基因克隆与表达ppt课件

• 多种酶进行酶切时，先低盐后高盐缓冲 液；
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1、连接
连接、转化与重组子鉴定
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（2）. 连接条件
（1）必须是两条双链DNA。 （2）DNA 3’ 端有游离的-OH，
5’端有一个磷酸基团（P）。 （3）需要能量
动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中： NAD+
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2）连接温度：
连接效果最好在37 ℃，但形成的互补 不稳定; 最佳连接温度：12-16 ℃，较好的连 接效果，互补又较稳定;
3）反应液中的成分：
ATP：反复冻熔，ATP活性降低，ATP溶解 度不高，连接缓冲液宜分装； 单价离子：150-200mM NaCl，提高连接效果； PEG：5%以下可以提高连接效率
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4）插入片段与载体的浓度比例
载体DNA与外源DNA的分子摩尔比通
常为1﹕3左右，甚至1﹕10 或更高。
目的或作用：
发热快胶溶解 种类：
TAE （Tris+EDTA+醋酸）:电流大，易产生离子富集 TBE （Tris+ EDTA+硼酸）:缓冲能力最强 TPE （Tris+ EDTA+磷酸）:缓冲能力低 TNE （Tris+ EDTA+醋酸钠）
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pET表达载体
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• pET表达载体的启动子是T7噬菌体基因10启动子（T7启动 子），需要T7RNA聚合酶才能转录。
质粒具有自主复制 和转录能力，能在子 代细胞中保持恒定的 拷贝数，并表达所携 带的遗传信息。
基因组DNA
质粒DNA
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ⅰ质粒DNA提取方法： 碱裂解法、煮沸法、 SDS法等
ⅱ 碱裂解法原理：
在碱性条件下，双连DNA氢键断裂， 结构破坏变性，环状超螺旋质粒不充分 变性。在中性条件下变性质粒恢复原来 构型，而线性大分子细菌DNA不能复性呈 不溶物而经离心除去。
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ⅲ 抽提出质粒的构型：
1）超螺旋质粒DNA:在提取质粒过程中， 超螺旋DNA占大部分。
2）开环质粒DNA：如果质粒DNA两条链中 有一条链发生一处或多处断裂，分子就能 旋转而消除链的张力，形成松驰型的环状 分子，称开环DNA。
3）线状质粒DNA：如果质粒DNA的两条链在 同一处断裂，则形成线状DNA。
转化方法：电击法高于化学法。
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3、转化子的筛选和鉴定
限制性酶切图谱法
Pvu I Pst I
EcoR I
Cla I
Pst I
Hind III
BamH I
Apr
Tcr
pBR322
Sal I
4363 bp
ROI
ori
ROP
Bal I
Hind II
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质粒DNA的提取
质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传 因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环 的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细 胞中。
增加插入片段与载体的接触机会，减 少载体自我连接的现象。
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2、转化
化学法（CaCl2法)： 转化原理：是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下 形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作 用，使细胞膜出现空隙，质粒或DNA重组分 子便可进入细胞内（感受态细胞）。
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影响转化率的主要影响因素:
载体本身的性质及其空间构象：超螺 旋构象转化率最高； 插入片段的大小：插入片段越大，转 化效率越低； 受体细胞的类型及预处理；
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抽提出的质粒三种构型 电泳结果：
1）开 环 2）线 状 3）超螺旋
-
电 泳 方 向
+
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凝胶电泳技术
电泳目的：对核酸分子进行分离和检测
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凝胶浓度:
浓度大，筛孔小，适合小分子电泳；
浓度小，筛孔大，适合大分子电泳
♦ 凝胶分辨DNA的能力：
琼脂糖
浓度 分辨范围(kb)
0.3%
5-60
0.6%
蛋白原核表达
卫文强 2015.112
目的基因-T
表达载体
酶切， 胶回收，连接
转化到克隆用细胞（Top10)
提质粒，酶切验证
转化到表达用细胞（BL21（DE3)）
诱导表达
SDS-PAGE
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影响限制性内切酶活性的因素
1）. DNA的纯度 DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙 醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。
株，一段含有 lacI、lacUV5 启
动子和 T7 RNA 聚合酶基因的 DNA 片段被插入其 int 基因中
用噬菌体 DE3 的溶源菌作为表 达载体的宿主菌，调控方式为 化学诱导型，类似于 Lac 表达 系统。
E.Coli （DE3）
T7 启动子
目的基因
IPTG 诱导
T7 RNA 聚合酶
lac 启动子 T7 RNA 聚合酶基因
MgCl2、NaCl/KCl： 提供Mg2+和离子强度；
Tris-HCl：
维持pH；
二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性；
牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定；
β－巯基乙醇：保持酶的稳定性，防止酶失活。
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使用时注意事项：
• 用时在冰上操作；
关心小 贴士告
诉你
• 取酶用干燥、灭菌、新的枪头
• 酶用量不能超过酶切总体积的10%；
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菌株种类
BL21 :lon, ompT BL21(DE3) : T7 polymerase Rosetta: optimal codons Origami : thioredoxin reductase (trxB) , glutathione
1-20
0.7%
0.8-10
0.9%
0.5-7
1.2%
0.4-6
1.5%
0.2-3
聚丙烯酰胺凝胶
浓度 分辨范围(bp)
3.5 100wenku.baidu.com-2000
5
90-500
8.0 60-400
12
40-200
15
25-160
20
6-100
凝胶浓度的选择：取决于待检测的DNA的大小
原来如 此！
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电泳缓冲液
pH值：偏碱性，带负电荷 离子浓度：离子浓度高 电流大
• T7RNA聚合酶转录机制十分有效并具有选择性：充分诱导 时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；在非诱导 条件下，几乎可以使目的基因完全处于沉默而不转录。
• T7RNA聚合酶基因插入由大肠杆菌lacUV5启动子控制、 λDE3溶原状态下的大肠杆菌染色体上。
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T7 表达系统
转录调控的机理 化学诱导型 噬菌体 DE3 是 l 噬菌体的衍生
2）. DNA的甲基化程度
dam甲基化酶（修饰GATC中的A）； dcm甲基化酶（修饰CCA/TGG的C）。
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3）. 温度
不同的限制性内切酶的最适反应温度不 同。大多数是37 oC，少数要求40-65 oC。
4）. 缓冲液(Buffer)
是影响限制酶活性的重要因素。 商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。