家蝇 u93 基因编码蛋白多克隆抗体的制备与鉴定

家蝇Caspase-1基因克隆、表达及特性研究的开题报告

家蝇Caspase-1基因克隆、表达及特性研究的开题报告一、研究背景家蝇（Musca domestica）是人类的常见伴侣，常常出现在居住环境中，不仅会给人们日常生活带来麻烦，而且也是许多疾病的传播媒介。

因此，对家蝇的研究具有重要意义。

在昆虫的免疫系统中，Caspase家族是细胞凋亡的关键因子，也参与到其他细胞的生理过程中。

Caspase-1作为Caspase家族中的重要成员，参与调控炎症反应、坏死和病理性凋亡等多种生物学过程。

尽管有关Caspase-1在哺乳动物中的研究较多，但是在家蝇中的研究还比较少，因此，开展该方向的研究具有破解家蝇免疫系统的重要作用。

二、研究目的和意义本研究旨在通过克隆和表达家蝇Caspase-1基因，分析其生物学特性和功能。

通过对家蝇Caspase-1的研究，可以深入了解家蝇的免疫系统。

同时，可以为进一步研究家蝇免疫相关基因的功能及其对疾病的影响提供重要的理论基础。

三、研究内容和方法1、基因克隆：利用RT-PCR技术从家蝇的组织中提取mRNA，合成cDNA模板，设计引物，扩增家蝇Caspase-1基因全长序列。

2、基因表达：将目的基因插入到表达载体中，转化到大肠杆菌（E. coli）中进行表达，使用亲和纯化方法提纯目的蛋白，并进行鉴定。

3、功能分析：利用Western blot技术和细胞凋亡检测方法，研究家蝇Caspase-1在昆虫免疫反应和凋亡过程中的调节作用。

四、预期结果通过对家蝇Caspase-1的克隆和表达，预计能获得高纯度的目的蛋白。

通过对家蝇Caspase-1的功能分析，可进一步深入了解家蝇的细胞凋亡调控机制。

同时，对于家蝇免疫反应系统的研究，也有望为防治家蝇传播的疾病提供理论依据。

家蚕组织蛋白酶D基因的克隆、序列分析及其表达谱研究

家蚕组织蛋白酶D基因的克隆、序列分析及其表达谱研究
家蚕组织蛋白酶D基因的克隆、序列分析及其表达谱研究
组织蛋白酶D(cathepsin D,CtD)是溶酶体内天冬氨酸内切蛋白酶,参与机体多种生理病理过程,尤其在昆虫的发育变态过程中起着重要作用.利用NCBI上登录的组织蛋白酶D基因核酸序列和家蚕Bombyx mori表达序列标签(expressed sequence tags,EST)数据库,进行电子克隆获得家蚕组织蛋白酶D(BmCtD)基因的全长cDNA(DQ010007).该cDNA大小为1 543 bp,其中ORF长1 152 bp,同源性分析表明BmCtD与其他物种的CtD具有较高的相似性.BmCtD的mRNA存在选择性拼接,另外一种mRNA形式命名为BmCtDⅠ.RT-PCR实验表明该基因在本实验所调查的家蚕不同发育时期和组织中都有表达.
作者：杨远萍刘春王子龙王根洪夏庆友 YANG Yuan-Ping LIU Chun WANG Zi-Long WANG Gen-Hong XIA Qing-You 作者单位：西南大学蚕学与生物技术学院,农业部蚕桑学重点实验室,重庆,400716 刊名：昆虫学报ISTIC PKU 英文刊名：ACTA ENTOMOLOGICA SINICA 年，卷(期)：2006 49(2) 分类号：Q966 关键词：家蚕组织蛋白酶D 克隆序列分析表达谱。

家蝇几丁质酶基因的序列分析、克隆和诱导表达

ｏＤＣ（ｕｃｏｓｉａｃｉｉａｅＩ）ｆＭＩＭｓａｄｍｅｔｃｈｔｓ，ｗｉｈｔｏｓｏｌｎｎｎｘｒｓｉｇｔａｅｅＳｑｅｃｎｌｓｓｒｖａｅｎｔｔｅｍｅｈｄｆｃｏｉｇａｄｅｐｅｓｎｈｔｇｎ．ｅｕｎｅａａｙｉｅｅｌｄｈ
ｌｒｗｅｇｔｏ８６Ｄａａｄｐｆ５７ａｉｈｆ２．２ｋｎＩｏ．８，ｈｄｏｅａｔｅｓｔｆｆｍｉ８ｃｉｎｓ．ＴｈｅｅｃｄｎｏＤＣ１ｗａｍｐｉｉｄｂａｎｃｉｉｏａｌ１ｈｔａｅｖｅｙｉｅｇｎｏｉｇｆｒＭｓａｌｅｙｆ
Ｓｑｎｃｎａｙｉ，ｃｏｎｎｄｉｕｅｘｒｓｉｎｅｕｅｅａｌｓｓｌｎｉｇａｎｄｃｄｅｐｅｓｏ
ｏｈｔｎｓｇｎｎｈｕｅｌ（ｕｃｏｓｉａ）ｆｃｉｉａｅＩｅｅｉｏｓｆｙＭｓａｄｍｅｔｃ
ｐｌｍｅａｅｃａｎｒａｔｎ（ＣＲ）ｎｈｎｗａｎｅｔｄｉｔｅｔｒｐｏｙｒｓｈｉｅｃｉｏＰ。ａｄｔｅｓｉｓｒｅｎｏｖｃｏＥＴ８（）ａｄｉｄｃｄｗｉＰ２ａ＋ｎｎｕｅｔＩＴＧ．Ｔｈｅｏｉａｔｈｅｒｃｍｂｎｎ
ｔｔｔｐｅｅｄｎｇｆａｅｏｈＤＮＡｎｃｈａｈｅｏｎｒａｉｒｍｆｔｅｃｅｏｄｅ５１ａｉｏａｉｏｔｉｗｈｃｃｔｉｄａＨｅｍｉａｉａｅｕｅｃｄａ２－ｍｎｃｄｐｒｅｎ，ｉｈｏｎａｎｅｎＮ２ｒｎｌｓｇｎｌｓｑｎｅｔ（— １２２）Ｔｈｅｓｑｎｅｉｎｉｉｄｗｉｈｏｔｒｉｅｔｃｉｉｓ．ｅｕｅｃｄｅｔｆｅｔｈｅｎｓｃｈｔｎａｅｗａｓｂｅｗｅｎ６ｔｅＯａｄ７．Ｔｈｅｐｒｅｎ，ｗｉｈａｐｒｄｉｔｄｍｏｌｃ — ｎ０ｏｔｉｔｅｃｅｅｕ

