（2分）得：L =0.02%（1分）54. 甲氧苄啶片（标示量为50 mg ）含量测定：取本品20片，精密称定为1.2003 g ，研细，精密称取0.05783 g 置250 mL 容量瓶中，加稀醋酸约150 mL ，充分振摇使甲氧苄啶片溶解，加稀醋酸稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液10 mL ，置100 mL 容量瓶中，加稀醋酸10 mL ，加水稀释至刻度，摇匀。
按照紫外可见分光光度法（附录Ⅳ A ），在271 nm 波长处测定吸光度为0.420。
另取甲氧苄啶对照品0.05134 g ，同法测定，在271 nm 波长处测定吸光度为0.416。