致畸试验

第七节致畸试验

掌握致畸试验的内容。

致畸试验（teratogenic test)：是鉴定动物致畸物的标准试验法，下述的致畸试验方案用以检测药物的致畸性，也能得到有关药物致胚胎死亡及生长迟缓的资料。

一、实验动物

理想的致畸实验动物对药物的代谢过程应和人相近，胎盘结构亦相似，产仔多、孕期短、价廉、来源易及操作方便。在代谢功能和解剖结构方面，比较符合要求的动物是狗和猴；符合经济实用要求的是兔、大鼠、小鼠及豚鼠。但小动物有不足之外，如兔自发畸形率较高，有时孕期长短不定（32-36天），大鼠对致畸作用有较大耐受性；小鼠对致畸反应介于兔和大鼠之间，‘自发畸形略高于大鼠；豚鼠胎盘结构和人相近，但孕期长（6O天左右）产仔少（4只）。

常用大鼠，小鼠和兔。特别是大鼠，因为大鼠自发畸形率低，胎鼠大小也适于检查。雌性动物宜用成年末怀过孕的动物。

动物选择要求对药物敏感性高，而自发畸变形率低，至少采用两种动物，一种啮齿类，另一种要求非啮齿类。

二、动物受孕及检查方法

以大鼠为例，选用鼠龄三个月以上，体重200-250g雌鼠，饲养数天后作阴道分泌物涂片检查，以判断是否处于动情期。如涂片见有较多白色分泌物，镜检发现有较多核上皮细胞，提示雌鼠处于动情前期。大鼠性周期一般为4-5天，动情前期向动情期移行多在夜间。处于动情前期的鼠按2:1或3:2比例和同龄雄鼠同笼过夜，次日检查是否受孕。

检查受孕方法有两种。一是检查阴栓，阴栓是雄鼠精囊和凝固腺分泌液在雌鼠阴道凝结而成的白色块状物，形似米粒，大鼠的阴栓很易脱落，次日可于鼠笼下的糖瓷盘内发现，小鼠的阴栓不易脱落，位置较深时用镊子撑开阴道口方能看清。二是阴道涂片检查精子，可用棉签插人阴道转动数次后拔出，涂抹在滴有生理盐水的玻片上，在低倍镜下查找精子。

查到阴栓或精子即提示怀孕，检出日为孕期的“0天”，次为第1天，以此推算孕龄。受孕率在春、秋季较高（可达70％以上）夏、冬季较低(50%），所以也可采用人工控制温度（23℃左右）及光线，让雌雄动物每天同笼6小时后作阴道涂片，以提高受孕率并便于在白夭工作。

三、剂量分组，给药方式及时间

受试动物分为4-5组，其中3个剂量组（高、中、低），其余两组为阳性对照和阴性对照组。高剂量组应有母体毒性反应，或为最大给药量。摄食量的减少，体重增长缓慢或下降，阴道出血，流血等均是毒性反应的表现；低剂量组应为母体和胚胎毒性反应剂量。一般为临床拟用剂量的某些倍量。中间剂量应在高、低剂量组之间，剂量组间距应为几何级数，并能显示微小的毒性差别。也可用LD50的1/3-1/5为高剂量组，低剂量组用1/30-1/100LD50，按等比差在高、低剂量组间插进中间剂量，以期得出最小致畸剂量或最大无作用剂量。如已掌握或能估计人类实际接触量，也可以人实际接触量（或估计量）为低剂量组，并以其数倍（如10倍）为高剂量组。

阴性对照组为溶剂（赋形剂）对照。阳性对照可用乙酞水杨酸(大鼠250mg/kg,小鼠150mg/kg),维生素A(浓鱼肝油5m1/kg)。家兔可用6-氨基烟酰胺（2.5mg/kg）。已经进行过致畸试验，并确知所用的试验动物对致畸物有阳性结果的实验室可略去阳性对照，每组受孕动物数大鼠和小鼠15-20只，兔8-10只，狗和猴3-4只。