家蝇几丁质酶基因的序列分析、克隆和诱导表达

家蝇几丁质酶基因的序列分析、克隆和诱导表达国果;吴建伟;吴沁怡;付萍;张勇【摘要】The aim of this study is to analyze and predict the structure and characteristics of genes and encoding proteins of MDC Ⅰ (Musca domestica chitinase Ⅰ ), with the methods of cloning and expressing that gene. Sequence analysis revealed that the open reading frame of the cDNA encoded a 251-amino acid protein, which contained an NH2-terminal signal sequence (1-22). The sequence identified with other insect chitinase was between 60% and 70%. The protein, with a predicted molecular weight of 28. 62 kDa and pi of 5. 78, had one active site of family 18 chitinase. The gene coding for MDC I was amplified by polymerase chain reaction (PCR), and then was inserted into vector pET28a ( + ) and induced with IPTG. The recombinant protein in the expression vector was analyzed by SDA-PAGE. Results indicated that the recombinant plasmid with the correct target gene was constructed, and the recombinant protein was expressed in E. coli BL21 (DE3). The target gene was cloned into the host bacterium and expressed correctly, and these results would establish the basis for further researches in biology and immunology of chitinase in housefly.%目的对EST筛选得到的家蝇几丁质酶Ⅰ(MDC Ⅰ)基因进行序列分析,克隆其eDNA序列并在大肠杆菌中表达.方法采用EST测序技术从已构建的家蝇幼虫cDNA质粒文库中筛选到MDC Ⅰ基因,对其进行序列测定和分析.以该基因的cDNA文库质粒为模板,通过PCR方法对MDC Ⅰ基因进行扩增,以pET 28a(+)为载体构建重组质粒,再转化到表达宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达.表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定.结果MDC Ⅰ基因全长751 bp,编码251个氨基酸,理论分子量28,62家kDa;等电点5.78,有1个chitinase 18家族的活性位点.构建了具有正确基因序列的MDCⅠ重组表达质粒,重组蛋白在大肠杆菌BL21( DE3)中表达.结论MDCⅠ基因可在原核表达系统中表达,为进一步研究该蛋白的生物学、免疫学活性奠定了基础.【期刊名称】《中国人兽共患病学报》【年(卷),期】2012(028)006【总页数】4页(P570-573)【关键词】家蝇;几丁质酶;序列分析;基因克隆;表达【作者】国果;吴建伟;吴沁怡;付萍;张勇【作者单位】贵阳医学院寄生虫学教研室,贵阳 550004;贵阳医学院寄生虫学教研室,贵阳 550004;贵阳医学院寄生虫学教研室,贵阳 550004;贵阳医学院寄生虫学教研室,贵阳 550004;贵阳医学院寄生虫学教研室,贵阳 550004【正文语种】中文【中图分类】R37几丁质是构成大多数真菌细胞壁的主要成分，同时也广泛存在于节肢动物外壳和软体动物中。

果蝇再生蛋白(rgn)多克隆抗体的制备及鉴定

李哲，柳宗琳，金丽华（东北林业大学生命科学学院遗传学科，黑龙江哈尔滨１５００４０）
［摘要］目的制备具有高度特异性的抗果蝇再生蛋白（ｒｇｎ）的多克隆抗体。方法利用ＰＣＲ技术从果蝇 “ 。ｅＤＮＡ中获得
ｒｇｎ基因片段，构建重组质粒；将其转入ＪＭ１０９（ＤＥ３）菌株中诱导ｒｇｎ融合蛋白表达，再利用Ｎｉ — ＮＴＡｓｕｐｅｒｆｌｏｗ层析柱法将其纯化；经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测后，利用制备的抗原免疫ｓＤ大鼠，从血清中获得高纯度的抗ｒｇｎ多克隆抗体，利用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法和免疫组织化学染色法对抗体特异性进行鉴定。结果
ｄｅｔｅｔｅｃｄｂｙＷｅｓｔｅｍｂｌｏｔｉｎｇａｎｄｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｃｈｏｅｍｉｓｔｒｙ．ＲｅｓｕｌｔｓＴｈｒｏｕｇｈｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐＩａｓｍｐＦＬｑＥＴＡ－ｒｇｎ，６×Ｈｉｓ－ｒｇｎ
１４０４
细胞与分子免疫学杂志（ＣｈｉｎＪＣｅｌｌＭ０ｌＩｍｍｕｎｏ１）２０１５，３１（１０
・
论著・
文章编号：１００７— ８７３８（２０１５）１０—１４０４— ０４
果蝇再生蛋白（ｒｇｎ）多克隆抗体的制备及鉴定

家蝇卵黄蛋白基因启动子区的克隆与活性分析

遗传学报　Acta Genetica S inica,J uly2004,31(7):688～694ISSN0379-4172Cl o ni n g a n d Cha ra c t e riz a ti o n of t he Pr o m ot e r Re gi o n ofMus c a Do me s tic a Yol k Pr ot ei n21Ge neXIA Ping2An2,L IU Wei2Quan1,①,J IAN G Yu3,SUN Shao2Guang3,YAN G Shu2Yan3,WAN G Ji2Gui1(11College of Biology,Chi na A gricult ural U niversity,Beiji ng　100094,Chi na;21The College of A ni mal Husbandry and Veteri nary,Henan A gricult ural U niversity,Zhengz hou　450002,Chi na;31Military Veteri nary Instit ute,Quartermaster U niversity of PL A,Changchun　130062,Chi na)Abs t ra ct:A partial Musca dome stica genomic library was constructed.It was consisted of112×105recombinants with insert length ranging from10kb to23kb(15kb average).H igh molecular weight genomic DNA with more than50 kb size was extracted from the larva hatched36h and dige sted with un frequently cutting re striction enzyme BclⅠ.DNA fragments of10～23kb were recovered by agaro se gel electrophore sis and ligated with E MBL3BamHⅠArms CIPase treated.Then the products of ligation were packed in vitro using packing protein.The cloning efficiency of the genomic library was5×104pfu/mL.The genomic library was screened by hybridization using a probe of a768bp partial cDNA fragment of Musca dome stica yolk protein1(mdYP1)gene obtained by PCR and the probe was labeled with Digoxi2 gen.A po sitive plaque was cho sed and purified by in situ hybridization.A genomic DNA fragment about410kb mdYP1 was isolated from purified po sitive plaque by southern blotting analysis.Sequence analysis revealed that mdYP1ge2 nomic gene was compo sed of5′2up stream region about117kb with typical CAAT/T AT A box.The promoter of the mdYP1gene was characterized by examining the ability of5′2up stream fragments to regulate expre ssion of green fluo2 re scent protein(GFP)in Musca dome stica larva.Four fragments of the promoter region,P1(+296/+7),P2(+684/ +7),P3(+1165/+7)and P4(+1616/+7),were obtained by PCR specific amplification using template of recombi2 nantλ2DNA containing mdYP1gene sequence.Then the four fragments were re spectively subcloned into pCMV2GFP re2 porter vector deleted CMV promoter.All the fragments showed no promoter activity when the four recombinant vectors were transfected into Sf9and BHK-21cells re spectively,but three of them,P2,P3and P4,showed significant promoter activity when they were re spectively introduced into Musca dome stica larva by electroporation.The two fragments,P5 (+684/+302)and P6(+1165/+302),obtained by dige sting P2and P3with SpeⅠand H indⅢ,,were also sub2 cloned into p GFP vector,and they showed no promoter activity in Sf9cells,BHK-21cells and Musca dome stica larva.The re sults demonstrated that the core promoter spanned302bp and contained a CCAAT box and a T AT A box u p stream translation initiation codon(ATG),but itself had no transcriptional activity,and that regulatory promoters or enhancers and other cis2elements pre sented from+302to+1616were nece ssary to maintain the specific expre ssion.Ke y w or ds:Musca dome stica;yolk protein gene;promoter;cloning;green fluore scent protein(GFP)收稿日期:2003-05-07;修回日期:2004-02-20基金项目:国家自然科学基金项目(编号:39870552)资助[Supported by Chinese National Natural Science Foundation(No.39870552)]作者简介:夏平安(1964-),男,汉族,副教授,博士,研究方向:动物分子生物学①　通讯作者。

家蝇金属硫蛋白基因的克隆_原核表达及活性检测

昆虫学报Ac t a En to m olog ic a Sinica ,Ap ril 2010,53(4):379-384ISSN 0454 6296基金项目:河北省自然科学基金项目(C2008000596);国家自然科学基金重点项目(30630010)作者简介:张迪,女,1986年生,河北柏乡人,硕士研究生,从事昆虫分子生物学研究,E m ai:l z dw y w 123@163 co m*通讯作者Correspond i ng au t hor ,E m ai:l li ufengs ong @hbu edu cn收稿日期Recei ved :2010 01 15;接受日期Accep t ed :2010 03 29家蝇金属硫蛋白基因的克隆、原核表达及活性检测张迪,任国栋,唐婷,董晓寅,柳峰松*(河北大学生命科学学院,河北保定071002)摘要:金属硫蛋白是一类普遍存在于生物体内、富含半胱氨酸的小分子蛋白,能螯合多种金属离子。

本研究根据EST 序列信息,利用RACE 技术克隆到1条家蝇M usca dom estica 金属硫蛋白基因M d M tn (G enBank 登录号为GU 289398)。

序列分析表明,M d M tn cDNA 全长408bp ,包含1个123bp 的开放阅读框,编码40个氨基酸残基,其中半胱氨酸残基10个,呈 C X C 方式排列。

此蛋白理论分子量为3 8kD,等电点为8 78。

为了解家蝇金属硫蛋白对重金属的结合活性,构建了p ET D s bA M T 表达载体,并转化E scher ichia co li BL 21(DE3)宿主菌进行融合表达。