染毒途径应根据受试物的性质及人类可能的接触方式而定，一般多用灌胃和腹腔注

射。染毒时间应选择胚胎对致畸物的易感期（器官形成期）。大、小鼠和兔进行致畸试验的日程安排见。

每只试验动物在试验期间都应有准确记录受精日期，给予受试物日期和剂量，给药后动物的体重应每隔3-4天称一次（0,3,7,10,13、16,20），并根据体重调整给药剂量，，另一方面也可对受试物动物受精后怀孕和否及受试物对胚胎发育有无影响作出初步估计，如怀孕胚胎发育正常，则受试动物的体重可明显地持续增长；若胚胎中毒死亡或流产，母体体重则停止增长以至下降。

四、观察

⑴对母体的观察：每天检查有无中毒症状，对有流产或早产征兆者（如见阴道出血），及时处死检查。

⑵对胎仔的观察：于分娩前1-2日处死受孕动物，以防止自然分娩后母鼠吞食畸形仔鼠。剖腹取出子宫和卵巢，称重辨认子宫内的活胎、死胎及吸收数，并从左侧子宫角顶端开始直到右侧子宫顶端，按顺序编号记录：然后检查和记录黄体数。

活胎：完整成形，肉红色，看自然运动，对机械刺激有运动反应；胎盘红色，较大。

晚死胎：完整成形，灰红色，无自然运动，对机械刺激无反应；胎盘灰红色，较小。

早死胎：紫褐色，未完整成形，无自然运动，胎盘暗紫。

吸收胎：暗紫或浅色点块，不能辨认胚胎和胎盘。

黄体：在卵巢表面呈黄色鱼子状突起，提示孕鼠的排卵数。

活胎的外观畸形并记录的类型、部位及程度。将每只母鼠的2/3活胎剥去皮肤和内脏，经茜素红染色及脱水透明后，检查骨骼畸形；余1/3活胎浸人鲍音氏(Bouin)固定液，供检查内脏畸形。常见的外观、骨骼和内脏见表18-6、表18-7、表18-8。由于目前没有充分证据表明骨骼对致畸物比内脏更敏感，因此，有人主张将来自两个子宫角的胎鼠随机分配到骨骼畸形检查中。现将胎仔的外部检查及骨骼和内脏畸形检查的具体方法叙述如下：

⑴胎仔外部检查：将处死（或深度麻醉）的试验动物剖腹暴露子宫，进行下列的检查和记录。

①确定怀孕情况、顺序编号依次鉴别检查活胎数，早期死胎数，晚期死胎数和吸收胎数。

②剪开子宫，按编号顺序，对胎仔逐一检查记录性别、体重、身长、尾长和全窝胎盘总量。

③对活胎仔由头部、躯干、四肢、尾部进行外观检查，各部位常见的畸形见表18-6。

(2)胎仔的骨骼检查：胎仔的骨骼检查是致畸试验一项重要观察内容，一般是将每窝胎仔的1/2或2/3数量留作此项检查。

其具体方法如下：

①将留作骨骼检查的胎仔放入75%-90%的乙醉溶液中进行固定，时间2-5天。

②固定好的胎仔置于1%的氢氧化钾溶液中3-10天，直至肌肉透明可见骨骼为止。在此期间依据情况可更换1%,氢氧化钾溶液数次，每次更换溶液时将胎仔脱落的皮肤洗去。

③经1％氢氧化钾溶液处理后的胎仔，用茜素红进行染色直至骨骼染成桃红色或紫色为止，一般需2-5天，必要时中间须更换新染色液数次。

茜素红染色液的配制：将茜素红加人下面混合液中至饱和为止。

冰醋酸 5m1

纯甘油 10ml

1％水合氯醛 60ml

使用时取上述茜素红饱和溶液lml，加1%氢氧化钾溶液至1000ml混合配成使用液。

④经染色后的胎仔置于以下透明液中1-2天。若透明不够满意时，可适当延长在透