研究发现MT 重组菌对重金属镉的耐受性得到了明显加强,提示M d M tn 基因可能在家蝇适应重金属环境中起到积极作用。

关键词:家蝇;金属硫蛋白;基因克隆;原核表达;蛋白活性中图分类号:Q966 文献标识码:A 文章编号:0454 6296(2010)04 0379 06C l oni ng ,prokaryotic expression and activity detecti on of them etall othionei n gene i n M usca do m estica (D iptera :M usci dae)Z HANG D,i REN Guo Dong ,TANG T i n g ,DONG X iao Y i n ,LI U Feng Song*(College of L ife Sciences ,H ebe iUn iversity ,Baodi n g ,H ebei 071002,Ch i n a)Abstract :M etallothione i n s (MTs)are lo w m olecular w eigh,t m eta l b i n d i n g and cysteine rich prote i n s f o und in a variety of li v i n g organis m s In th is study ,a 408bp c DNA encod i n g f o r a m etalloth i o ne i n w as cloned fr o m housefly (M usca do m estica )by RACE based on EST i n for m ation and na m ed as MdM t n (GenBank accessi o n no GU 289398) Sequence analysis sho w ed that MdM t n conta i n s a 123bp open read i n g fra m e (ORF)encod i n g a pro tein of 40a m ino acid resi d ues TheM d M tn pepti d e sequence i n cludes 10cystei n e resi d ues w ith a d istri b uti o n pattern o f C X C The predicted m o lecular w e i g ht of encoding pro tein is 3 8kD w ith t h e isoelectric po int (pI)o f 8 78 In order to detect the M d M tn activ ity in binding heavy m etals ,the target gene w as cloned i n to a prokaryo tic expressi o n vector pET D sbA,and then a fusion pro tein w as expressed i n E scherichia coli BL21(DE3) It w as found t h at i n the presence o f CdC l 2,the expressi o n o fM d M tn si g nificantl y increased the bacteria to lerance to Cd 2+,suggesting t h at M d M tn m ay p lay an active ro le in housefly adaption to the envir onm entw it h heavy m etalsK ey w ords :M usca do m estica ;m eta lloth i o ne i n ;gene cloning ;pr okaryotic expression ;protein activity 金属硫蛋白(m eta lloth i o ne i n ,MT )是一类广泛存在于生物体内的低分子量、富含半胱氨酸的金属结合蛋白。

一种大量提取家蝇幼虫基因组DNA的新方法

去除蛋白质后$ 用乙醇或异丙醇沉淀即得基因组 345 )
’ ’ 加入等体积的氯仿 % 异戊醇 & !# % 9 ’ . 颠倒混匀后 $ 9" """HFA 室温离心 9" AI* ) R ’ 吸取上清 $ 加入 "@R 倍体积的异丙醇 $ ?!" " 放置 9 S 左右后 9" """HFA 离心 9’ AI* ) ( ’ 用 (" # 的乙醇洗涤沉淀 ! 次 ) 待乙醇完全挥发
9 ’ 取适量 345 参照文献 8’: 进行 "@& # 琼脂糖凝胶电泳 $ 紫外分析仪上检测所提基因组 345 的完整性 ) ! ’ 在 NO?O)P?4)6 紫外可见分光光度计上测量所得 345 在 !$" *A + !R" *A 和 !&" *A 处的吸收值 $ 计算其纯度和产率 & 345 浓度 2 !Q=AC7 & U3!R"’ ’" ( 稀释倍
干净后加入 9@’ AC TTG!U 充分溶解沉淀 ) !"%"# 所得 345 的质量检测
! 材料和方法 !"! 材料家蝇幼虫由本实验室饲养至 $ 日龄时收集洗净后于 ?!" " 保存备用 ) !"# 实验试剂裂解缓冲液 >!#;<50$9@# AB-=C4D;-$ !" AAB-=CE3<52FG&@"7 $9"" AAB-=C <HIJ?G;-2FG&@"7 ’! <HIJ 饱和酚 % 氯仿 % 异戊醇 &!’%!#%9 ’! 氯仿 % 异戊醇 &!#%9 ’! 异丙醇 !("# 乙醇 ) !"$ 仪器 3KK ?! 型稳压稳流电泳仪 ! 3K;L ?$$0 型水平电泳槽 ! M3 ?%#"$0 型紫外分析仪 ! NO ?O)P ? 4)6 紫外可见分光光度计 $ 均购自北京六一仪器厂 )

一种新的多肽-myb蛋白9和编码这种多肽的多核苷酸[发明专利]

专利名称：一种新的多肽－myb蛋白9和编码这种多肽的多核苷酸
专利类型：发明专利
发明人：毛裕民,谢毅
申请号：CN99125675.1
申请日：19991222
公开号：CN1300754A
公开日：
20010627
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种新的多肽－myb蛋白9,编码此多肽的多核苷酸和经DNA重组技术产生这种多肽的方法。

本发明还公开了此多肽用于治疗多种疾病的方法,如恶性肿瘤,血液病,HIV感染和免疫性疾病和各类炎症等。

本发明还公开了抗此多肽的拮抗剂及其治疗作用。

本发明还公开了编码这种新的myb蛋白9的多核苷酸的用途。

申请人：上海博德基因开发有限公司
地址：200092 上海市中山北二路1111号3号楼12层蒋静非
国籍：CN
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家蝇抗药性的分子遗传机制

家蝇抗药性的分子遗传机制李梅;何凤琴;邱星辉【期刊名称】《寄生虫与医学昆虫学报》【年(卷),期】2005(012)004【摘要】综述了近年来家蝇抗药性分子机制的研究进展.脂族酯酶基因(MdaE7)在位置137(Gly)和251(Trp)的氨基酸突变可能与家蝇对有机磷抗性有关;谷胱苷肽-S-转移酶(GSTs)超量表达在家蝇对有机磷农药的抗性中起重要作用;有机磷抗性家蝇的AChE基因普遍存在Gly262Ala和Phe327Tyr突变.击倒抗性(kdr)和P450介导的代谢抗性是家蝇对DDT和拟除虫菊酯类杀虫剂抗性的重要机制,电压门控钠离子通道的L1041F突变产生Kdr,而M918T和L1041F双突变导致超击倒抗性(super-kdr);P450介导的代谢抗性表现出进化可塑性的特点.有关家蝇抗性机制的阐明,可为抗性的检测和监测提供准确和方便的手段.【总页数】7页(P238-244)【作者】李梅;何凤琴;邱星辉【作者单位】中国科学院动物研究所,农业虫害鼠害综合治理研究国家重点实验室,北京,100080;中国科学院动物研究所,农业虫害鼠害综合治理研究国家重点实验室,北京,100080;中国科学院动物研究所,农业虫害鼠害综合治理研究国家重点实验室,北京,100080【正文语种】中文【中图分类】Q96【相关文献】1.家蝇抗药性的分子机制:乙酰胆碱酯酶介导的抗药性 [J], 邱星辉2.恶性疟原虫抗药性的分子遗传学机制 [J], Well.,TE;向选东3.家蝇拟除虫菊酯抗药性的分子生物学监测 [J], 江毅民;黄炯烈;吴瑜4.家蝇对高效氯氰菊酯抗药性机制的探索 [J], 胡文涛5.害虫抗药性进化的遗传起源与分子机制 [J], 何月平;沈晋良因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

果蝇血液发育标记基因mrj的多克隆抗体制备及检测

果蝇血液发育标记基因mrj的多克隆抗体制备及检测雷旻音;杨哲;黄婷;刘丹;李永青;吴秀山【摘要】mrj是黑腹果蝇中一个蛋白编码基因.根据已报道的mrj基因序列,利用生物信息学分析选取果蝇mrj 基因抗原亲水区,通过PCR扩增出其部分编码区序列,将其连接到pET-28a原核表达载体上.经酶切及测序鉴定质粒构建成功后,将重组质粒(pET-28a-mrj)转入Rosetta菌后通过IPTG(Isopropylβ-D-thiogalactoside)诱导表达出带His标签的重组融合蛋白后用镍柱纯化.将纯化的蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western Blot检测抗体的效价和特异性.%Mrj is a protein coding gene from Drosophila. Hydrophilic and well specific fragment of mrj is selected by bioinformatics method. Then it was amplified the fragment by PCR and cloned into the expression vector pET-28a to acquire the recombinant expression plasmid pET-28a-77ir/. It was transformed into Escherichia coli Rosetta, and the fusion protein with His tag was induced with IPTG. The fusion protein was purified by nickel che-lating resin. His-mrj fusion protein was used to immune the New Zealand white rabbits, then identified the antibody by Western blot.【期刊名称】《湖南师范大学自然科学学报》【年(卷),期】2012(035)004【总页数】4页(P55-58)【关键词】mrj基因;果蝇;多克隆抗体【作者】雷旻音;杨哲;黄婷;刘丹;李永青;吴秀山【作者单位】湖南师范大学蛋白质化学及鱼类发育生物学教育部重点实验室,心脏发育研究中心,中国长沙410081;湖南师范大学蛋白质化学及鱼类发育生物学教育部重点实验室,心脏发育研究中心,中国长沙410081;湖南师范大学蛋白质化学及鱼类发育生物学教育部重点实验室,心脏发育研究中心,中国长沙410081;湖南师范大学蛋白质化学及鱼类发育生物学教育部重点实验室,心脏发育研究中心,中国长沙410081;湖南师范大学蛋白质化学及鱼类发育生物学教育部重点实验室,心脏发育研究中心,中国长沙410081;湖南师范大学蛋白质化学及鱼类发育生物学教育部重点实验室,心脏发育研究中心,中国长沙410081【正文语种】中文【中图分类】Q78mrj位于果蝇2号染色体右臂,全长18 474 bp,在其2-61个氨基酸处含有一个Dnaj的结构域.Dnaj包括两个结构域:N末端是与DnaK相互作用结构域,C末端是底物结合结构域.识别底物多肽的共有基序中间是4～5个疏水氨基酸残基的核心,两侧是酸性氨基酸残基[1].在蛋白质氨基酸顺序中每有36个氨基酸残基就有一个这样的基序,这种基序常常存在于β片层中.由该结构域表明该基因编码蛋白具有热休克及可稳定蛋白前体的非折叠构象的分子功能.有文献表明mrj和NFAT3c和srp在同一信号通路,NFAT3c突变可导致暂时性缺氧[2],而srp是果蝇血液的标志基因,因此作者推测mrj可能在果蝇血液的发育过程中起作用,因此mrj多克隆抗体的制备可用于果蝇血液发育信号通路的分析.另外有文献表明在果蝇体内mrj基因发生突变后,会影响果蝇细胞间的粘连[3].因此mrj基因的原核表达分析及其多克隆抗体的制备具有一定的研究意义和应用价值[4-5].1 材料与方法1.1 实验试剂及材料大肠杆菌Rosetta菌种,PET-28a载体菌种以及E.coli DH5α菌种为本实验室保种；pMD18-T载体和连接酶购自大连宝生物公司;10×Loading buffer, Taq DNA聚合酶,限制性内切酶NcoⅠ和SacⅠ购自深圳晶美公司；RNase购自Sangon公司；UNIQ-10柱式DNA 胶回收纯化试剂盒、蛋白胨、酵母提取物、甲叉双丙烯酰胺、IPTG(异丙基-в-D-硫代半乳糖苷)丙烯酰胺、氯化钠、过硫酸铵、等购自上海生工公司；质粒提取试剂盒(离心柱型)购自OMEGA；柱式DNA胶回收试剂盒购自TIANGEN；Glutathione SepharoseTM 4B,购自Amersham Biotech公司;弗氏完全佐剂、不完全佐剂购自Sigma公司.1.2 引物设计与合成利用 Peptide antigen finder软件筛选出mrj DNA序列的亲水区域,然后用Primer Premier 5.0软件设计:mrj正义引物(sense):5′CGCGTCGACCATGGTTGACTAC3′(划线部分为NcoⅠ酶切位点)；反义引物(Anti-sense)5′CGCCTCGAGCTATTGAAGGGAG3′(划线部分为SacⅠ酶切位点),引物由上海生工公司合成.1.3 基因扩增及克隆收集野生型果蝇约30只,置于液氮中30 min,接着用Trizol法提取总RNA,通过反转录得到果蝇cDNA,并以之为模板进行PCR扩增(反应条件为:95 ℃变性5 min；95 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min 30 s,28个循环；72 ℃延伸8 min).将含有780 bp目的片段的PCR产物纯化回收后,连接至pMD18-T载体,转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中,通过NcoⅠ和SacⅠ双酶切检测后,筛选出阳性单克隆,选择一个阳性克隆送至上海生工公司进行测序分析,将测序正确的pMD18-T-mrj重组质粒上的目的DNA片段用限制性内切酶NcoⅠ和SacⅠ切下,纯化回收后连入pET-28a载体,转入Rosetta感受态细胞中,提取质粒经NcoⅠ和SacⅠ双酶切验证后得到重组表达质粒pET-28a-mrj.1.4 mrj融合蛋白的诱导表达将构建好的重组质粒pET-28a-mrj用热激法转入大肠杆菌菌株Rosetta,LB培养基(含100 mg/L 氯霉素,卡那霉素)37 ℃培养,转接扩大培养至OD600约为0.6,按0.1 mmol/L 加入IPTG, 25 ℃诱导,2、4、5、6 h各取1 mL菌液,确定最佳诱导时间[6].1.5 mrj融合蛋白亲和纯化通过各时段取样比较,选择在IPTG浓度为0.1 mmol/L,诱导时长5 h的条件下进行大量诱导.离心收集菌体,PBS 重悬细胞后超声裂解细胞至菌液清亮,接着12 000r/min离心 10 min,收集上清. 4 ℃下与经Binding Buffer漂洗活化后的Ni-IDA 凝胶柱结合,用Washing Buffer洗去杂蛋白,再用Elution Buffer洗脱目的蛋白,获得纯化的His-mrj融合蛋白,-80 ℃保存备用[7].1.6 mrj多克隆抗体的制备将纯化得到的His-mrj蛋白质冻干,取1 mg 抗原蛋白溶于0.5 mL 生理盐水中,按体积比1∶1 与弗氏完全佐剂(Sigma 公司)在注射器中推成乳剂,对2 月龄雄性新西兰大白兔进行背部皮下免疫注射,分散10～20 个点；在第14天、第21天、第28天再将溶于0.5 mL 生理盐水中的0.5 mg 抗原蛋白与弗氏不完全佐剂(Sigma 公司)按体积比1∶1 在注射器中推成乳剂,进行背部皮下多点注射.第35天颈主动脉取血.兔血放在4 ℃冰箱静置过夜后,以3 000 r/min离心10 min,取血清分装保存于-80 ℃.1.7 mrj多克隆抗体的检测收获免疫兔血清,用果蝇心脏组织蛋白进行mrj抗体的效价测定,设置抗体稀释浓度分别为1∶500,1∶1 000,1∶2 000,1∶3 000.同等条件下,用免疫前兔血清进行Western blot分析作为对照.2 结果2.1 mrj基因克隆至表达载体A: NcoⅠ/Sac Ⅰ双酶切结果;B: pET-28a-mrj质粒示意图图1 双酶切鉴定及pET-28a-mrj质粒示意图将mrj基因部分编码序列连入pMD-18-T载体中,再用限制性内切酶NcoⅠ和SacⅠ双酶切pMD18-T-mrj,将得到的mrj基因目的片段连入pET-28a,并转入大肠杆菌DH5α,经NcoⅠ和SacⅠ双酶切鉴定(如图1:A)及测序分析,结果显示已成功构建了pET-28a-mrj(如图1:B).2.1 mrj融合蛋白诱导表达及纯化将重组质粒pET-28a-mrj转入Rosetta菌株,以不同浓度IPTG(0、0.1、0.2、0.4 mmol/L)25 ℃下进行诱导,取IPTG浓度为0.1 mmol/L诱导2,4,5,6 h,IPTG浓度为0.2 mmol/L诱导2,4,6 h的菌液各1 mL进行检测,可见一条相对分子质量约为33 000大小的特异条带,与预期的mrj融合蛋白相对分子质量一致(如图2)[8-9].2.2 mrj融合蛋白的表达及纯化通过对比,最终选择在诱导温度25 ℃,IPTG浓度为0.1 mmol/L,诱导时长5 h的条件下大量诱导得到可溶蛋白.并将诱导所得融合蛋白经Ni-IDA凝胶柱亲和纯化,通过免疫印记及考马斯亮蓝染色后显示目的条带纯度较高,可进行蛋白免疫(如图3). M:Marker0671；1:pET-28a-mrj未诱导蛋白表达；2:0.1 mmol/L IPTG 诱导pET-28a-mrj 2 h时蛋白表达；3:0.1 mmol/L IPTG 诱导pET-28a-mrj 4 h时蛋白表达；4:0.1 mmol/L IPTG 诱导pET-28a-mrj 5 h时蛋白表达；5:0.1 mmol/L IPTG 诱导pET-28a-mrj 6 h时蛋白表达；6:0.2 mmol/L IPTG 诱导pET-28a-mrj 2 h时蛋白表达；7:0.2 mmol/L IPTG 诱导pET-28a-mrj 4 h时蛋白表达；8:0.2 mmol/L IPTG 诱导pET-28a-mrj 6 h时蛋白表达.图2 pET-28a-mrj诱导表达图图3 融合蛋白His-mrj的纯化图2.3 mrj多克隆抗体Western Blot鉴定用pET-28a-mrj转化Rosetta菌株诱导表达的总蛋白对所制备的mrj多克隆抗体的特异性进行Western blot检测,将制备的多克隆抗体按浓度梯度稀释(1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶3 000)作为一抗进行检测,并用空白血清作为阴性对照,可见His-mrj蛋白所处位置有一条特异性的杂交带出现(如图4),检测结果表明该抗体的特异性和敏感性均可达到今后实验需要[10].2.4 mrj多克隆抗体有效性的鉴定用RNAi干扰品系,利用western blot鉴定所制备mrj多克隆抗体的有效性.将制备的mrj多克隆抗体按照1∶2 000的浓度比稀释作为一抗,用野生型果蝇胚胎作阴性对照[11](如图5).图4 mrj多克隆抗体Western-blotting鉴定图5 mrj多克隆抗体有效性的鉴定3 讨论真核细胞的密码子和原核系统的不同,因此,在用原核系统表达真核基因的时候,真核基因中的一些密码子对于原核细胞来说可能是稀有密码子,从而导致表达效率和表达水平很低.本实验所用宿主菌株为Rosetta菌株，因为相比较BL21菌株,Rosetta 是携带pRARE2质粒的BL21衍生菌,能补充大肠杆菌缺乏的7种稀有密码子(AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA 及CGG)对应的 tRNA,可提高外源基因、尤其是真核基因在原核系统中的表达水平.另外,Rosetta还能够促进二硫键的形成,帮助表达需要借助二硫键形成正确折叠构象的真核蛋白.本实验所用免疫动物为2月龄雄性新西兰大白兔,因为雌性动物特别是妊娠动物用于制备免疫有时不产生抗体.由于对免疫应答存在个别差异,免疫时应同时选用数只动物进行免疫. 抗原的免疫剂量依照给予动物的种类、免疫周期以及所要求的抗体特性等不同而不同.剂量过低,不能引起足够强的免疫刺激；免疫剂量过多,有可能引起免疫耐受.在一定的范围内,抗体的效价随注射剂量的增加而增高.蛋白质抗原的免疫剂量比多糖类抗原高. 免疫剂量与注射途径有关.通常,静脉注射剂量大于皮下注射,而皮下注射又比掌内和跖内皮下注射剂量大,也可采用淋巴结内注射法.加佐剂比不加佐剂的注射剂量小.如要制备高度特异性的抗血清,可选用低剂量抗原短程免疫法.如需要获得高效价的抗血清,宜采用大剂量长程免疫法.免疫周期长者,可少量多次；免疫周期短者,应大量少次. 两次注射的间隔时间应长短适宜,太短起不到再次反应的效果,太长则失去了前一次激发的敏感作用.一般间隔时间应为5～7 d,加佐剂者应为2周左右.虽然用纯化蛋白检测所制备多克隆抗体的效价时在一定程度上验证了干抗体的有效性,但western-blot实验时所用蛋白一般为果蝇胚胎提取的全蛋白,此时,若所制备的抗体特异性不强,实验中非目的条带过多会严重影响实验的准确性.mrj是果蝇发育中一个关键的标志基因[12],我们所熟知的是它可与尿激酶受体共同作用增强细胞间的粘连[13].但有文献表明它很可能与果蝇的血液发育相关,因此mrj多克隆抗体在今后的实验中还可用做体内CO-ip实验,寻找在体内与其有相互作用的蛋白,或干扰其所在信号通路的其他蛋白,将该多克隆抗体用作胚胎抗体染色,或western-blot等实验.参考文献:[1] MITRA A, MENEZES M E, SHEVDE L A, et al. DNAJB6 induces degradation of beta-catenin and causes partial reversal of mesenchymal phenotype[J].J Biol Chem, 2010,285(32):24686-24694.[2] WATSON E D, HUGHES M, SIMMONS D G, et al. Cell-cell adhesion defects in Mrj mutant trophoblast cells are associated with failure to pattern the chorion during early placental development[J]. Dev Dyn,2011,240(11):2505-2519.[3] NANDURI J, YUAN G, KUMAR G K, et al. 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Argonaute系列蛋白多克隆抗体制备和鉴定及组织定位

Argonaute系列蛋白多克隆抗体制备和鉴定及组织定位卢峪霞;黄志刚;陈锡美;郜恒骏;胡莺;张小燕【期刊名称】《同济大学学报（医学版）》【年(卷),期】2009(030)001【摘要】目的制备一系列Argonaute(简称AGO)蛋白多克隆抗体,并鉴定其特异性,应用组织芯片初步探讨其在人类组织中的分布.方法合成特异性AGO多肽,以马来酰胺活化匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)作为载体构建多肽免疫原,通过致敏大白兔,制备系列兔抗人AGO多克隆抗体,然后用亲和层析法纯化抗体.用ELISA和western方法进行抗体验证,并应用人组织芯片进行AGO的免疫组化研究.结果通过构建系列AGO多肽-KLH载体复合物致敏大白兔,成功制备了3个兔抗人AGO蛋白多克隆抗体,经ELISA及Western blot证实兔抗人AGO抗体可特异性识别AGO多肽,在人组织芯片中通过免疫组化染色显示该抗体在部分肿瘤组织上皮来源细胞胞浆中呈阳性染色.结论本项研究成功制备系列兔抗人AGO 多克隆抗体,为进一步研究AGO在miRNA/RNAi通路中的作用及在人类疾病中的意义提供了有利工具.【总页数】5页(P23-26,31)【作者】卢峪霞;黄志刚;陈锡美;郜恒骏;胡莺;张小燕【作者单位】同济大学附属同济医院消化内科,上海,200065;同济大学附属同济医院消化内科,上海,200065;同济大学附属同济医院消化内科,上海,200065;同济大学附属同济医院消化内科,上海,200065;生物芯片上海国家工程研究中心,上海,201203;生物芯片上海国家工程研究中心,上海,201203;生物芯片上海国家工程研究中心,上海,201203【正文语种】中文【中图分类】R34【相关文献】1.PIWIL系列蛋白多克隆抗体制备、鉴定及组织分布 [J], 卢峪霞;黄志刚;陈锡美;郜恒骏;胡莺;张小燕;孟逊2.人Argonaute2蛋白多克隆抗体制备及初步应用 [J], 李海芳;浦永;汤石明;强冉;汤华3.人Argonaute3蛋白:多克隆抗体制备、鉴定及组织芯片检测其在各种癌组织中的表达 [J], 黄志刚;郜恒骏;陈锡美;胡莺;张小燕;孟逊4.一组miRNA/RNAi通路中关键蛋白-Argonaute系列多克隆抗体制备、鉴定及组织定位初步研究 [J], 王韶英;陈锡美;黄志刚;郜恒骏;胡莺;张小燕;孟逊5.水稻Argonaute 2蛋白的原核表达与多克隆抗体制备 [J], 程小玲;杨加伟因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

昆虫基因克隆实验报告

一、实验目的1. 学习昆虫基因克隆的基本原理和方法；2. 掌握昆虫基因提取、PCR扩增、克隆、测序等实验技术；3. 了解昆虫基因在生物学研究中的应用。

二、实验原理昆虫基因克隆是指将昆虫体内的基因片段提取出来，并通过分子生物学手段将其克隆到载体上，从而在体外进行表达、研究等操作。

实验过程中主要包括以下步骤：1. 基因提取：从昆虫组织中提取DNA；2. PCR扩增：利用PCR技术扩增目标基因片段；3. 克隆：将扩增得到的基因片段克隆到载体上；4. 序列分析：对克隆的基因进行测序，分析其序列特征。

三、实验材料1. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、核酸分析仪等；2. 实验试剂：DNA提取试剂盒、PCR试剂盒、克隆载体、限制性内切酶、DNA连接酶、Taq酶、质粒提取试剂盒、DNA测序试剂盒等；3. 实验材料：昆虫样品、细菌菌株等。

四、实验步骤1. 基因提取（1）将昆虫样品置于液氮中冷冻，然后研磨成粉末；（2）按照DNA提取试剂盒说明书进行操作，提取昆虫DNA。

2. PCR扩增（1）设计特异性引物，针对目标基因序列；（2）按照PCR试剂盒说明书进行PCR反应，扩增目标基因片段。

3. 克隆（1）将PCR产物与克隆载体进行连接；（2）将连接产物转化到感受态细胞中；（3）在含抗生素的培养基中筛选阳性克隆。

4. 序列分析（1）提取阳性克隆的质粒；（2）按照DNA测序试剂盒说明书进行测序；（3）对测序结果进行比对和分析。

五、实验结果1. 成功提取到昆虫DNA；2. PCR扩增得到目标基因片段；3. 克隆得到阳性克隆；4. 对阳性克隆进行测序，获得目标基因序列。

六、实验讨论1. 基因提取过程中，选择合适的昆虫样品和提取方法至关重要，以保证DNA的质量和数量；2. PCR扩增过程中，引物设计、反应条件等因素对扩增结果有较大影响，需要根据实际情况进行调整；3. 克隆过程中，载体选择、转化方法等对克隆成功率有影响，需要根据实验需求选择合适的载体和转化方法；4. 序列分析过程中，比对和分析方法的选择对结果解读有较大影响，需要结合实验目的和序列特征进行选择。

大头金蝇β-actin基因克隆与多克隆抗体制备

大头金蝇β-actin基因克隆与多克隆抗体制备张敏;张古忍【期刊名称】《环境昆虫学报》【年(卷),期】2018(040)001【摘要】To further study the expression and regulation of key functional genes of Chrysomya megacephala (Fabricius),the full-length cDNA (GenBank accession number KC207081) sequence ofβ-actin was cloned by RT-PCR and RACE,and bioinformatics analysis of this sequence was also performed.The full-length of β-actin cDNA was 1 355 bp,which contained a 1 131 bp open reading frame (ORF) encoding 376 amino acids.The length of 5'UTR was 87 bp and the 3'UTR was about 110 bp.The ORF encodes an actin with a molecular weight of 41.8 kD and an isoelectric point of5.286.The amino acid sequence is 97％-99％identical to other insect β-actins and contains a conserved fingerprint with 6 unique motifs belonged to β-actin protein families.According to the prediction of the hydrophilicity,antigenicity and surface accessibility of the β-actin amino acid sequence,the β-actin antigen peptide (Cys-GPYARVKRHQKGLKT) was designed and synthesized,and the polyclonal antibody,with an immunological potency value more than 1 ∶ 64 000,was obtained by immunizing New Zealand rabbits.Western Blot technology was then used to detect the expression of β-actin in developmental stages ofC.megacephala,the results showed that the expressio n of β-actin wasconstant,which is in line with expectations.Our researches provide the solid foundation for further study of functional genes in C.megacephala.%为深入研究大头金蝇Chrysomya megacephala (Fabricius)关键功能基因的表达调控,运用RT-PCR和RACE技术,克隆获得大头金蝇β-actin基因cDNA全长序列(GenBank登录号为KC207081),并对其进行生物信息学分析.大头金蝇β-actin基因cDNA全长1 355 bp,其中开放阅读框(ORF)为1 131 bp,编码376个氨基酸,5'UTR长度为87 bp,3'UTR约为110 bp.ORF编码的蛋白质分子量为41.8 kD,等电点5.286,氨基酸序列与其他昆虫β-actin一致性高达97％-99％,且含有由6个β-actin蛋白家族特有的保守模式(motif)所构成的指纹.根据对β-actin氨基酸序列的亲水性、抗原性和表面可及性分析预测,设计并合成β-actin抗原多肽(Cys-GPYARVKRHQKGLKT),免疫新西兰兔获得多克隆抗体,其效价远高于1∶64 000.采用Western Blot技术检测大头金蝇各发育阶段的β-actin蛋白表达,结果表明β-actin表达恒定.本文的研究结果为大头金蝇功能基因的深入研究提供了坚实的基础.【总页数】7页(P180-186)【作者】张敏;张古忍【作者单位】南华大学生物化学与分子生物学教研室,湖南衡阳421001;中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室,广州510275;中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室,广州510275【正文语种】中文【中图分类】Q963;S43【相关文献】1.金纹细蛾β-actin基因克隆及表达分析 [J], 郭长宁;李鑫;于建光;侯茜2.棉铃虫β-actin基因的克隆、表达及多克隆抗体制备 [J], 黄丽娜;程婷婷;王新绘;魏原杰;赵洁;李金耀;刘小宁3.大头金蝇酰基辅酶A△9去饱和酶cDNA克隆与原核表达 [J], 张敏;张古忍4.基于转录组的大头金蝇密码子的偏好性分析 [J], 张玉波;周正湘;吴小玉;张斌5.大头金蝇卵不同发育时间形态变化及基因表达差异研究 [J], 夏冰;刘玉铭;王启燕;张红玲;王杰;戴佳琳;黄江因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。